CN104274489A

CN104274489A - 一种用于治疗肿瘤的联合用药物

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Publication number: CN104274489A
Application number: CN201410246755.XA
Authority: CN
Inventors: 楼兰花
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Current assignee: Individual
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-06-05
Also published as: CN104274489B

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肿瘤的联合用药物，所述联合用药物由砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物的不同规格的单位制剂组成，所述的砷化物溶液通过如下方法制得：取As₂O₃粉末加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解；所述巴西苏木素类化合物由巴西苏木素和巴西苏木红素组成。本发明将砷化合物、巴西苏木素类化合物合用，可以提高砷化合物疗效，控制砷化合物剂量和相应的毒、副作用，使它的使用变得更加安全，拓展砷化合物治疗谱，尤其在抗T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞方面表现出良好的协同作用。

Description

一种用于治疗肿瘤的联合用药物

技术领域

本发明属中药技术领域，涉及砷化合物与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的联合用药物中的应用，以及一种用于治疗肿瘤的联合用药物。

背景技术

三氧化二砷(As203)为中药砒霜，20世纪70年代我国学者发现其治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)有效，引起了研究者和临床医生的广泛关注。但是不同肿瘤细胞对As₂O₃的易感性差别很大。如CN01107536.8涉及治疗恶性淋巴瘤的药物及其配制方法，其公开了来源于人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞对As₂O₃很敏感，而同样来源于人类T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞对As₂O₃就不敏感。另外，肿瘤细胞在体内外敏感性差异也大，许多肿瘤细胞在体外能够被As₂O₃有效诱导凋亡，而在临床应用中却反应不敏感。实体瘤细胞株则大多较不敏感，竺涵光等人(口腔医学纵横杂志2000年第16卷第1期35－37页)报道：较多的研究表明,三氧化二砷既有诱导肿瘤凋亡和分化作用，又有明显的抗增殖作用。不仅可以用于治疗APL、CML等血液系统恶性肿瘤也有可能治疗食管癌、胃癌、结肠癌、口咽癌的实体肿瘤，诸多的体外研究充分地证明了这一点。三氧化二砷治疗实体肿瘤作用在较多的理论研究虽已得到了证实,但临床治疗实体肿瘤却未有取得明显进展的报道。究其原因,这可能与三氧化二砷在血液中95％～97％的血红蛋白结合的生化特性有关。在常规的APL临床治疗方案中,血液的砷浓度平均在1μmol/L，峰值在4.8μmol/L,按常规的血液扩散浓度,到达实体肿瘤的砷浓度远远低于治疗浓度。经动物体内实验表明:经动脉微量输液泵输入100μmol/L的As₂O₃，其局部灌注区域内的组织浓度平均达7.9μmol/L；同条件下经静脉输入，其组织浓度仅达1.4μmol/L；这可能是血液系统恶性肿瘤显效,而实体肿瘤作用不明显的关键所在。

研究证实三氧化二砷具有显著生理活性，有明显的抗肿瘤作用，但同时它作为一种剧毒药物，它的毒性对人体正常组织的副作用也常被报道和研究。它的毒性作用呈现一种剂量依赖关系，减少它的用量是一种可行安全的办法，但同时又要发挥它对肿瘤组织的细胞毒性作用。因此，除了选择合适的给药途径外，研究如何减少As₂O₃剂量和相应的毒、副作用，同时又要提高As₂O₃药效，制剂的制备显得尤为重要。

近十几年来，对三氧化二砷的研究的成果比较多，例如CN200380105498.8公开了三氧化二砷的口服组合物的制剂及其使用方法。又如CN01107536.8公开了治疗恶性淋巴瘤的药物及其配制方法。再如CN98813016.5公开了三氧化二砷制剂生产法及用三氧化二砷或米拉索普治癌法。以上列举的三个专利，所配制的三氧化二砷组合物的方法基本相同，其步骤：均采用氢氧化钠溶解，其溶液用稀盐酸中和，并调节pH为7.0～7.2，三氧化二砷终浓度为1mg/ml。现有技术制备的三氧化二砷组合物由偏亚砷酸钠(NaAsO₂)、三氧化二砷和氯化钠组成。其中CN01107536.8研究结果表明，采用人恶性B淋巴瘤细胞Raji细胞，细胞密度为2.0×10⁵/ml，经As₂O₃浓度0.5、1.0、2.0μmol/L作用24、48、72小时，所测活性细胞数，反映0.5～2.0μmol/L As₂O₃抑制细胞生长，并呈现剂量依赖效应；但对人T淋巴瘤细胞株jurkat细胞，细胞密度为2.0×10⁵/ml，As₂O₃浓度(0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)不抑制细胞生长。

近几年来，已经有许多报道显示，三氧化二砷与其他化疗或非化疗药物联用能增强它的效果，发生协同效应，从而减少三氧化二砷剂量和相应的毒、副作用，使它的使用变得更加安全，更加能够拓展三氧化二砷治疗谱。如CN200310104509.2公开了大黄有效成分在制备增强As₂O₃诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用；如CN200810177336.X公开了一种抑制乳腺癌细胞体外生长和治疗乳腺癌的药物；一种治疗乳腺癌的药物，它包括三氧化二砷和粉防己碱两种组分，三氧化二砷和粉防己碱两药联合使用时可以降低三氧化二砷毒性，效果优于单独用药；在一定浓度范围内，联合用药产生协同作用。如CN201110089819.6公开了三氧化二砷与南天竹子配伍的药物组合物及其制备和用途。以上列举的三个专利均未见公开三氧化二砷的制备方法。

苏木为豆科云实属植物，其干燥心材，味甘、咸、微辛，入心、肝、脾，是一种传统中药材，资源丰富，用途广泛。具有舒筋通络、活血散结、镇静、祛痰等功效，收载于中华人民共和国药典一部。

关于苏木的化学成分研究，据日本学者永井正博等人研究报道：苏木中酚性成分为其主要药效作用的物质基础，其包括查耳酮类、巴西苏木素类、原巴西苏木素类、高异黄酮类衍生物，巴西苏木素类化合物是苏木中的主要活性成分，巴西苏木素类包括巴西苏木素(BrazilinC₁₆H₁₄O₅)与巴西苏木红素(Brazilein C₁₆H₁₂O₅)。近几十年来，国内外研究发现苏木除传统药效外还具有免疫抑制、抗氧化性、抗菌、抗补体、抗肿瘤等新的药理活性。如CN01127907.9公开了用于抗器官移植急性排斥反应的单味药-苏木水提物，其可延长移植心脏的存活时间，减轻排斥反应对器官所致的免疫损伤。

现有技术提取巴西苏木红素：

如CN201010183648.9公开了苏木提取物制备灌注液制备工艺及其在治疗膀胱癌上的用途，该专利公开方法是：取苏木粉碎，三次水提，合并三次提取液，减压浓缩；静置过夜，除去沉淀；再加入石油醚，萃取，保留水相；再加入乙酸乙酯，萃取，去掉水相；减压挥发尽乙酸乙酯；干燥物称重，加纯化水，使干物质含量为2％，加热溶解，室温静置过夜，过滤除去沉淀物；冻干，分装。如CN200710122084.6公开了药物化合物巴西苏木红素制备方法和用途，该专利公开方法是：1)将苏木心材，采用碱水溶剂进行加热提取，得到提取液；2)将提取液在室温下加酸，使pH值为2-6，离心或静止过滤，弃去上清液，取沉淀物，然后干燥，得干燥物；3)将干燥物用醇溶解，进行色谱分离，即制得巴西苏木红素。

如CN201110117851.0公开了一种巴西苏木红素的提纯方法，该专利公开方法是：将苏木粉碎，加入提取罐中，以乙醇液为溶媒采用连续逆流法提取，提取液浓缩至浸膏，用乙酸乙酯溶解，溶液与硅胶拌匀，低温烘干后加入石油醚中，回流提取3-5次，滤出硅胶，再加入乙酸乙酯回流提取3-6次，提取液除溶后得到巴西苏木红素粗品，最后采用高效制备液相色谱法纯化，收集目标洗脱液，蒸干即得产品。

现有技术提取巴西苏木素：

如CN200410044111.9公开了苏木有效部位群的药物新用途，其制备方法：采用热回流提取，将苏木粗粉，用75％乙醇浸泡，加热至85℃，连续回流提取，过滤；反复2次，将滤液合并，减压浓缩，真空干燥，制成乙醇提取物干粉。将乙醇提取物干粉加入双蒸水混悬，用乙酸乙酯进行萃取，静止，分出上层乙酸乙酯层，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层。减压回收乙酸乙酯，浓缩液放入真空干燥箱中减压干燥，得到乙酸乙酯提取物干粉。

又如赵莉莉硕士论文(2011年5月)公开了对苏木抗癌有效成分分析及其对膀胱癌细胞抑制作用的研究。苏木提取物的制备方法：称取苏木，用蒸馏水或乙醇或甲醇，常压回流1h，提取4次，合并提取液，减压浓缩，离心、过滤，滤液加入等体积石油醚脱脂2次，水相加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压蒸干溶剂(即得)。苏木抗癌有效成分对体外培养的膀胱癌细胞的增生抑制及诱导凋亡作用；巴西木素是苏木中主要抗癌有效成分之一，经鉴定该化合物为巴西木素，分子式：C16H14O5，分子量：286.28。

综上，现有技术中以苏木心材为原料，提取、制备巴西苏木红素制剂的方法占极大多数(是按从苏木中提取物的标题计数为多数)，而制备巴西苏木素制剂的方法占极少数。现有工艺流程繁琐，处理周期长，且收率低，不利于工业化生产。并且，现有技术对苏木中主要两种活性组分均只提取其中一种活性组分，或巴西苏木红素，或巴西苏木素。如果没有分别提取巴西苏木红素、巴西苏木素为主要成分的两个组分，就会在主要两种组分中丢失其中一种活性组分，不但会影响药物的效果，而且会因提取工艺、方法等问题而影响提取物的得率。因此，亟需开发一种新的制备苏木有效部位制剂的新方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供砷化合物与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的联合用药物中的应用，其药效优于单独给药。

本发明的第二个目的是提供一种用于治疗肿瘤的联合用药物。

下面对本发明采用的技术方案进行具体说明。

本发明提供了砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的联合用药物中的应用，所述的砷化合物溶液通过如下方法制得：取As₂O₃粉末加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解；

所述巴西苏木素类化合物由巴西苏木素和巴西苏木红素组成，所述的巴西苏木素类化合物的制备方法包括：

(1)以经过粉碎的苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木心材与蒸馏水或去离子水的质量比为1:2-8，在90～100℃下提取0.75～1h，过滤得到苏木水提液，浓缩至苏木水提液总体积的1/6-1/20，得苏木浓缩液；将苏木浓缩液放置过夜形成结晶沉淀，分离上层清液和沉淀A，清液中再加入用量为清液体积的3～5倍的95％乙醇，放置过夜，离心去杂，浓缩回收乙醇，喷雾干燥，得巴西苏木红素；

(2)将沉淀A采用乙醇溶解，置于旋转蒸发器中浓缩，真空干燥，将乙醇干燥物加入去离子水混悬，用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂后，加热水溶解，过滤，取滤液，静置，重结晶得到巴西苏木素。

进一步，所述巴西苏木素类化合物与砷化合物的质量比以各自的制备原料(即苏木心材与As₂O₃粉末)的质量之比计大于50。本发明中，由于砷化合物具有毒性，而巴西苏木素类化合物无毒性，因此在联合使用时，一般需尽量减少砷化合物的用量，在砷化合物用量一定的情况下，增加巴西苏木素类化合物的用量是有利的。

本发明在砷化合物溶液的制备中，使用的As₂O₃粉末的纯度为95％～99.9％。在制备悬浮液时，一般使得每mL无菌去离子水中加入5～30mg As₂O₃粉末。本发明采用氢氧化钠溶液溶解As₂O₃，推荐溶解As₂O₃的NaOH溶液的浓度为3～6mol/L，优选为3～4mol/L，该浓度的氢氧化钠可使得As₂O₃完全溶解。本发明所述的砷化合物溶液，在分装制剂时，可根据通过加入无菌去离子水和稀氢氧化钠溶液(0.1～1.0mol/L，优选0.2～0.3mol/L)以调节溶液浓度和pH值，例如使所得砷化合物溶液的浓度以投料的As₂O₃计为1～20mg/ml以及pH值为7.2～7.3。本发明在砷化合物溶液的制备过程中不使用盐酸。

本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的联合用药物，由砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物的不同规格的单位制剂组成，所述的砷化物溶液通过如下方法制得：取As₂O₃粉末加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解；

进一步，所述巴西苏木素类化合物与砷化合物的质量比以各自的制备原料(即苏木心材与As₂O₃粉末)的质量之比计大于50。本发明中，由于砷化合物具有毒性，而巴西苏木素类化合物无毒性，因此在联合使用时，需尽量减少砷化合物的用量，在砷化合物用量一定的情况下，增加巴西苏木素类化合物的用量是有利的。

所述的单位制剂为常见的剂型，如注射剂、介入剂、冲剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、微囊剂、软胶囊剂、栓剂、膜剂、膏剂、配剂、气雾剂、各种外用制剂等，优选注射剂或介入剂。所述的单位制剂可根据常规的制剂工艺由砷化合物或巴西苏木素类化合物及其药学上可接受的载体分别制成。

所述的联合用药物可用于治疗肿瘤，如淋巴瘤(具体例如人Burkitt淋巴瘤、人T细胞淋巴瘤等)、实体肿瘤(如呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、表皮组织肿瘤等)；也可用于治疗自身免疫病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)、本发明在配制砷化合物溶液过程中不加入盐酸，制得的砷化合物由偏亚砷酸钠(NaAsO₂)和三氧化二砷组成，分子结构明确，而且药物疗效显著，该溶液经与中国专利CN1370540A对比药效的结果显示，不仅对于人B淋巴瘤细胞具有抑制作用，而且对人T淋巴瘤细胞也具有显著的抑制作用。本发明所制备的砷化合物溶液的药效好，较现有制备的砷化合物技术更具有优势。

2)、本发明将砷化合物、巴西苏木素类化合物合用，可以提高砷化合物疗效，控制砷化合物剂量和相应的毒、副作用，使它的使用变得更加安全，拓展砷化合物治疗谱，尤其在抗T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞方面表现出良好的协同作用。

附图说明

图1-A为苏木水提液的浓缩液放置形成结晶沉淀，将形成结晶沉淀后的苏木浓缩液分离成二部分；该图为苏木浓缩液的上层部分；

图1-B为放置形成结晶沉淀部分的结晶，采用乙醇溶解、乙酸乙酯萃取，取萃取液置于旋转蒸发器中浓缩，回收溶剂后，加水溶解，静置重结晶，重结晶的溶解液。

图2为A、B两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat细胞的凋亡作用柱形图。

图2中分组：

1、不加药对照；

2、加苏木不同剂量(以苏木原料重量计算，100、200、400、800μg∕ml)；

3、加砷化合物(以As₂O₃剂量计算，下面相同)As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8、1.6μg∕ml)；

4、As₂O₃0.4μg∕ml+苏木不同剂量(100、200、400μg∕ml)；

5、加苏木100μg∕ml+As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8μg∕ml)；

6、加苏木200μg∕ml+As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8μg∕ml)

图3-1～图3-18为流式细胞仪测定砷化合物(以As₂O₃剂量计算μg/ml，以下简称A)或∕和苏木(以下简称B)A、B两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat细胞的凋亡作用的细胞凋亡图，其中：

图3-1：不加药对照；

图3-2～图3-5：分别对应加苏木不同剂量(100、200、400、800μg∕ml)；

图3-6～图3-9：分别对应加砷化合物(以As₂O₃剂量计算)As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8、1.6μg∕ml)；

图3-10-图3-12：分别对应As₂O₃0.4μg∕ml+苏木不同剂量(100、200、400μg∕ml)；

图3-13～图3-15：分别对应加苏木100μg∕ml+As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8μg∕ml)；

图3-16-图3-18：分别对应加苏木200μg∕ml+As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8μg∕ml)。

图4-1-A、4-1-B、4-1-C、4-2-A、4-2-B、4-2-C、4-3-A、4-3-B、4-3-C、4-4-A、4-4-B、4-4-C、4-5-A、4-5-B、4-5-C为砷化合物单用及合用苏木水提取液(简称A、B两个药物)对T淋巴细胞瘤jurkat细胞线粒体的影响。其中，图号中4-X(X＝1-5)表示五个组别：图4-1为对照组的细胞线粒体；图4-2为As₂O₃ 0.4μg/ml；图4-3为As₂O₃ 0.8μg/ml；图4-4为苏木200μg/ml；图4-5为苏木200μg/ml+As₂O₃ 0.4μg/ml；利用荧光显微镜同时在同一视野下拍照片，分别为常规滤光、红色荧光、绿色荧光，利用荧光显微镜对每一个样品，分别在同一视野下拍照片，分别为常规滤光、红色荧光、绿色荧光A、B、C图三张(照片)，即图号末尾的A、B、C分别表示该样品获得的常规滤光、红色荧光、绿色荧光照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。

实施例一：砷化合物溶液的制备

精确称质量1000mg纯度为99.9％的As₂O₃粉末倒入装有200ml无菌去离子水的烧瓶中，As₂O₃呈悬浮液，通过加热、滴加4mol/L NaOH至粉末完全溶解后，加无菌去离子水750ml，再用0.3mol/L NaOH调节溶液至pH至7.3，并用无菌去离子水补足体积至1000ml的砷化合物溶液，浓度以投料As₂O₃计为1mg/ml。制备的As₂O₃溶液采用过滤法(通过0.22μm的过滤器)进行除菌并储藏在消毒小瓶中。

实施例二：巴西苏木素类化合物的制备

1)、巴西苏木红素的制备

将经过粉碎的中药苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木与蒸馏水或去离子水的质量比为6倍的比例，在95℃下提取1h；提取3次，合并提取液，采用240目筛或滤网过滤、用中速或快速定性滤纸过滤或置于布氏漏斗上，利用真空泵对苏木提取液进行抽滤，得到苏木水提液；将苏木水提液置于旋转蒸发器中或电炉上浓缩，浓缩至苏木提取液的总体积1/15，得苏木浓缩液；浓缩液放置过夜形成结晶沉淀，分离上层苏木浓缩液和结晶沉淀A，再加入上层苏木浓缩液体积的4倍体积的95％乙醇，放置过夜，离心去杂，转速为2500一3500r/min，20min，再置于旋转蒸发器中浓缩、回收乙醇，将上层苏木浓缩液置于160-180℃下喷雾干燥，得巴西苏木红素粉末，其化学成分为以巴西苏木红素为主的巴西苏木素类化合物，多酚含量6.8～7.9％。

2)、巴西苏木素的制备

将结晶沉淀A采用乙醇溶解、置于旋转蒸发器中浓缩，真空干燥，将乙醇干燥物加入去离子水混悬，乙酸乙酯萃取，取萃取液浓缩回收溶剂后，加热水溶解，置于抽滤器上过滤除去杂质，取出滤液，静置重结晶，干燥即得巴西苏木素粉末，其化学成分以巴西苏木素为主的巴西苏木素类化合物，多酚含量1～2％。

实施例三：采用实施例一制备的砷化合物与实施例二步骤1)制备的苏木水提液(由于水提液中组分即为所述的巴西苏木素类化合物，故以该苏木水提液来进行体外实验)诱导肿瘤细胞凋亡作用进行体外实验。

1、试验材料

1)细胞株：从T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞、B淋巴瘤细胞株Daudi细胞、肝癌细胞HEPG2三种细胞株中选出T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞进行实验。

2)药物：砷化合物(配制方法为：由实施例1制得的砷化合物溶液，先用去离子水稀释到80μg/ml，再用1640培养液稀释到所需浓度)；实施例二步骤1)制得的苏木水提取液(用1640培养液稀释到所需浓度)。

2、实验方法及步骤

1)细胞培养

接种处于指数生长的人T淋巴细胞瘤株jurkat细胞于24孔板培养，每孔接种为1ml，细胞密度为2χ10⁵/ml置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，进行药效实验。(药效实验分组见表2)药物作用24、48、72h，分别取细胞悬液经0.4％台盼蓝液染色作存活细胞、死亡细胞计数。

实验经砷化合物、苏木水提取液的不同浓度，分别对3种肿瘤细胞(T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞、B淋巴瘤细胞株Daudi细胞、肝癌细胞HEPG2)进行细胞毒作用实验。在实验选定的砷化合物、苏木水提取液的不同剂量下单用与合用在3种细胞中分别有效，同时，比较了3种肿瘤细胞对砷化合物、苏木水提取液的敏感性，从中选择了对砷化合物、苏木水提取液的药效相对不敏感的T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞作为主要药效学实验。进行了砷化合物(简称A)、苏木水提取液(简称B)A、B两个药物对T淋巴细胞Jurkat细胞毒作用体外实验；

2)药效分组

1、不加药对照；2、加苏木不同剂量(以苏木原料重量计算100、200、400、800μg∕ml)；

4、As₂O₃0.4μg∕ml+苏木不同剂量(100、200、400μg∕ml)；

5、加苏木100μg∕ml+As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8μg∕ml)；

6、加苏木200μg∕ml+As₂O₃不同剂量(0.2、0.4、0.8μg∕ml)

3)实验指标测定

①AnnexinV/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡

取处于对数生长期的人T淋巴细胞瘤株jurkat细胞接种于6孔板，每孔接种为3ml，细胞密度为2χ10⁵/ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，(药效分组同前)培养44h后，分别取jurkat细胞1χ10⁶个/ml的实验组与对照组的细胞，用PBS洗2次，1000r/min，5min，弃上清液，在每100μl细胞悬液中加入AnnexinV/PI试剂双染色(操作按试剂盒方法)制备完实验样品，进行流式细胞仪对AnnexinV/PI双染色细胞检测。

3、实验结果

表1、流式细胞仪测定两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat的抑制作用

表2A、B两个药物合用对T淋巴细胞瘤jurkat抑制作用的Q值

根据表1、流式细胞仪测定两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat的抑制作用，计算A、B两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat的凋亡的结果。Q值计算方法，根据专利(申请号2008 10177336.X)公开的选用金氏公式计算。联合用药的结果有三个，包括相加作用，拮抗作用和协同作用。根据金氏公式：Q＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea x Eb)来判断合用效果，其中Ea+b为合并用药的抑制率，Ea和Eb分别为A药，B药单独用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母代表“期望合并效应”,Q值是两者之比。当Q＝0.85～0.55是拮抗作用，Q<0.55为明显拮抗；当0.85<Q<1.是相加的作用；当Q＝l.15～2.0是协同作用，Q>2.00为明显协同。对实验数据经过计算，结果如下：

1)、流式细胞仪测定A、B两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat细胞的凋亡有协同作用。

(1)固定中药A剂量0.4μg/ml+B不同剂量100、200、400μg/ml，Q≥1.15；

(2)固定中药B剂量100μg/ml+A不同剂量0.2、0.4、0.8μg/ml，Q≥1.15；

(3)固定中药B剂量200μg/ml+A不同剂量0.2、0.4、0.8μg/ml，Q≥1.15。

双标法检测凋亡实验结果显示,药物组与对照组相比,早期凋亡加凋亡率明显高于对照组，联合用药高于单独用药，且A、B两个药物对T淋巴细胞瘤jurkat细胞的凋亡有协同作用。见表1、表2、与柱状图(图2、)及流式细胞仪测定的细胞凋亡图(图3-1～图3-18):

2)细胞线粒体观察：采用碧云天线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)按说明书操作。其是以一种JC-1荧光探针标记后即可在荧光显微镜下分别使用常规滤光片、红色荧光和绿色荧光观察结果、拍片。

测定原理：该JC-1荧光探针用以检测细胞内线粒体膜电位，在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光，在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集或减少聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体形式产生绿色荧光。通过JC-1从红色荧光到绿色光的转变可以检测到细胞膜电位的下降，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志。

实验分别取对照组、实验组悬浮培养24h的细胞悬液100μl，(采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)按说明书操作)，离心、洗涤、将洗涤后的样品，固定体积量，混匀，吸取同样体积的细胞悬液，分别涂布于玻璃片上相同的面积，利用荧光显微镜观察，分别在同一视野下拍常规滤光、红色荧光、绿色荧光A、B、C三张照片。

实验结果：

砷化合物单用及合用苏木水提取液(简称A、B两个药物)对T淋巴细胞瘤jurkat细胞线粒体的影响。

图中分组：图4-1-A、图4-1-B、图4-1-C为对照组的细胞线粒体；图4-2-A、图4-2-B、图4-2-C为As₂O₃0.4μg/ml；图4-3-A、图4-3-B、图4-3-C为As₂O₃0.8μg/ml；图4-4-A、图4-4-B、图4-4-C为苏木200μg/ml；图4-5-A、图4-5-B、图4-5-C为苏木200μg/ml+As₂O₃0.4μg/ml。

结果显示，图4-1-A、4-1-B、4-1-C为不加药物的对照组，A图中细胞数多，细胞形态铇滿，有立体感；红色荧光的JC-1聚集在细胞内密度增高的细胞数多；绿色荧光密度就相对降低。图4-2-A、4-2-B、4-2-C为As₂O₃浓度0.4μg/mɡ组，与对照组细胞比较：A图细胞数明显减少，而且细胞体积明显缩小、细胞形态较扁平；红光荧光的JC-1聚集在细胞内密度降低，绿色荧光的JC―1聚集在细胞内密度就相对增高。图4-3-A、4-3-B、4-3-C为As₂O₃浓度0.8μg/ml组，与图4-2比较：A图中细胞数明显减少，细胞体积明显缩小；红光荧光的JC―1聚集在细胞内密度降低；绿色荧光的JC―1聚集在细胞内密度就相对增高。图4-4-A、4-4-B、4-4-C为苏木200μg/ml组，与图4-2As₂O₃浓度0.4μg/ml组比较，A图中细胞形态比较铇滿，存活下来的细胞，红光荧光的JC―1聚集在细胞内密度比图4-2As₂O₃浓度0.4μg/ml组明显增加，接近对照组细胞，绿色荧光的JC―1聚集在细胞内密度减少。图4-5-A、4-5-B、4-5-C为苏木200μg/ml+As₂O₃0.4μg/ml，①与图4-2As₂O₃浓度0.4μg/ml组比较，A图中细胞形态较铇滿，存活下的细胞，红光荧光的JC―1聚集在细胞内密度同样也比图4-2明显增加，②与图4-4苏木200μg/ml组比较，A图中细胞数、细胞形态均不如图4-4，但是红光荧光的JC―1聚集在细胞内密度与其较接近，同样也比图4-2明显增加，几乎接近对照组细胞，但绿色荧光的JC―1聚集在细胞内密度增高比例相对较多。

通过对细胞毒作用的细胞线粒体观察：探讨砷化合物(简称A)、苏木水提取液(简称B)A、B两个药物抑制人T淋巴瘤细胞株jurkat细胞增殖和诱导凋亡的机理：

砷是一种细胞原浆毒，三价砷是巯基(-SH)的络合剂，与酶分子内的巯基作用后可抑制其活性。线粒体对砷剂的作用最敏感的细胞器，三价砷消耗了线粒体内亲水的巯基后，干扰了线粒体内的离子平衡以及产生氧化产物，从而干扰了线粒体的能量代谢，引起细胞功能的紊乱。

线粒体是细胞生存的能量库，通过对以上实验结果分析进一步说明，As₂O₃抑制人T淋巴瘤细胞株jurkat细胞增殖和诱导凋亡的机理，可能是As₂O₃通过使线粒体膜电位降低、崩塌并诱导细胞凋亡。苏木水提取液可能通过其它途径诱导细胞凋亡，其诱导凋亡的机理有待进一步研究。

实施例四

精确称质量120mg纯度为99.9％的As₂O₃粉末倒入装有8ml无菌去离子水的烧瓶中，As₂O₃呈悬浮液，通过加热、滴加1mol/L NaOH至粉末完全溶解后，再用0.1mol/L NaOH调节溶液至pH至8.4，并用无菌去离子水补足体积至最终为15ml的砷化合物溶液，浓度以投料As₂O₃计为8mg/ml。

实施例五：药效学实验

选用实施例四制备的砷化合物溶液进行体外抗T淋巴细胞、B淋巴细胞药效实验研究：

1、细胞培养

人淋巴瘤细胞株细胞用含10％新生牛血清的RPMI1640培养基培养，置于5％CO₂培养箱、37℃饱和湿度培养，每1～2天更换1次培养液。待细胞生长良好，细胞数达到相应数目后进行药物干预。

2、实验分组

2.1、

将生长良好的人B淋巴瘤细胞株Daudi细胞于24孔板培养，每孔接种为1ml，细胞密度为1.5χ10⁵/ml，分为实验组与对照组，实验组分为0.1、0.2、0.4、0.8μg/ml As₂O₃组(各组先由实施例四制得的砷化合物溶液先用去离子水稀释到80μg/ml，再用1640培养液稀释到所需浓度)；对照组加入等体积的培养液。置于5％CO₂培养箱、37℃饱和湿度培养至预定时间后进行相应检测。分别取细胞悬液经0.3％台盼蓝生理盐水液染色作存活、死亡细胞计数，结果如表3所示：

表3不同浓度的三氧化二砷对Daudi细胞增殖的抑制作用

表3结果表明，As₂O₃可明显降低恶性B淋巴瘤细胞株Daudi细胞活力，抑制B淋巴瘤细胞株Daudi细胞生长，出现细胞凋亡的形态学改变，呈现剂量依赖效应。

2.2、

接种处于指数生长的人T淋巴细胞瘤株jurkat细胞于24孔板培养，每孔接种为1ml，细胞密度为2χ10⁵/ml置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，jurkat细胞经砷化合物(以As₂O₃浓度(mg/ml)计算)终浓度为0、0.2、0.4、0.8μg/ml(配制方法为：先由实施例四制得的砷化合物溶液先用去离子水稀释到80μg/ml，再用1640培养液稀释到所需浓度)作用24、48、72h，分别取细胞悬液经0.3％台盼蓝生理盐水液染色作存活、死亡细胞计数，结果如表4所示：

表4不同浓度的三氧化二砷诱导jurkat细胞增殖的抑制作用

表4结果表明，砷化合物对人T淋巴瘤细胞株jurkat细胞增殖有明显抑制作用。同一时间段24h存活细胞数死亡率与浓度相关系数分别为-0.978、0.981；存活细胞数与浓度负相关(P<0.05)，死亡率与浓度正相关(P<0.05)；48h存活细胞数死亡率与浓度相关系数分别为-0.961、0.994，存活细胞数与浓度负相关(P<0.05)，死亡率与浓度正相关(P<0.01)；正常细胞随着培养时间延长至72h时，因营养跟不上而影响正常细胞增殖，如48h比24h增殖47％，但是72h比48h只增殖20％，使得72h活细胞数死亡率与浓度相关系数下降，分别为-0.819、0.905。不同浓度的砷化合物作用后的死亡率与时间24、48、72h的相关系数分别为0.969、0.965、0.980、0.984，死亡率与时间正相关(P<0.05)，死亡率与时间呈依赖性。

同时，表3和表4的结果比较还显示，人B淋巴瘤细胞株Daudi细胞对As₂O₃诱导细胞死亡比人T淋巴瘤细胞株jurkat细胞更敏感。

对比实施例

中国专利CN1370540A研究结果表明，采用人恶性B淋巴瘤细胞Raji细胞，细胞密度为2.0×10⁵/ml，经As₂O₃浓度0.5、1.0、2.0μmol/L作用24、48、72小时，所测活性细胞数，反映0.5～2.0μmol/L As₂O₃抑制细胞生长，并呈现剂量依赖效应；但对人T淋巴瘤细胞株jurkat细胞，细胞密度为2.0×10⁵/ml，As₂O₃浓度(0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)不抑制细胞生长；与中国专利CN1370540A比较：本发明所制备的砷化合物溶液除了对人B淋巴瘤细胞株Daudi细胞有抑制细胞生长外，同时对人T淋巴瘤细胞株jurkat细胞进行药效实验。实验采用的也是与中国专利CN1370540A同样的jurkat细胞株，相同的细胞密度为2.0×10⁵/ml、经相同的As₂O₃浓度(终浓度为0.2、0.4、0.8μg/ml)作用24、48、72h，所测活性细胞数，反映0.2－0.8μg/ml As₂O₃抑制细胞生长，死亡率与时间正相关(P<0.05)，死亡率与时间呈依赖性。研究结果表明，本发明所制备的砷化合物溶液较现有技术更具有优势。

Claims

1.一种砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物在制备治疗肿瘤的联合用药物中的应用，其特征在于：所述的砷化合物溶液通过如下方法制得：取As₂O₃粉末加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解；

(1)以经过粉碎的苏木心材为原料，以蒸馏水或去离子水为溶剂，苏木心材与蒸馏水或去离子水的质量比为1:2～8，在90～100℃下提取0.75～1h，过滤得到苏木水提液，浓缩至苏木水提液总体积的1/6～1/20，得苏木浓缩液；将苏木浓缩液放置过夜形成结晶沉淀，分离上层清液和沉淀A，清液中再加入用量为清液体积的3～5倍的95％乙醇，放置过夜，离心去杂，浓缩回收乙醇，喷雾干燥，得巴西苏木红素；

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述巴西苏木素类化合物与砷化合物的质量比以各自的制备原料苏木心材与As₂O₃粉末的质量之比计为大于50。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述砷化合物溶液的制备过程中不使用盐酸。

4.一种用于治疗肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述联合用药物由砷化合物溶液与巴西苏木素类化合物的不同规格的单位制剂组成，所述的砷化物溶液通过如下方法制得：取As₂O₃粉末加入到无菌去离子水中得到悬浮液，所得悬浮液滴加NaOH溶液直至粉末完全溶解；

5.如权利要求4所述的联合用药物，其特征在于：所述巴西苏木素类化合物与砷化合物的质量比以各自的制备原料苏木心材与As₂O₃粉末的质量之比计为大于50。

6.如权利要求4或5所述的联合用药物，其特征在于：所述砷化合物溶液的制备过程中不使用盐酸。