CN110559382B - 龙血竭提取物的制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种龙血竭提取物的制备方法及用途。所述龙血竭提取物的制备方法为：将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到所述龙血竭提取物。本发明的龙血竭提取物具有显著的抗肿瘤作用，因而具有制备抗肿瘤药物的用途。

Description

龙血竭提取物的制备方法及用途
技术领域
本发明涉及龙血竭提取物的制备方法，还涉及其用于制备抗肿瘤的药物的用途。
背景技术
龙血竭为百合科剑叶龙血树的树脂，主要分布在我国云南及东南亚国家，具有活血散瘀、定痛止血、敛疮生肌等功效，适用于跌打损伤、瘀血作痛、外伤出血等症。
有研究发现龙血竭75％乙醇粗提物能抑Cholangiocarcinoma细胞增殖并诱导HCCC9810和QBC939细胞系凋亡且成时间和浓度依赖性。龙血竭75％乙醇粗提物明显下调抗凋亡蛋白Survivin的表达及上调促凋亡蛋白Bak的表达，同时也抑制体内肿瘤生长。
CN1481788公开了一种龙血竭总黄酮制剂的制备工艺：龙血竭药材粉碎成粗粉，加6-10倍量乙酸乙酯回流提取2-3次，每次1-2小时，滤过，合并2次滤液，回收乙酸乙酯并浓缩至干；乙酸乙酯提取物粉碎成粗粉，以20-40倍提取物量的0.2-0.5％NaOH溶液搅拌20-40分钟使溶解，滤过；滤液用5-12％HCl调pH至1～2，静置8-24小时，倾出上清液，弃去；沉淀离心滤过，收集沉淀物，用去离子水洗至pH试纸检测为中性，60℃以下真空干燥，粉碎，即得龙血竭总黄酮。该方法制备方法复杂，除杂步骤繁琐。
CN101024604A公开了一种从龙血竭中分离纯化的二氢查耳酮化合物的制备方法，其特征在于具有以下的工艺过程和步骤：a.取一定量的龙血竭粉末为原料，用石油醚于索氏抽提器中在70℃抽提8～10小时；将残留物中的石油醚挥干后，再用氯仿于索氏抽提器中在60℃抽提8～12小时，提取液经减压旋转蒸发仪浓缩，并在40℃干燥，得氯仿提取物；b.将上述氯仿提取物再用甲醇溶解，加入一定量的粒度为200～300目的硅胶，搅拌均匀；待甲醇挥发后，将其研碎，上硅胶柱或快速硅胶柱；用石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱，即用石油醚-乙酸乙酯的体积比分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的混合溶剂进行洗脱；取8∶2和/或7∶3和/或6∶4的洗脱部分用减压旋转蒸发仪浓缩，随后在40℃下干燥，得石油醚-乙酸乙酯提取物；c.将上述提取物再用甲醇溶解后，用Sephadex LH-20凝胶柱层析，并以体积比为1∶1的氯仿-甲醇混合溶剂洗脱；洗脱溶剂总量为8～10个柱体积；收集过柱后的8～10个馏分，根据硅胶板点样分析结果，将第6～第8个馏分注入高效液相制备色谱仪纯化，弃去杂质峰，收集主成分峰；d.将上述纯化后所得馏分经旋转蒸发仪浓缩，在40～50℃下干燥后，即得新二氢查耳酮化合物。该方法得到氯仿提取段，经过复杂的纯化步骤，获得新二氢查耳酮化合物。
到目前为止，尚未见报道该龙血竭药材用石油醚除杂后的乙酸乙酯提取物具有抗肿瘤的用途。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种龙血竭提取物的制备方法，该制备方法操作简单，无需复杂的后续处理，获得的龙血竭提取物的化学成分更少而抗肿瘤效果显著。
本发明的另一目的在于提供上述龙血竭提取物用于制备抗肿瘤药物的用途。
本发明采用如下技术方案实现上述目的。
一方面，本发明提供一种具有抗肿瘤作用的龙血竭提取物的制备方法，包括如下步骤：将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到所述龙血竭提取物。
根据本发明的制备方法，优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将龙血竭药材用石油醚提取1～5次，固液分离，得到药渣；
(2)将所述药渣用乙酸乙酯提取1～5次，固液分离，合并乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶剂，得到所述龙血竭提取物。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，所述提取的方法为加热回流提取；每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比为0.001～0.05L/g，每次提取时间为0.5～5小时；步骤(2)中，所述提取的方法为加热回流提取；每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比为0.001～0.05L/g，每次提取时间为0.5～5小时。
另一方面，本发明还提供龙血竭提取物用于制备抗肿瘤的药物的用途，所述龙血竭提取物是采用上述制备方法制备得到的。
根据本发明的用途，优选地，所述药物以所述龙血竭提取物作为唯一活性成分。
根据本发明的用途，优选地，所述肿瘤选自神经胶质瘤、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌以及结肠癌中的至少一种。
根据本发明的用途，优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌以及胃癌中的至少一种。
根据本发明的用途，优选地，所述药物形成促进人癌细胞凋亡的药物制剂。
根据本发明的用途，优选地，所述药物形成抑制癌细胞的细胞迁移或细胞侵袭的药物制剂。
根据本发明的用途，优选地，所述药物形成抗血管形成的药物制剂。
本发明将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到龙血竭提取物。该提取部位富含酚类成分，主要包括黄烷类、高异黄烷类、二氢黄酮类、二苯乙烯类、黄酮多聚体类、小分子酚酸类、查耳烷及二氢查耳酮类等成分，抗肿瘤效果显著，且制备方法简单，无需复杂的后续处理。
附图说明
图1为0μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡效果的照片。
图2为20μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡效果的照片。
图3为40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡效果的照片。
图4为0μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡效果的照片。
图5为20μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡效果的照片。
图6为40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡效果的照片。
图7为0μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力效果的照片。
图8为10μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力效果的照片。
图9为20μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力效果的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
<龙血竭提取物的制备方法>
本发明的龙血竭提取物的制备方法，包括如下步骤：将龙血竭药材用石油醚除杂，所得药渣用乙酸乙酯提取，所得提取液浓缩、干燥，得到所述龙血竭提取物。
具体地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将龙血竭药材用石油醚提取1～5次，固液分离，得到药渣；
(2)将所述药渣用乙酸乙酯提取1～5次，固液分离，合并乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯溶剂，得到所述龙血竭提取物。
本发明中，优选地，步骤(1)中，所述提取方法可以为加热回流提取法、超声提取法或索氏提取法，更优选为回流提取法。每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比可以为0.001～0.05L/g，优选为0.003～0.03L/g，更优选为0.005～0.01L/g。每次提取时间可以为0.5～5小时，优选为1～3小时，更优选为1.5～2.5小时。
本发明中，优选地，在步骤(2)中，将所述药渣用乙酸乙酯提取，所述提取方法可以为加热回流提取法、超声提取法或索氏提取法，更优选为回流提取法。每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比可以为0.001～0.05L/g，优选为0.003～0.03L/g，更优选为0.005～0.01L/g。每次提取时间可以为0.5～5小时，优选为1～3小时，更优选为1.5～2.5小时。
根据本发明的一个具体实施方式，龙血竭提取物采用如下方法制备：(1)将龙血竭药材用石油醚回流提取1～3次，固液分离，得到药渣；每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比为0.005～0.01L/g，每次回流提取时间为1～3h；(2)将上述药渣用乙酸乙酯回流提取1～3次，合并乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液减压回收溶剂后，得到乙酸乙酯提取物即龙血竭提取物；每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比为0.005～0.01L/g，每次回流提取时间为1～3h。
<龙血竭提取物的用途>
本发明方法制得的龙血竭提取物具有显著的抗肿瘤作用，且对多种肿瘤具有抑制作用，因而可以用于制备抗肿瘤的药物。
本发明中，所述药物可以形成抗肿瘤的药物制剂；所述药物制剂包含所述龙血竭提取物，还包含药学上可接受的辅料。
本发明的龙血竭提取物对肿瘤细胞具有十分显著的细胞毒活性，能够明显促进肿瘤细胞凋亡的发生以及抑制肿瘤细胞的迁移侵袭能力，并且表现出良好的抗血管形成活性。本发明的龙血竭提取物对多种肿瘤细胞具有细胞毒活性，如人神经胶质瘤H4细胞、人黑色素瘤A875细胞、人宫颈癌Hela细胞、人肺癌NCI-H358细胞以及人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞、人胃癌HGC-27和MGC-803细胞，人乳腺癌MCF-7细胞，人结肠癌HCT-116细胞等。其中，本发明的龙血竭提取物对人肝癌HepG2细胞和SK-HEP-1细胞的细胞毒活性非常强。因此，本发明中，优选地，所述肿瘤选自神经胶质瘤、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌以及结肠癌中的至少一种。更优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、肝癌以及胃癌中的至少一种。再优选地，所述肿瘤为肝癌。
根据本发明的一个实施方式，所述药物形成抑制癌细胞体内成瘤能力的药物制剂。优选地，所述药物形成抑制肝癌细胞体内成瘤能力的药物制剂。
根据本发明的一个实施方式，所述药物形成促进癌细胞凋亡的药物制剂。优选地，所述药物形成促进肝癌细胞凋亡的药物制剂。
根据本发明的一个实施方式，所述药物形成抑制癌细胞迁移和癌细胞侵袭的药物制剂。优选地，所述药物形成抑制肝癌细胞迁移和肝癌细胞侵袭的药物制剂。
根据本发明的一个实施方式，所述药物形成抗血管形成的药物制剂。
本发明中，所述药物可以以所述龙血竭提取物作为唯一活性成分；也可以包含其他具有抗肿瘤的活性成分。根据本发明的一个实施方式，所述药物以所述龙血竭提取物作为唯一活性成分。
本发明中，所述抗肿瘤的药物可以为原料药，也可以为药物制剂。
本发明中，所述药物制剂的剂型不限，可以为片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂等。所述药物制剂还可以包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料的种类不做限制。辅料可以为填充剂、矫味剂、润滑剂等。填充剂又称稀释剂，例如小麦淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、糊精、乳糖等。矫味剂的实例包括但不限于蔗糖素、异麦芽酮糖、阿斯巴甜、安赛蜜等。润滑剂实例包括但不限于硬脂酸镁、滑石粉、微粉硅胶、月桂醇硫酸镁等。
实施例1龙血竭提取物的制备
(1)取950g龙血竭药材，用石油醚加热回流提取3次，每次石油醚的用量为8L，每次回流提取时间为2h，除去石油醚提取液，得到药渣。
(2)将上述药渣用乙酸乙酯加热回流提取3次，每次乙酸乙酯的用量为8L，每次回流提取时间为2h，合并乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液减压回收溶剂后，得到乙酸乙酯提取物，即龙血竭提取物600g。
实施例2
1.实验材料及测定指标
实施例1的龙血竭提取物(即乙酸乙酯提取物)。
DMEM基础培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液、0.25％胰蛋白酶、Matrigel胶和Transwell小室均购于美国康宁公司。
人神经胶质瘤H4细胞，人黑色素瘤A875细胞，人宫颈癌Hela细胞，人肺癌NCI-H358细胞，人胃癌HGC-27和MGC-803细胞，人乳腺癌MCF-7细胞，人结肠癌HCT-116细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。人肝癌SK-HEP-1和HepG2细胞，人脐静脉内皮细胞HUVEC购自美国ATCC。H4、A875、Hela、SK-HEP-1、HepG2、MGC-803、MCF-7、HUVEC细胞用DMEM完全培养基培养(含有10％的FBS、100U/ml青霉素、100g/mL链霉素)，人肺癌NCI-H358细胞用1640完全培养基培养(含有10％的FBS、100U/ml青霉素、100g/mL链霉素)，HCT-116细胞用McCoy’s 5A完全培养基培养(含有10％的FBS、100U/ml青霉素、100g/mL链霉素)，细胞培养条件为37℃，5％CO2，饱和湿度培养。
雄性BALB/c裸鼠：18g，年龄4-5周，购于北京维通利华公司。
OD(optical density)是指光密度，又叫通光率，表示被检测物吸收掉的光密度，OD＝lg(1/trans)，其中trans为检测物的透光值。
MTT法细胞增殖实验中细胞增殖抑制率的计算公式为：
细胞增殖抑制率(％)＝(1－实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％。
抑瘤率：肿瘤瘤体最大长度(a)、宽度(b)，根据公式V＝ab2/2，计算肿瘤体积变化倍数，则抑瘤率的计算公式为：
抑瘤率＝(1-治疗组肿瘤体积变化倍数/空白对照组肿瘤体积变化倍数)×100％。
2.实验方法
2.1龙血竭提取物抑制人肝癌HepG2细胞体内成瘤能力实验
取雄性BALB/c裸鼠24只，采用人肝癌HepG2细胞移植瘤模型评价龙血竭提取物的体内抗肿瘤活性。将人肝癌HepG2细胞培养至对数生长期，用不含EDTA的0.25％胰酶消化，PBS洗涤细胞两次，1000rpm离心5min，PBS调整细胞悬液浓度至2×107/ml，上述每只雄性BALB/c裸鼠项肩部皮下注射0.2ml。待肿瘤体积生长至100～200mm3左右时，将上述雄性BALB/c裸鼠随机平均分为三组，即空白对照组、龙血竭提取物治疗组和阳性药5-氟尿嘧啶组，每组8只。空白对照组雄性BALB/c裸鼠每天腹腔注射同体积的空白溶剂(空白溶剂为含0.5％CMCNa的PBS溶液)，龙血竭提取物治疗组雄性BALB/c裸鼠每天腹腔注射250mg/kg的人肝癌HepG2细胞悬液，阳性药5-氟尿嘧啶组雄性BALB/c裸鼠每天腹腔注射30mg/kg的5-氟尿嘧啶。上述给药每天一次，每日观察精神、饮食、活动、大小便等一般情况，定期观察，测定肿瘤的生长情况。每隔两天称量雄性BALB/c裸鼠的体重，用游标卡尺测量肿瘤瘤体最大长度(a)、宽度(b)，根据公式V＝ab2/2，计算肿瘤体积变化倍数，计算抑瘤率。各组雄性BALB/c裸鼠的体重变化参见表1。各组雄性BALB/c裸鼠的肿瘤生长情况参见表2。
2.2采用MTT法测定龙血竭提取物对多种人肿瘤细胞增殖活性的影响
取对数生长期的人神经胶质瘤H4细胞，人黑色素瘤A875细胞，人宫颈癌Hela细胞，人肺癌NCI-H358细胞，人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞，人胃癌HGC-27和MGC-803细胞，人乳腺癌MCF-7细胞，人结肠癌HCT-116细胞。将上述细胞分别制备细胞悬液，调整细胞数量为2.5×104～3.5×104个/mL，加入96孔板，每孔100μl；细胞培养24小时使其完全贴壁。将龙血竭提取物的母液用完全培养基分别稀释成10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL浓度，每个浓度设置5个复孔。分别于加药后24小时、48小时、72小时后，析出孔板中原来的培养基，析出孔板中原来的培养基，将5mg/ml MTT试剂用基础培养基配成10％的浓度并加入到96孔板中，将孔板放在37℃细胞培养箱中孵育4个小时。而后取出，轻轻吸出MTT，每孔加入150μl DMSO溶解震摇10min，于570nm波长下用酶标仪测定其OD值，并以公式计算各组细胞增殖的抑制率。龙血竭提取物对上述多种肿瘤细胞增殖活性的影响参见表3。
2.3龙血竭提取物能够促进人肝癌细胞的凋亡
2.3.1Hoechst染色法
取对数生长期的人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞，用完全培养基吹打成单细胞悬液接种在12孔板中，放在培养箱中培养24h使其贴壁后，分别加入浓度为0、20、40μg/mL的龙血竭提取物培养48h，用PBS清洗两次，用4％的多聚甲醛固定10min，用终浓度为1μg/ml的Hoechst 33258染液避光染色30min，置于倒置荧光显微镜下，观察，拍照。实验至少独立重复三次。0、20、40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡分别参见图1、2、3。0、20、40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡分别参见图4、5、6。
2.3.2流式细胞术测定法
人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞浓度分别为1x105/mL接种在6孔板中，过夜贴壁后，分别加入终浓度为0、20、40μg/mL的龙血竭提取物，培养48h，按Annexin V-FITC/PI检测试剂盒方法操作进行。简言之，以0.25％胰蛋白酶(不含EDTA)消化成单细胞悬液进行实验，使得收集的细胞总数约为1x106个/mL。用PBS洗细胞2次(1000rpm离心，5min)后收集细胞。加入300μL的Annexin V Binding Buffer悬浮细胞。加入5μL Annexin V–FITC和5μLPropidium Iodide混匀。避光，室温反应15min，流式细胞仪分析可得细胞凋亡率。龙血竭提取物对人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞的细胞凋亡率参见表4。
2.4龙血竭提取物能够抑制人肝癌细胞的迁移能力
人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞接种在12孔板中，待细胞处于亚融合状态时，换用无血清的DMEM基础培养基饥饿培养12h。用10μL的白色枪头垂直轻柔划痕，均匀用力。1XPBS清洗因划痕而飘起的细胞碎片，至少3次。拍照，作为加药前的空白对照组。用不含血清的基础培养基将龙血竭提取物稀释成0、10、20μg/mL的工作液，分别加入上述龙血竭提取物刺激细胞，划痕后12h、24h于相差显微镜下观察拍照，评价细胞迁移能力的大小。所选择的给药浓度(龙血竭提取物浓度)均在低细胞毒的范围内，进一步排除因细胞毒作用而致使细胞的迁移能力受到抑制的可能。龙血竭提取物对人肝癌细胞的迁移抑制率参见表5。
2.5龙血竭提取物能够抑制人肝癌细胞的侵袭能力
取对数生长期的人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞，更换培养液为无血清的培养液饥饿12h，以减少血清的干扰。将Transwell小室置于24孔板中，将Matrigel胶与细胞培养基按1:12比例混匀。取70μL均匀铺到Transwell小室的上室中，操作易轻柔，避免气泡产生。将铺好Matrigel胶的小室放在细胞培养箱内，时间控制在半小时到四小时之间，使胶凝固。将细胞消化后离心，用无血清培养基悬浮，细胞计数板计数5x105/mL，下室加入750μL含10％FBS的完全培养基，上室分别加入200μL无血清培养基的细胞悬液，并分别含有10μg/mL、20μg/mL的龙血竭提取物。于细胞培养箱内培养24h后，用棉签擦掉上室细胞，多聚甲醛通透4min，甲醇固定15min，结晶紫染色10min后用PBS冲洗小室，将染料去除，显微镜下取样，拍照。龙血竭提取物对人肝癌细胞的侵袭抑制率参见表6。
2.6龙血竭提取物抗肿瘤血管形成活性
血管内皮细胞可以在Matrigel胶上形成微管，可以利用血管内皮细胞的这种成管特性来研究药物对血管内皮细胞成管的作用。
取对数生长期的HUVEC细胞，以1x105/mL的细胞密度接种在6孔板中，过夜贴壁后，分别加入终浓度为0、10、20μg/mL的龙血竭提取物，培养24h。将4℃过夜化冻的Matrigel人工基质胶平铺于96孔板的孔底，每孔70μL，放于5％CO2、37℃恒温培养箱内30min使胶固化，处理过的各组HUVEC细胞用DMEM完全培养基稀释为密度为1X105/mL的细胞悬液，接种于上述铺好胶的96孔板，每孔200μL，常规培养10h，每隔2小时观察微管样结构形成情况，倒置显微镜下随机取5个视野拍照。实验重复三次。0、10、20μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力分别参见图7、8、9。
3.实验结果及结论
3.1龙血竭提取物能够抑制人肝癌HepG2细胞体内成瘤能力
各组雄性BALB/c裸鼠的体重变化参见表1。各组雄性BALB/c裸鼠的肿瘤生长情况参见表2。
表1各组雄性BALB/c裸鼠的体重变化
Figure BDA0002248027770000121
表2各组雄性BALB/c裸鼠的肿瘤生长情况
Figure BDA0002248027770000131
由表1可知，龙血竭提取物能够明显抑制肝癌HepG2细胞体内成瘤能力，其肿瘤抑制率为33.59％。由表2可知，体重数据显示龙血竭提取物没有明显改变雄性BALB/c裸鼠的体重。
3.2采用MTT法测定龙血竭提取物对多种人肿瘤细胞增殖活性的影响
龙血竭提取物对上述多种肿瘤细胞增殖活性的影响参见表3。
表3龙血竭提取物对多种肿瘤细胞增殖活性的影响
Figure BDA0002248027770000141
由表3可知，随着药物浓度的增加，龙血竭提取物对人神经胶质瘤H4细胞，人黑色素瘤A875细胞，人宫颈癌Hela细胞，人肺癌NCI-H358细胞，人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞，人胃癌HGC-27和MGC-803细胞，人乳腺癌MCF-7细胞，人结肠癌HCT-116细胞的增殖抑制率越来越大。由此可以看出，龙血竭提取物对上述人肿瘤细胞有明显的增殖抑制作用。
3.3龙血竭提取物能够促进人肝癌细胞的凋亡
3.3.1 Hoechst染色法
0、20、40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌HepG2细胞的凋亡分别参见图1、2、3。0、20、40μg/mL的龙血竭提取物促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡分别参见图4、5、6。
由图1～3可知，随着药物浓度的上升，龙血竭提取物对人肝癌HepG2细胞的细胞凋亡率逐渐升高，这说明龙血竭提取物能够显著促进人肝癌HepG2细胞的凋亡。
由图4～6可知，随着药物浓度的上升，龙血竭提取物对人肝癌SK-HEP-1细胞的细胞凋亡率逐渐升高，这说明龙血竭提取物能够显著促进人肝癌SK-HEP-1细胞的凋亡。
3.3.2流式细胞术测定法
龙血竭提取物对人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞的细胞凋亡率参见表4。
表4龙血竭提取物对人肝癌细胞的细胞凋亡率
Figure BDA0002248027770000151
由表4可知，随着药物浓度的上升，龙血竭提取物对人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞的细胞凋亡率逐渐升高，这说明龙血竭提取物对人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞的细胞凋亡率与龙血竭提取物剂量成正相关。由此可见，龙血竭提取物能够显著促进人肝癌SK-HEP-1和SK-HEP-1细胞的凋亡。
3.4龙血竭提取物能够抑制人肝癌细胞的迁移能力
龙血竭提取物对人肝癌细胞的迁移抑制率参见表5。
表5龙血竭提取物对人肝癌细胞的迁移抑制率
Figure BDA0002248027770000161
由表5可知，随着药物浓度的升高，人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞划痕愈合能力逐渐减弱。这说明，龙血竭提取物可以在细胞毒较低的浓度范围内较好地抑制肿瘤细胞的迁移。
3.5龙血竭提取物能够抑制人肝癌细胞的侵袭能力
龙血竭提取物对人肝癌细胞的侵袭抑制率参见表6。
表6龙血竭提取物对人肝癌细胞的侵袭抑制率
Figure BDA0002248027770000162
由表6可知，随着给药浓度的升高，人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞穿越小室的细胞数目均逐渐下降。这说明，龙血竭提取物对人肝癌HepG2和SK-HEP-1细胞的侵袭能力具有较好的抑制作用。
3.6龙血竭提取物抗肿瘤血管形成活性
0、10、20μg/mL的龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成能力分别参见图7、8、9。
由图7～9可知，随着药物浓度的上升，龙血竭提取物抑制HUVEC的微管形成的阻断效果逐渐加强，这说明龙血竭提取物抑制HUVEC微管形成的阻断效果很明显。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (3)

1.龙血竭提取物用于制备抗肿瘤的药物的用途，所述龙血竭提取物采用如下方法制备：
(1)将龙血竭药材用石油醚回流提取1～3次，固液分离，得到药渣；每次石油醚的体积与所述龙血竭药材质量的比为0.005～0.01L/g，每次回流提取时间为1～3h；
(2)将上述药渣用乙酸乙酯回流提取1～3次，合并乙酸乙酯提取液，将乙酸乙酯提取液减压回收溶剂后，得到乙酸乙酯提取物即龙血竭提取物；每次乙酸乙酯的体积与所述药渣质量的比为0.005～0.01L/g，每次回流提取时间为1～3h；
其中，所述肿瘤选自神经胶质瘤、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、胃癌、乳腺癌以及结肠癌中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物以所述龙血竭提取物作为唯一活性成分。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。
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