CN102160867B - 黄芪皂苷ⅱ在制备抗肝癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中药有效成分提取及应用技术领域。本发明提供的黄芩皂苷Ⅱ在不同浓度时对两种人肝癌细胞株BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的增殖具有明显抑制作用，可与其他药物同时给药或序贯给药发挥抗肿瘤作用。本发明提供了量效关系明确、结构组分确证的抗肿瘤药物，为临床抗肿瘤新药的开发奠定了基础；提供了逆转多药耐药发挥抗肿瘤作用的药物，为解决化疗药物多药耐药现象提供了新方案。

Description

黄芪皂苷Ⅱ在制备抗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药有效成分提取及应用技术领域。具体涉及黄芪皂苷Ⅱ在制备抗肝癌药物中的应用。 

背景技术

正常机体中细胞凋亡和细胞增殖总是在严密调控下维持动态平衡，该平衡一旦被打破，将导致许多疾病的发生，由于细胞凋亡功能下降，突变细胞不能被有效地清除，不断堆积形成肿瘤。能诱导凋亡的药物在肿瘤治疗中发挥重要的作用。 

多药耐药(Mtltidrug Resistance，MDR)是肿瘤细胞由一种药物诱发后，同时对多种结构和功能不同的化疗药物产生交叉耐药的相象。肿瘤MDR的机制异常复杂，是多基因、多步骤综合作用的结果。除了主要与多药耐药基因(mtltidrug resistance gene，mdr1)及其编码产物P-糖蛋白(P-glyco-protein，P-gp)所介导的经典机制外，还与凋亡相关基因(如Bcl-2，Ras，P53)等介导的非经典机制密切相关。多药耐药性目前已经成为临床肿瘤化疗失败的主要原因，如何解决这一问题是目前抗肿瘤研究的热点，其中寻找多药耐药性逆转剂或化疗增敏剂(chemosensitizer，CS)是解决MDR问题的有效手段之一。 

黄芪是常用的补益类中药，具有补气升阳，益卫固表等功效，临床常用剂型有黄芪注射液，黄芪粗制剂或以黄芪为主的复方。李伟等报道黄芪注射液具有抗心肌缺血及心肌保护作用(黄芪皂苷注射液对心得安诱发心衰犬心脏舒缩功能的影响，中国实验方剂学杂志，2009年12期81-83页)，另外还有报道称其对肾脏、肺有保护作用及抗贫血作用。近年来发现黄芪注射液和参附注射液联合使用有减少化疗药物毒副作用的发生、提高机体免疫功能、提高患者的生存质量的作用(参附注射液联合黄芪注射液对恶性肿瘤化疗毒副作用的影响，山东医药，2009年第8期，89-90页)，刘成军等报道了黄芪注射液对人鼻咽癌CNE2荷瘤裸鼠移植瘤具有抑制作用，其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤组织中p53和Bcl-2蛋白的表达有关(黄芪注射液对人鼻咽癌CNE2荷瘤裸鼠移植瘤具有抑制作用，中草药，2010年第6期，968-970页)。另外，还有谢少茹等报道了黄芪多糖对胃癌细胞的抑制作用及其机制(河北中医，2009年第9期，第137-144页)。我们在前期研究中发现黄芪总苷对小鼠肝癌(HepA)与肉瘤(S180)具有抑瘤作用，并且体外抑制肝癌Hela细胞的生长。 

以上报道多数采用联合治疗的方式，即使单独使用黄芪注射液、黄芪多糖或黄芪总皂苷进行研究，也因为其成分复杂(黄芪注射液含有多糖类、皂苷类、黄酮类和氨基酸类等成分)、量效关系不明确等原因，均未能指出是何种具体成分发挥了上述治疗作用。关于其中单体化合物的作用，尤其是关于黄芪皂苷类单体的抗肿瘤作用研究仍未见任何报道。关于黄芪皂苷Ⅱ，亦没有报道公布其具有上述作用，也未见将其制成抗肿瘤制剂的报道。 

另外，黄芪总皂苷或者黄芪注射液也由于成分复杂，导致难以对其质量和稳定性进行控制，使其满足现代用药要求。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术不足，提供结构组分确证、量效关系确切的抗肿瘤药物，尤其是用于提供逆转多药耐药而发挥抗肿瘤作用的药物。 

为此，本发明提供如下技术解决方案。 

黄芪皂苷Ⅱ在制备抗肿瘤药物中的应用。黄芪皂苷(Astragaloside，AS)Ⅱ的结构如下： 

所述肿瘤为肝癌。肝癌是我国高发的恶性肿瘤，据统计，每年约有13万人死于肝癌，占全世界肝癌年死亡人数的43.7％。化疗在预防术后肿瘤复发和转移中发挥着不可替代的作用，但由于多药耐药的存在，使得化疗效果降低或无效，严重影响了病人的预后和生活质量。 

所述黄芪皂苷Ⅱ通过逆转肿瘤细胞的多药耐药性发挥抗肿瘤作用。 

所述黄芪皂苷Ⅱ与其他药物同时给药或序贯给药发挥抗肿瘤作用。 

本发明的有益效果 

1.本发明提供了量效关系明确、结构组分确证的抗肿瘤药物，为临床抗肿瘤新药的开发奠定了基础； 

2.本发明提供了逆转多药耐药发挥抗肿瘤作用的药物，为解决化疗药物多药耐药现象提供了新方案。 

附图说明

图1黄芪皂苷薄层色谱图(Ⅰ～Ⅵ为分离组分) 

图2黄芪皂苷HPLC图(A.混标溶液；B.组分Ⅲ；C.组分Ⅰ；1.黄芪皂苷Ⅳ；2.黄芪皂苷Ⅱ) 

图3流式细胞仪检测AS Ⅱ，ASⅣ对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响 

图4流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化(**P＜0.01VS BEL-7402，n＝3) 

图5三种化疗药物对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的杀伤效应 

图6 AS Ⅱ、ASⅣ对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的剂量-效应曲线 

lane1：BEL-7402细胞 

lane2：BEL-7402/FU细胞 

lane3：BCL-7402/FU+5-FU(0.025mg/mL) 

lane4：BCL-7402/FU+5-FU+ASII(0.08mg/mL) 

lane5：BCL-7402/FU+5-FU+ASII(0.16mg/mL) 

lane6：BCL-7402/FU+5-FU+ASIV(0.08mg/mL) 

lane7：BCL-7402/FU+5-FU+ASIV(0.16mg/mL) 

lane8：BCL-7402/FU+5-FU+VRP(0.001mg/mL)) 

图7 mdr1基因的表达(**p＜0.01 vs BEL-7402/5-FU，n＝3) 

图8半定量PCR产物的定量分析 

A.BEL-7402组 

B.BEL-7402/FU组 

C.BEL-7402/FU+0.08mg/mL ASⅡ组 

D.BEL-7402/FU+0.16mg/mL ASⅡ组 

E.BEL-7402/FU+0.08mg/mL ASⅣ组 

F.BEL-7402/FU+0.16mg/mL ASⅣ组 

G.BEL-7402/FU+0.001mg/mLVRP组 

图9 P-gp蛋白的免疫组化染色结果(与BEL-7402/5-FU组比较，**为P＜0.01 n＝5) 

图10 P-gp蛋白表达的定量分析 

图11流式细胞仪检测细胞内Rho123表达率(*p＜0.05，**p＜0.01 vs BEL-7402/5-FU，n＝3) 

图12 Rho123荧光表达率分析 

lane1：BEL-7402细胞 

lane2：BEL-7402/FU细胞 

lane3：BCL-7402/FU+5-fu(0.025mg/mL) 

lane4：BCL-7402/FU+5-fu+ASII(0.08mg/mL) 

lane5：BCL-7402/FU+5-fu+ASII(0.16mg/mL) 

lane6：BCL-7402/FU+5-fu+ASIV(0.08mg/mL) 

lane7：BCL-7402/FU+5-fu+ASIV(0.16mg/mL) 

lane8：BCL-7402/FU+5-fu+VRP(0.001mg/mL) 

图13 Bcl-2、Bax基因表达(**p＜0.01 vs BEL-7402/5-FU，n＝3) 

图14半定量PCR产物的定量分析 

具体实施方式

实施例1 黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ的制备 

1.实验材料 

1.1 试药 黄芪(原产地甘肃，购自国投药业安徽有限公司，批号：080623；经安徽中医学院药用植物学教研室刘守金教授鉴定为膜荚黄芪)；黄芪皂苷Ⅳ标准品(中国药品生物制品检定所，批号：0781-200210)；黄芪皂苷Ⅱ标准品(上海中药标准化研究中心提供，批号：07-1015)；硅胶高效G板(青岛海洋化工厂)；柱层析用硅胶(青岛海洋化工集团)；D101树脂(天津友昌工贸有限公司)；乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。 

1.2 仪器 

Agilent 1100Series               高效液相色谱仪配备示差检测器 

Agilent ChemStation              色谱工作站 

CTG-10提取器                     湖南省衡阳市药物机械厂 

TU-1800SPC紫外可见分光光度计     北京普析通用仪器有限责任公司 

AB135-S电子分析天平              Mettler Toledo 

RE-52旋转蒸发器                  上海青浦沪西仪器厂 

ZK-82B真空干燥箱                 上海市实验仪器总厂 

UV-8三用紫外仪                   无锡科达仪器厂 

2.实验方法 

2.1 黄芪总皂苷的提取与分离 

称取黄芪药材5kg，置于CTG-10提取器中，用70％乙醇回流提取2次，第1次加10倍量，第2次加8倍量，每次1h。合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至10升。水饱和的正丁醇(1∶1)萃取三次，合并正丁醇部分，回收正丁醇萃取液浓缩至约1L。 

2.2 黄芪总皂苷的富集与纯化 

称取D101大孔树脂适量，按规定程序处理后装柱，然后用95％的乙醇反复洗脱，至洗脱液与水(1∶2)混合不产生混浊，再用蒸馏水反复洗脱，至无乙醇味，并且树脂柱不再下降时即可。浓缩后的萃取液缓慢加到D101树脂柱(7.5cm×95cm，树脂高度64cm)上，先以四倍柱体积的蒸馏水洗脱，以除去糖类成分，继以四倍柱体积的70％乙醇洗脱，收集70％醇洗脱液，置旋转蒸发器上浓缩，水浴蒸干后称重。 

2.3 黄芪皂苷的分离与提取 

称取300g硅胶装柱(4.2cm×100cm，硅胶高度78cm)，将2.2制备的黄芪总皂苷，加少量甲醇溶解后装柱，分别以不同比例的乙酸乙酯∶甲醇(100∶25，100∶30)洗脱，每50mL收集一流份，经薄层色谱检测，合并相同部分，浓缩蒸干，称重，依次得组分Ⅰ～组分Ⅵ部分。 

2.4 薄层色谱法鉴别黄芪皂苷 

2.4.1 对照品溶液的制备 

精密称取黄芪苷Ⅱ和Ⅳ标准品各1.0mg，用1mL甲醇溶解，摇匀，即得黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ浓度均为1mg·mL^-1的对照品溶液。 

2.4.2 供试品溶液的制备 

精密称取黄芪总皂苷10mg；组分Ⅰ～组分Ⅵ5mg，分别用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液。 

2.4.3 TLC法 

硅胶高效G板用0.3mo1·L^-1NaH₂PO₄溶液浸泡，115℃活化3h备用。取供试品溶液和对照品溶液各10μL，点于薄层板上，以氯仿—甲醇—乙酸乙酯—水(6∶3∶1∶1)放置过夜的下层溶液为展开剂，展距15cm，展开，取出，吹干，喷以10％硫酸乙醇溶液，置烘箱中105℃加热至斑点显色清晰，同时置紫外光灯(365nm)下检视。 

2.5 黄芪总皂苷含量测定 

2.5.1 对照品溶液的制备 

精密称取黄芪苷Ⅳ标准品5.0mg，置于10mL的容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。 

2.5.2 标准曲线的制备 

精密吸取对照品溶液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mL，置具塞试管中，加无水乙醇补足体积至0.5mL，再分别加入8％的香草醛无水乙醇试液0.5mL和72％的硫酸5.0mL摇匀，立即放入62℃恒温水浴中，保温20min后，置冷水浴中冷却至室温，于540nm波长处测吸光度。同时以随行试剂作空白。以吸光度(Y)为纵坐标，黄芪苷Ⅳ的浓度μg·mL^-1(X)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。 

2.5.3 供试品溶液的制备 

精密称取黄芪总皂苷约10mg，置25mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液0.2mL，照标准曲线项下方法处理并测定吸光度。 

2.6 高效液相色谱法 

2.6.1 色谱条件 

色谱柱：Zorbox XDB-C8(4.6×1.50mm，5μm)；流动相：乙腈∶水＝34∶66；柱温：25℃；示差检测器光学单元温度：32℃；流速：1.0ml·min^-1。 

2.6.2 对照品溶液的制备 

取TLC项下的对照品溶液适量，分别加甲醇稀释成浓度为0.5，0.25，0.125，0.063和0.032mg·mL^-1对照品溶液。按上述色谱条件，分别进样10μL。以峰面积为纵坐标，对照品溶液的质量数(μg)为横坐标，进行线性回归。 

2.6.3 供试品溶液的制备与测定 

精密称取组分Ⅰ～组分Ⅵ各1mg，加1mL甲醇溶解，取20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，由回归方程计算各组分中黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ的含量。 

2.6.4 精密度试验 

取浓度为0.125mg·mL^-1的对照品溶液，重复进样5次，每次10μL，记录峰面积并计算RSD值。 

2.6.5 重复性试验 

取供试品组分Ⅰ5份，分别制备各供试品溶液，照上述色谱条件进行测定，记录峰面积并计算RSD值。 

2.6.6 回收率试验 

精密称取5份组分Ⅰ，组分Ⅲ样品1.0mg，分别制备各供试品溶液。其中组分Ⅰ样品溶液中加入浓度为0.125mg·mL^-1的黄芪皂苷Ⅱ对照品溶液0.5mL，组分Ⅲ样品溶液中加入浓度为0.125mg·mL^-1的黄芪皂苷Ⅳ对照品溶液0.5mL，依法操作，测定，计算加样回收率。 

3.结果 

3.1 黄芪总皂苷的富集与纯化 

D101大孔树脂的70％醇洗脱液回收乙醇，蒸干后称重得总黄芪皂苷6.5g。 

3.2 黄芪皂苷硅胶柱层析的分离 结果见表1 

表1 硅胶柱层析分离的黄芪皂苷组分 

3.3 黄芪皂苷的TLC分析结果 

硅胶柱层析分离的黄芪皂苷组分TLC结果见图1。结果表明组分Ⅰ部分主要含有黄芪皂苷Ⅱ；组分Ⅲ部分主要含有黄芪皂苷Ⅳ；组分Ⅱ、组分Ⅳ部分除含有少量黄芪皂苷Ⅳ外，还含有其他组分；组分Ⅴ、组分Ⅵ部分也含有未被鉴定的成分。 

3.4 黄芪总皂苷含量测定 

黄芪皂苷Ⅳ在4.167～41.667μg·mL^-1范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y＝0.0211X-0.0309(r＝0.9979)。黄芪总皂苷含量为321.7mg·g^-1，占黄芪总量0.13％。 

3.5 高效液相色谱法 

黄芪皂苷Ⅱ在0.35～5.6μg范围内线性关系良好，回归方程为Y＝7977.2X-690.77，r＝0.9998；黄芪皂苷Ⅳ在0.33～5.25μg范围内线性关系良好，回归方程为Y＝6570.7X+2115.8，r＝0.99979。分离的6个组分中黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ的含量见表2，HPLC色谱图见图2。 

表2 黄芪皂苷HPLC含量测定结果 

(注：“-”表示未检出) 

3.6 精密度试验 

黄芪皂苷ⅡRSD为0.47％(n＝5)，黄芪皂苷ⅣRSD为0.37％(n＝5)表明本法精密度良好。 

3.7 重复性试验 

样品组分ⅠRSD＝0.19％(n＝5)表明本法重复性良好。 

3.8 回收率试验 

黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ各浓度平均回收率为98.76％和99.62％。 

实施例2 黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ抗肿瘤作用研究 

1.实验材料 

1.1.细胞株 

人肝癌细胞株BEL-7402和肝癌耐药细胞株BEL-7402/5-FU均购自南京凯基生物科技发展有限公司。 

1.2 药品及试剂 

黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ(ASⅡ，ASⅣ)      (实验室自制) 

右旋维拉帕米(R(+)-VERAPAMIL HCL，VRP)   购自美国IL公司，纯度＞99％ 

5-FU                                    天津金耀氨基酸有限公司，批号0810211 

MMC                                     浙江海正药业股份公司，批号0810211 

ADR                                     浙江海正药业股份公司，批号0810211 

DMEM及胎牛血清                        美国Gibco产品 

MTT                                   美国Sigma公司产品 

DMSO                                  美国Sigma公司产品 

Rho123                                美国Sigma公司产品 

胰蛋白酶                              BIOSHARP公司产品 

PBS                                   博士德生物有限公司 

异丙醇                                分析纯 

三氯甲烷                              分析纯 

无水乙醇                              分析纯 

中性树胶                              上海标本模型厂 

Trizol试剂                            Invitrogen公司产品 

焦磷酸二乙酯(DEPC)                    Sigma公司产品 

逆转录试剂盒                          Promega Corporation产品 

PCR扩增试剂盒                         Fermentas公司产品 

琼脂糖                                西班牙进口分装 

EB                                    华美公司产品 

P-gp单抗及标记二抗                    北京博奥森生物技术有限公司 

1.3 仪器与设备 

电子天平BP211D                        德国Sartarius生产 

MAUO型电子分析天平                    上海第二天平仪器厂 

SW-CJ-IF型超净工作台                  江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司 

Napco-6100型细胞培养箱                美国SHELLAB 

DL-5M高速冷冻离心机                   德国Saftarius公司 

Hema 18R冷冻高速离心机                珠海黑马医学仪器有限公司 

GSY-8电热恒温水浴锅                   北京医疗设备厂意成公司 

Powerpac300型电泳仪                   美国BIO-RAD公司 

Eppendorf Centrifuge 5415R冷冻离心机  德国Sigma有限公司 

基因扩增仪                            珠海黑马仪器有限公司 

GSG2000核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统  珠海黑马医学仪器有限公司 

Muliskan MK3酶标仪                    荷兰雷勃公司 

XSZ型倒置显微镜                       重庆光学仪器厂 

37℃温箱                              湖北省黄石市医疗器械厂生产 

-80℃超低温冰箱                       三洋公司 

日本三洋低温冷冻冰箱                  合肥市科隆商贸有限公司提供 

电热鼓风干燥箱                        上海市实验仪器总厂生产 

Coultzer Epics XL-MCL流式细胞仪       美国Beckman Counter公司产品 

2.方法 

2.1 细胞培养 

人肝癌敏感细胞株BEL-7402用含10％FCS、青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL的高糖DMEM培养液于37℃，CO₂体积分数为5％的细胞培养箱内培养。相应耐药细胞株BEL-7402/5-FU连续培养在含20μg/mL5-FU的上述培养液中，培养条件相同。 

2.2 黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ体外直接抑制肿瘤作用 

2.2.1 MTT法检测黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ对肿瘤细胞的抑制作用 

取对数生长期BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞，用0.25％胰酶消化后用DMEM培养基制成单细胞悬液，以2×10⁵个/mL细胞密度接种于96孔培养板中，100μL/孔。置37℃，5％CO₂孵箱内培养12h。吸弃上清，然后分别加入200μL不同浓度的黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ(终浓度分别为0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mg/mL)，同时设空白细胞对照组，每组4个复孔。培养48h，再加入5mg/mL的MTT 20μL/孔，继续培养4h后吸弃上清，加入DMSO 150μL/孔，微振荡器上振荡10min，将试剂对照调零，用自动酶标仪在550nm波长处测出细胞对照组和各药物组的OD值，取各组均值，重复实验3次。以下面的公式计算各组药物对细胞的抑制率IR＝(1-药物组OD值/细胞对照组OD值)×100％ 

2.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 

取对数生长期BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞以3×10⁵个/ml细胞密度接种于培养瓶中，37℃、饱和湿度及5％CO₂条件下培养，待细胞贴壁后，分别加入DMEM稀释的不同浓度的黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ，终浓度均为0.08，0.16，0.32mg/mL，细胞对照组加3mLDMEM培养液。继续培养48h，用0.25％胰酶消化后用DMEM培养基制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，PBS(pH7.14，0.01mmol)重悬细胞，调细胞浓度1×10⁹/L，离心，加0.5mL含0.1％葡萄糖的PBS重悬细胞，立即加入5mL冷的70％乙醇，混匀，-20℃过夜固定细胞。离心细胞(2000r/min，5min)，PBS洗涤2次，加DNA染液300μL，暗处放置30min，上机检测细胞DNA含量，用随机软件分析细胞凋亡率。 

2.3 体外肿瘤细胞耐药逆转实验 

2.3.1 BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞多药耐药性检测 

取对数生长期BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞，0.25％胰酶消化后用DMEM培养基(含10％FCS)制成单细胞悬液，2×10⁵个/mL细胞密度接种于96孔培养板中，100μL/孔。置37℃，5％CO₂孵箱内培养12h，加入用DMEM稀释的不同浓度的药物(5-FU、MMC、ADR终浓度分别为0.2，1，5，25，125μg/mL)，每个剂量设5个复孔，100μL/孔，同时设置试剂对照组和细胞对照组，分别继续培养48h，再加入5mg/mL的MTT 20μL/孔，继续培养4h后吸弃上清，加入DMSO 150μL/孔，微振荡器上振荡10min，将试剂对照调零，用自动酶标仪在550nm波长处测出细胞对照组和各药物组的吸光度(OD)值，取各组均值，重复实验3次。以下面的公式计算各种药物对细胞的抑制率IR(Inhibition Rate)＝(1-药物组OD值/细胞对照组OD值)×100％耐药倍数＝耐药细胞IC₅₀/敏感细胞IC₅₀

2.3.2 确定逆转耐药剂量 

取对数生长期BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞，用0.25％胰酶消化后用DMEM培养基制成单细胞悬液以2×10⁵个/ml细胞密度接种于96孔培养板中，100μL/孔。置37℃，5％ CO₂孵箱内培养12h。吸弃上清，然后分别加入200μL不同浓度的黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ，终浓度均为0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mg/mL；同时设阳性对照组5-FU(终浓度0.125mg/mL)和不含药物的细胞对照组。每组设4个复孔。培养48h，再加入5mg/mL的MTT 20μL/孔，继续培养4h后吸弃上清，加入DMSO 150μL/孔，微振荡器上振荡10min，将试剂对照调零，用自动酶标仪在550nm波长处测出细胞对照组和各药物组的OD值，取各组均值，重复实验3次。以下面的公式计算各种药物对细胞的抑制率IR＝(1-药物组OD值/细胞对照组OD值)×100％ 

2.3.3 体外肿瘤细胞耐药逆转实验 

取对数生长期BEL-7402/5-FU细胞，制成单细胞悬液，以2×10⁵个/mL细胞密度接种于96孔培养板中，100μL/孔，置37℃，5％CO₂孵箱内培养12h。逆转实验分组：BEL-7402/5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU+ASⅡ组、BEL-7402/5-FU+5-FU+ASⅣ组、BEL-7402/5-FU+5-FU+VRP组。先加入用DMEM稀释的化疗药物5-FU终浓度为0.025mg/mL，然后按实验分组分别加无细胞毒剂量的黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ，使黄芪皂苷Ⅱ终浓度分别为0.04，0.08mg/mL，黄芪皂苷Ⅳ终浓度分别为0.04，0.08mg/mL，VRP终浓度为0.001mg/mL。每孔加含有药物的完全培养液100uL，平行设4个复孔，放孵箱培养48h，用MTT法测定细胞毒性(方法同2.2)。求出逆转倍数。逆转倍数＝使用逆转剂后/使用逆转剂前。 

2.3.4 RT-PCR法检测mdr1基因表达 

2.3.4.1 总RNA的提取 

取对数生长期BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞，制成单细胞悬液，以3×10⁵个/ml细胞浓度接种于培养瓶中，置37℃，5％CO₂孵箱内培养12h。实验分组：BEL-7402组、BEL-7402/5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU+AS Ⅱ组、BEL-7402/5-FU+5-FU+ASⅣ组、BEL-7402/5-FU+5-FU+VRP组，按分组分别加入5-FU(终浓度为0.025mg/mL)，黄芪皂苷Ⅱ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，黄芪皂苷Ⅳ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，VRP(终浓度为0.001mg/mL)，分别继续培养48h。用Trizol试剂，按说明书方法提取各组细胞总RNA。具体操作参照试剂盒说明，简述如下： 

1)每组加入1mLTrizol试剂，混匀吹打数次； 

2)将此细胞悬液移至1.5mLEP管中，微振荡器上振荡5min； 

3)加入0.2mL氯仿，颠倒混匀5min，室温放置5min； 

4)4℃，2000g离心15min； 

5)将上层水相小心吸出，移至另一EP管中。注意不要吸出中间层，该层富含蛋白质。加入等体积的异丙醇于样品颠倒混匀数次，室温放置10min沉淀RNA； 

6)4℃，12000g离心10min沉淀RNA； 

7)弃上清，加入75％预冷乙醇0.5mL，微振荡器上振荡以充分漂洗沉淀； 

8)7500g离心5min，弃上清； 

9)沉淀物室温干燥5min。不宜完全干燥，否则沉淀难以溶解。 

10)将沉淀用无RNA酶水20μL溶解，-70℃保存备用。 

2.3.4.2 逆转录 

1)每份样品取总RNA 5μL，离心，70℃变性10min，置冰上冷却5min； 

2)准备20μL反应体积混合物如下，冰上依次加入： 

Neclease-Free water (4.9μL)Reverse Transcription 10×Buffer 2μL 

MgCl₂，25Mm 4μL dNTP Mixture，10Mm 2μL 

Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5μL 

Oligdt₁₅ Primer 1μL AMV Reverse Transcriptase 0.6μL 

tRNA 5μL 

3)混匀，室温放置10min。离心，42℃温育60min； 

4)99℃加热5min； 

5)4℃冷却5min，-20℃保存。 

2.3.4.3 PCR扩增 

1)在冰上将以下成分加入0.5mL离心管中(总体积25μL) 

PCR Master Mix(2×)             12.5μL 

上游引物                        0.5μL 

下游引物                        0.5μL 

逆转录反应液                    1μL 

Water，nuclerse-free            10.5μL 

混匀，离心。 

2)进行PCR扩增反应条件为：mdr1：94℃，5min；94℃，1min；51℃，40s；72℃，1min，共35个循环；72℃延伸10min终止反应，4℃保存； 

GAPDH：94℃，5min；94℃，40s；56℃，40s；72℃，1min，共30个循环；72℃延伸10min终止反应，4℃保存。 

2.3.4.4 引物设计 根据GenBank相关软件设计并验证mdr1核苷酸序列引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成序列为： 

F：Forword，R：Reverse 

2.3.4.5 扩增产物的检测 

取PCR产物5μL，加入2μL 0.2μg/mL EB，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。凝胶成像系统扫描成像，用mdr1与GAPDH的光密度比值表示MDR1基因的表达水平。 

2.3.5 免疫细胞化学检测各组细胞P-gp的表达 

取对数生长期BEL-7402及BEL-7402/5-FU细胞经常规消化、离心，按5×10⁴/ml接种于放入玻片的6孔板中，每孔加入2mL，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养12h。实验分组：BEL-7402组、BEL-7402/5-FU组、BEL-7402/5-FU+AS Ⅱ组、BEL-7402/5-FU  +ASⅣ组、BEL-7402/5-FU+VRP组，按组别分别加入黄芪皂苷Ⅱ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，黄芪皂苷Ⅳ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，VRP(终浓度为0.001mg/mL)，继续培养24h后收获细胞。多聚甲醛固定15min，PBS洗3次各3min，滴加3％H₂O₂，室温静置10min，PBS洗3次各3min，滴加正常山羊血清封闭液，室温30min，滴加I抗(1∶200稀释)100μL/片，4℃过夜。4℃过夜后需在室温复温10min，PBS洗3次每次5min，滴加Ⅱ抗工作液100μL/片，37℃ 30min，PBS洗3次各5min，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液100μL/ 片，PBS洗3次各5min，DAB显色5～10min，在显微镜下掌握染色程度，自来水冲洗，苏木精复染1min，盐酸酒精分化数s，自来水冲洗10～15min，脱水、透明、封片、烤片、显微镜拍照。 

2.3.6 黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ对细胞内Rho123蓄积的影响 

取对数生长期BEL-7402及BEL-7402/5-FU细胞制成单细胞悬液，按5×10⁵/ml细胞密度接种于培养瓶中，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养12h。实验分组：BEL-7402组、BEL-7402/5-FU组、BEL-7402/5-FU+AS Ⅱ组、BEL-7402/5-FU+ASⅣ组、BEL-7402/5-FU+VRP组，按组别分别加入黄芪皂苷Ⅱ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，黄芪皂苷Ⅳ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，VRP(终浓度为0.001mg/mL)，继续培养24h。各组细胞消化、离心，分别加入含5μg/mL Rho123的DMEM培养液，37℃、5％ CO₂细胞培养箱中继续培养30min。吸弃培养液，重新加入含有相应浓度黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ或VRP的培养液，再次孵育30min。离心以PBS洗细胞两次，500μLPBS吹散细胞，上流式细胞仪检测(激发波长488nm，发射波长525nm)，以荧光强度平均值(Mean)表示细胞内Rho123浓度。 

2.3.7 RT-PCR法检测Bcl-2、Bax基因表达 

2.3.7.1 总RNA的提取 

取对数生长期BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞，制成单细胞悬液，以3×10⁵个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置37℃，5％ CO₂孵箱内培养12h。实验分组：BEL-7402组、BEL-7402/5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU组、BEL-7402/5-FU+5-FU+AS Ⅱ组、BEL-7402/5-FU+5-FU+ASⅣ组、BEL-7402/5-FU+5-FU+VRP组，按分组分别加入5-FU(终浓度为0.025mg/mL)，黄芪皂苷Ⅱ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，黄芪皂苷Ⅳ(终浓度依次为0.08mg/mL，0.16mg/mL)，VRP(终浓度为0.001mg/mL)，分别继续培养48h。用Trizol试剂，按说明书方法提取各组细胞总RNA。具体步骤同“2.3.4.1” 

2.3.7.2 逆转录 具体步骤同“2.3.4.2” 

2.3.7.3 PCR扩增 

具体步骤同“2.3.4.3”进行PCR扩增反应条件为：Bcl-2，Bax：94℃，5min；94℃，1min；55℃，40s；72℃，1min，共35个循环；72℃延伸10min终止反应，4℃保存； 

GAPDH：94℃，5min；94℃，40s；56℃，40s；72℃，1min，共30个循环；72℃延伸10min终止反应，4℃保存。 

2.3.7.4 引物设计 根据GenBank相关软件设计并验证Bcl-2，Bax核苷酸序列引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成序列为： 

F：Forword，R：Reverse 

2.3.7.5 扩增产物的检测 

取PCR产物5μL，加入2μL 0.2μg/mL EB，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。凝胶成像系统扫描成像，用mdr1与GAPDH的光密度比值表示MDR1基因的表达水平。 

2.4 统计学处理 

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，样本间均数比较采用t检验；结果以均值±标准差(x±s)表示，P＜0.05认为有统计学差异。 

4.结果 

3.1 黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ体外直接抑制肿瘤作用 

3.1.1 MTT法检测黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ对肿瘤细胞的抑制作用 

结果如表3示，不同浓度的黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ(0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mg/mL)呈浓度依赖性的抑制BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的增殖，其中黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ在0.64mg/mL时对BEL-7402细胞的抑制率分别达到59.6％和48.8％，对BEL-7402/5-FU细胞抑制率达到18.89％和20.15％。结果表明，黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ对两种人肝癌细胞株BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的增殖具有明显抑制作用。 

表3 黄芪皂苷Ⅱ，黄芪皂苷Ⅳ对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞生长的影响 

3.1.2 黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响 

结果如图3，图4示，不同浓度的黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ，均能促进BEL-7402/5-FU和BEL-7402细胞的DNA亚G1峰升高。经流式细胞仪随机软件分析表明，(0.08，0.16，0.32)mg/mL的黄芪皂苷Ⅱ作用细胞后，BEL-7402/5-FU和BEL-7402细胞的凋亡率分别为(2.75±0.25)％，(4.75±0.25)％，(6.05±0.21)％，(5.95±0.35)％，(9.3±0.2)％，(14.8±0.42)；(0.08，0.16，0.32)mg/mL 的黄芪皂苷Ⅳ作用细胞后，BEL-7402/5-FU和BEL-7402细胞的凋亡率分别为(3.15±0.29)％，(4.90±0.35)％，(7.85±0.21)％，(4.5±0.1)％，(6.95±0.17)％，(19.1±0.2)％，与不加药的细胞对照组相比有统计学差异。 

3.2 BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞多药耐药性检测 

BEL-7402/5-FU细胞对5-FU显示强的耐药性，耐药倍数为19.64；对ADR、MMC显示较弱的耐药性。结果见表4，图5。 

表4 BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞对化疗药物的敏感性 

^**P＜0.01VSBEL-7402，n＝3 

3.3 确定逆转耐药剂量 结果如图6示， 

不同浓度的黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ(0.04，0.08，0.16，0.32，0.64mg/mL)呈浓度依赖性的抑制BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的增殖，其中黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ在0.08mg/mL以下对BEL-7402/5-FU细胞无明显毒性，细胞存活率大于95％。 

3.4 体外肿瘤细胞耐药逆转实验 

结果如表5显示，(0.04，0.08)mg/mL黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ对BEL-7402/5-FU细胞耐药性有明显的逆转作用，并且逆转作用呈一定的剂量依赖性。我们发现黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ在0.04～0.08mg/mL的无细胞毒性范围内能够提高5-FU对肝癌耐药细胞的细胞毒作用，而且随着药物浓度的增加其逆转作用逐渐增强，逆转倍数分别达到了1.81，1.86，说明黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ可有效逆转BEL-7402/5-FU细胞的耐药。 

表5 黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ对肝癌细胞耐药性的逆转作用 

注：与5-FU组比较，^*为P＜0.05，^**为P＜0.01 

3.5 RT-PCR法检测mdr1基因表达 

结果如图7和图8所示，与BEL-7402/5-FU+5-FU组相比，(0.08，0.16mg/mL)的黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ能降低mdr1 mRNA水平，有显著性差异，P＜0.01。 

肝癌细胞的MDR现象是由多种基因和多途径共同造成的，并不可能单靠阻断其中一条途径就达到非常理想的结果。Mdr1基因转录为mRNA后，经修饰翻译为P-gp，在此过程中，mRNA是关键环节，P-gp抑制剂可通过阻断该环节而减少P-gp的生成。RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA 合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR实验结果显示(0.08，0.16)mg/mL的黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ分别作用含0.025mg/mL5-FU的BEL-7402/5-FU细胞48h后，加药组的mdr1基因表达水平与BEL-7402/5-FU+5-FU组相比有明显的下降，说明黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ都能下调BEL-7402/5-FU细胞的mdr1基因表达。 

3.6 免疫细胞化学检测各组细胞P-gp的表达 

肝癌细胞胞膜或胞浆见有棕黄色颗粒为阳性表达；肝癌细胞胞膜及胞浆无棕黄色颗粒为阴性表达。结果如图9和图10所示P-gp蛋白阳性反应呈棕黄色，主要位于胞质中，呈细颗粒状均匀分布，其中耐药细胞BEL-7402/5-FU组表达增加，颜色加深，经0.08mg/mL黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ作用的耐药细胞P-gp蛋白表达略下降，颜色变浅，胞质内棕黄色颗粒减少；经0.16mg/mL黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ及0.001mg/mLVRP作用的耐药细胞P-gp蛋白表达明显下降，颜色变浅，胞质内棕黄色颗粒明显减少。免疫细胞化学结果显示P-gp蛋白在胞膜及胞质呈阳性反应，(0.08，0.16)mg/mL的黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ均能降低P-gp蛋白表达水平。 

3.7 黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ对细胞内Rho123蓄积的影响 

结果如图11，图12所示在Rho123蓄积。实验中，BEL-7402/5-FU细胞内Rho123荧光很弱，加入0.08mg/mL的黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ后，波峰右移，细胞内荧光增强，当黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ浓度增加到0.16mg/mL后，波峰明显右移，细胞内荧光明显增强。 

Rho123在P-gp的功能检测中有重要的价值，Rho123是P-gp较特异的作用底物，可被P-gp泵出细胞外，使细胞内Rho123浓度降低，此过程与P-gp转运抗肿瘤药物的机制相同。因此可以用细胞内Rho123留滞实验间接反映P-gp的功能。BEL-7402细胞有P-gp弱表达，因此细胞内Rho123量最多，排出量最少；而BEL-7402/5-FU细胞存在P-gp高表达，所以细胞内Rho123量最少，排出量最多；加入黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ后，BEL-7402/5-FU细胞内Rho123荧光表达率明显增加，提示黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ抑制了P-gp外排功能。通过RT-PCR，免疫细胞化学和流式细胞仪的检测发现黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ能直接部分下调多药耐药基因mdr1及P-gp蛋白表达，抑制P-gp蛋白功能，这可能为其机制之一。 

3.8 RT-PCR法检测Bcl-2、Bax基因表达 

结果如图13和图14所示，与BEL-7402/5-FU+5-FU组相比，(0.08，0.16mg/mL)的黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅳ能降低Bcl-2mRNA水平，有显著性差异，P＜0.01，但Bax mRNA表达水平没有明显变化。 

近年来抗凋亡机制在多药耐药发生中的作用倍受关注。Bcl-2家族是目前广泛研究的一类对细胞凋亡起重要调控作用的凋亡相关基因，包括凋亡促进基因(如Bax、Bcl-xs、Bad等)和凋亡抑制基因(如Bcl-2、Bcl-xl等)。Bcl-2和Bax二者互为拮抗，它们在细胞中以二聚体形式发挥作用，如二者表达量平衡则细胞生存期正常；当Bcl-2表达量较高时，形成异源二聚体Bcl-2/Bax，抑制细胞凋亡；当Bax表达量较高时，形成同源二聚体Bax/Bax，通过抑制Bcl-2的抗凋亡作用而促进细胞凋亡的发生。Bcl-2作为重要的抗凋亡基因，对细胞凋亡担负着重要的调控作用，可以抑制多种机制引起的细胞凋亡。不同浓度的黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ分别作用BEL-7402/5-FU细胞后，Bcl-2表达降低，从而使Bcl-2抗凋亡作用减弱，肝癌细胞出现凋亡，而Bax一直有表达却没有明显变化趋势，提示Bcl-2基因可能是黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ作用的靶点；Bax/Bcl-2mRNA比值增加，而Bcl-2mRNA表达减少，那么Bax mRNA表达量相对增加，说明Bax与Bcl-2相互结合形成异二聚体减少，抑制凋亡作用 减弱，而Bax形成同源二聚体的量相对增多，促凋亡作用增强。 

实施例3 

片剂：黄芪皂苷Ⅱ    10mg 

乳糖                187mg 

玉米淀粉            50mg 

硬脂酸镁            3mg 

制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量为10mg。 

实施例4 

胶囊剂：黄芪皂苷Ⅱ  10mg 

乳糖                188mg 

硬脂酸镁            2mg 

制备方法：将活性成分与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。 

实施例5 

安瓿剂：黄芪皂苷Ⅱ  2mg 

氯化钠              9mg 

制备方法：将活性成分和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。 

本发明提供了黄芪皂苷黄芪皂苷Ⅱ在高浓度时可显著抑制肿瘤细胞BEL-7402和BEL-7402/5-FU的生长，促进肿瘤细胞凋亡；在低浓度无细胞毒性浓度范围内可减少肿瘤细胞BEL-7402/5-FU的多药耐药性，提高5-FU对肝癌耐药细胞的细胞毒作用，起到协助抗肿瘤作用；且均为单体化合物，量效关系明确，可开发成抗肿瘤药物，尤其是治疗肝癌的药物，为临床患者提供新的解决方案。序列表 

<110>安徽医科大学第一附属医院 

<120>黄芪皂苷II在制备抗肝癌药物中的应用 

<140>201010547907.1 

<141>2010-11-17 

<160>8 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>23 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

aaagtcggag tatcttcttc caa                          23 

<210>2 

<211>24 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

ccaatttgaa tagcgaaaca ttga                         24 

<210>3 

<211>24 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

gtgaaggtcg gtgtcaacgg attt                         24 

<210>4 

<211>24 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

cacagtcttc tgagtggcag tgat                         24 

<210>5 

<211>23 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

aaagtcggag tatcttcttc caa                          23 

<210>6 

<211>24 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

ccaatttgaa tagcgaaaca ttga                         24 

<210>7 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>7 

cagctgcacc tgacgccctt                              20 

<210>8 

<211>20 

<212>DNA     

<213>人工序列 

<400>8 

gcctccgtta tcctggatcc                              20 

Claims (3)

1.黄芪皂苷Ⅱ在制备抗肝癌药物中的应用。

2.如权利要求1的应用，所述黄芪皂苷Ⅱ通过逆转肿瘤细胞的多药耐药性发挥协助抗肝癌作用。

3.如权利要求1的应用，所述黄芪皂苷Ⅱ与其他药物同时给药或序贯给药发挥抗肝癌作用。

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