CN105434482B - 一种雪松松针总黄酮的富集方法及其在抗肿瘤中的应用 - Google Patents

一种雪松松针总黄酮的富集方法及其在抗肿瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种雪松松针总黄酮的富集方法，该方法包括以下步骤：⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；该干燥的雪松松针经回流提取、过滤，得到雪松松针提取液；⑵雪松松针提取液经减压回收，得流浸膏；⑶流浸膏分散于水中，经超声溶解、离心分离，得到雪松松针总黄酮粗提液；⑷大孔树脂湿法装柱后，将雪松松针总黄酮粗提液调pH至3~6，然后上样，上样完成后先用水洗除杂，然后用体积浓度为60~90%的乙醇洗脱，收集洗脱液；⑸洗脱液经减压浓缩、干燥，即得含量超过50%的雪松松针总黄酮。本发明还公开了该总黄酮在抗肿瘤中的应用。本发明方法简单、易于实施。

Description

一种雪松松针总黄酮的富集方法及其在抗肿瘤中的应用
技术领域
本发明涉及中药、天然药物制药领域，尤其涉及一种雪松松针总黄酮的富集方法及其在抗肿瘤中的应用。
背景技术
雪松Cedrus deodara (Roxb.) G. Don是松科Pianaceae植物雪松属Cedrus Trew树种的泛称，又称喜马拉雅雪松、喜马拉雅杉、香柏。该属共有4种，包括雪松Cedrus deodara (Roxb.) G. Don、黎巴嫩雪松Cedrus libani Rich.、短叶雪松Cedrus brevifolia Hook. f.和北非雪松Cedrus atlantica manetti，它们分别间断分布于喜马拉雅山、亚洲西部(黎巴嫩、叙利亚和土耳其)、塞浦路斯及北非(摩洛哥和阿尔及利亚)（郑万钧,傅立国《雪松·中国植物志》1978,第七卷,167；Dallimore W, Jackson AB, HarrionSG《A handbook of Coniferae and Ginkgoaceae》, 1966,137）。传统中医认为雪松具有祛风活络、消肿生肌、活血止血之功效；现代药理证实，雪松具有解痉、镇痛、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等多种药理活性(张军民,石晓峰,范彬,等《雪松的化学成分及药理活性研究进展·中成药》,2009,31(6):928-933)。其针叶药用历史悠久，主要化学成分为黄酮类、苯丙素类、有机酸类、三萜类、甾体类、多糖及针叶胶等，其中黄酮类化合物主要为杨梅素、槲皮素、山柰酚、异鼠李素及其它们的苷类（刘东彦,石晓峰,王东东,等《雪松松针黄酮类化学成分的研究·中草药》, 2011,42(4):631-633；Liu DY,Shi XF, Wang DD, et al《A NewFlavonoid In Pine Needles Of Cedrus Deodara·Chinese Herbal Medicines》,2011,3(1):5-6.；Liu DY,Shi XF, Wang DD, et al《Two New Myricetin Glycosides from PineNeedles of Cedrus deodara ·Chemistry of Natural compound》, 2011,47(5):704-707；刘东彦,石晓峰,李冲,等《雪松松针醋酸乙酯部位化学成分研究·中草药》,2011,42(10): 1921-1924）；目前采取正交试验法优选出雪松松针中总黄酮的最佳提取工艺为加无水乙醇30倍量，在40℃下超声提取3次，每次20min（范彬,石晓峰,沈薇,等《正交试验法优选雪松松针中总黄酮提取工艺·中国药师》,2008,11(8):938-940）。雪松松针具有抗肿瘤、抗氧化、改善记忆、抗菌及抗病毒、毒杀蚊虫等多种功效(白朝辉,石晓峰,刘东彦,等《雪松松针的化学成分及药理作用研究进展·中国药师》, 2012,15(12):1791-1793)，其中有关雪松松针抗肿瘤的报道，系雪松枝叶的乙醇提取物中挥发物质对人非小细肺癌(NCI-H460)细胞的抑制作用，当浓度为50μg/mL时，对肿瘤细胞没有抑制作用，而当浓度增加至 100 μg/mL时，抑制率达到73.45%（卓盼,陈先晖,朱峰,等《雪松枝叶弱极性物质的GC-MS分析及抗肿瘤活性·江苏农业科学》,2011,39(3):429-431）。雪松松针水溶性提取物显示出强大的抗氧化活性，对ABTS自由基的IC50为25.5 ± 0.64μg/mL，其水溶性提取物中总酚含量每克相当于31.4±0.53mg没食子酸，总黄酮含量每克相当于23.1±0.79mg芦丁（Wei-Cai Zeng,Li-Rong Jia, Yan Zhang,et al《Antibrowning and antimicrobial activities ofwater-soluble extract from pine needles of Cedrus deodara·Journal of FoodScience》,2011, 76(2):318-323）。但未见雪松松针总黄酮的大孔树脂富集方法及其在抗肿瘤中的应用的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种方法简单、易于实施的雪松松针总黄酮的富集方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该雪松松针总黄酮的富集方法制得的雪松松针总黄酮在抗肿瘤中的应用。
为解决上述问题，本发明所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；该干燥的雪松松针中加入其重量22~28倍的体积浓度为40~80%的乙醇进行回流提取，经过滤，得到雪松松针提取液；
⑵将所述雪松松针提取液经减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.05~1.10的流浸膏；
⑶将所述流浸膏分散于其质量3~4倍的水中，经超声溶解、离心分离，得到浓度为2.85~4.25mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液；
⑷大孔树脂湿法装柱后，将所述雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的盐酸或氢氧化钠调pH至3~6，然后以1~3mL／min流速上样，最大上样量为0.5~4.0倍柱体积，上样完成后先用3~5BV水洗除杂，然后用1~3BV的体积浓度为60~90%的乙醇洗脱，收集洗脱液；
⑸所述洗脱液经减压浓缩、干燥，即得含量超过50%的雪松松针总黄酮。
所述步骤⑴中回流提取的条件是指温度为85~90℃，共提取2次，其中一次2 h，一次1h。
所述步骤⑵中减压回收及所述步骤⑸中减压浓缩的条件均是指压力0.07~0.08MPa，水浴温度50~60℃。
所述步骤⑶中超声溶解的条件是指功率35~45KHz，温度40~50℃。
所述步骤⑶中离心分离的条件是指转速2500~3500r/min。
所述步骤⑷中大孔树脂是指D101、AB-8、HPD450、HPD722型大孔树脂中的任意一种。
所述步骤⑸中中干燥的条件是指50~60℃。
如上所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法制得的雪松松针总黄酮在抗肿瘤中的应用，其特征在于：该雪松松针总黄酮作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗肿瘤的药用制剂。
所述药用制剂是指胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液及其复方制剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明方法只需一定浓度的乙醇溶液加热回流提取，使用大孔吸附树脂柱纯化，所得雪松松针总黄酮稳定性和均一性良好，为应用到大规模工业生产提供有利基础，可望开发为以雪松松针总黄酮为原料的具有广泛临床使用价值的抗癌新药。
2、本发明工艺简单，成本低，易操作，得到的雪松松针总黄酮含量高。
3、本发明所得的雪松松针总黄酮的体外抗肿瘤作用：
2.1 材料与仪器
2.1.1 药品
雪松松针总黄酮（Total flavonoids from Cedrus deodara，TFCD）由甘肃省医学科学研究院药物研究所提供。
制备方法：雪松松针经乙醇回流提取，过滤除杂，大孔吸附树脂富集、纯化，低温干燥后得棕褐色粉末(纯度：54.28%)，4℃保存备用。
雪松松针总黄酮溶液的配制：将总雪松松针黄酮用PBS溶液配制成浓度分别为50、100、200、300、400、500、600、800、1000 µg/mL的雪松松针总黄酮系列溶液，分装于1.5 mL离心管中，4℃保存备用。
2.1.2材料 人宫颈癌HeLa细胞株、人胃癌细胞株MKN45、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2、人胶质瘤细胞株SHG44分别由兰大二院普外科研究所、甘肃省医学科学研究院、兰州军区兰州总医院骨研所提供。
改良型RPMI-1640培养基(美国 HyClone公司)，DMEM高糖培养基(美国 HyClone公司)，FBS胎牛血清(中国 上海尚宝生物科技有限公司)，MTT四甲基噻唑蓝(中国 北京索莱宝科技有限公司)，胰酶、PI碘化丙啶、RnaseA、DMSO二甲基亚砜(中国 生工生物工程(上海)股份有限公司)，5-FU(上海锐聪科技发展有限公司)，PI细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(中国南京凯基生物科技发展有限公司)。96孔板、6孔板、25cm2细胞培养瓶(美国 Corning)。
2.1.3 仪器
X-mark酶标仪(美国BioRad公司)，DHG-912311型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏仪器公司)，YXQ-LS50SII型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅仪器公司)，OLYMPUSPM倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)，2406-2型水套式CO2培养箱(美国SHELLAB公司)，SW-CJ-2FD型超净工作台(苏洁净化有限公司)，TDZ4-WS型台式低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)，FACSCalibur流式细胞仪 (美国Becton-Dickinson公司)， ZW-A型微量振荡器(国华仪器有限公司)。
2.2 方法
2.2.1 MTT法检测松松针总黄酮对HeLa、MKN45、A549、HepG2及SHG44细胞增殖抑制的影响。
参考文献方法进行细胞复苏、传代，消化并计数。分别取对数生长期的HeLa、MKN45、A549、HepG2及SHG44细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用培养基稀释成浓度为2.5×104个/mL的细胞悬液。将细胞接种到96孔板，每孔200µL，培养24h，此时细胞已贴壁，全量换液，试验组分别贴壁加入180µL完全培养基及20µL雪松松针总黄酮，使药物终浓度分别为5、10、20、30、40、50、60、80、100µg/mL，空白对照组加入等量完全培养基，各组均设3个平行孔。将96 孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养44h后，各孔加入5mg/mL MTT 20µL，置培养箱继续培养4h后取出，弃掉培养孔中液体，每孔加入150µL DMSO终止反应，振荡6min，完全溶解紫色结晶，用酶标仪于570nm波长处测定吸光度，并按照下式计算雪松松针总黄酮对5种肿瘤细胞的增殖抑制率：
。
2.2.2 流式细胞仪检测雪松松针总黄酮对HepG2细胞周期的影响。
取对数生长期的肝癌HepG2细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接种于6孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为10、20、40、80、160µg/mL的雪松松针总黄酮药液，空白对照组加入等量完全培养基，置37℃ 、5%CO2培养箱中培养48h后，充分吸弃培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，待细胞收缩变圆，立刻终止消化，充分吹打细胞使其分散为单细胞悬液，1000r/min，离心5min，收集约5×105细胞于离心管中，PBS溶液清洗细胞2次(1000rpm/min，离心5min)，弃掉PBS溶液后，于70%乙醇中4℃条件下固定，过夜，次日除去70%乙醇(1000rpm/min，离心5min)，加入PBS溶液清洗细胞2次(1000rpm/min，离心5min)，除去PBS溶液，加入100µL RnaseA(浓度100µg/mL)，37℃水浴30min，再加入400μL PI(100µg/mL)，4℃避光染色30min，染色结束后，充分吹打细胞使其分散，用流式细胞仪进行细胞周期分析。
2.2.3 Annexin V-FITC/PI 双染色法检测雪松松针总黄酮HepG2细胞凋亡的影响。
将对数生长期的HepG2细胞，用0.25%胰酶消化，接种于6孔板中，于37℃ 5%CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，加入终浓度分别为：10、20、40、80、160µg/mL的雪松松针总黄酮药液，空白对照组加入等量完全培养液，37℃ 5% CO2培养48h后，0.25%胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次(离心1000rpm，5min)，收集约5×105细胞，400μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC，5μLPI，混匀后，室温、避光、反应15min，用流式细胞仪检测（Ex=488 nm; Em=530 nm）细胞凋亡情况。并按照下式计算细胞凋亡率：
2.2.4 统计学处理：
所有数据用SPSS19.0软件进行统计处理，数据用 表示，采用单因素方差分析，P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著。
2.3.结果：
2.3.1 雪松松针总黄酮对不同肿瘤细胞增殖抑制作用
2.3.1.1形态学观察
空白对照组各不同类型肿瘤细胞，核大而圆，形态均一，轮廓清晰，边缘规整，随着培养时间延长，细胞数目逐渐增加，并铺满培养瓶底部，连接变致密，体积不断缩小。给药组细胞，相比空白对照组，加入不同浓度药物作用后，随作用时间累积，A549、HepG2及SHG44细胞形态由规则菱形和梭形逐渐变圆，间隙变大，连接逐渐消失，数目减少，部分漂浮在培养液中，增殖活力显著下降。HeLa、MKN45细胞数目逐渐增加，细胞间连接变致密。
2.3.1.2 MTT 法检测肿瘤细胞增殖抑制率
雪松松针总黄酮对5株肿瘤细胞有选择性的抑制作用。不同浓度雪松松针总黄酮作用于HeLa和MKN45细胞48h后发现，当雪松松针总黄酮浓度≤50µg/mL时，能够促进HeLa细胞增殖；当雪松松针总黄酮浓度≥60µg/mL，对HeLa细胞增殖产生抑制作用，但该抑制作用不明显。当雪松松针总黄酮浓度≤30µg/mL时，能够促进MKN45细胞增殖；当雪松松针总黄酮浓度≥40µg/mL时，对MKN45细胞增殖产生抑制作用，且存在剂量依赖关系。不同浓度雪松松针总黄酮作用于SHG44细胞48h后，均表现出增殖抑制作用，但该抑制作用不明显，且与剂量无关。雪松松针总黄酮作用于A549及HepG2细胞48h后，对2种细胞均表现出增殖抑制作用，且存在剂量依赖关系，其IC50(半数抑制浓度)分别为211.39µg/mL和114.12µg/mL；其中尤以雪松松针总黄酮各浓度组对HepG2细胞增殖抑制作用显著，当雪松松针总黄酮浓度为100µg/mL时，对其抑制率为(50.94±6.11)%。见表1。
注：“---”为雪松松针总黄酮对肿瘤细胞增殖无抑制作用。
2.3.2 雪松松针总黄酮对HepG2肿瘤细胞周期的影响
不同质量浓度雪松松针总黄酮作用于HepG2 细胞48 h 后，采用流式细胞仪分析细胞周期。结果显示，随着雪松松针总黄酮质量浓度增加，G0/G1期细胞比例逐渐增高，S 期及G2/M 期的细胞比例降低。当雪松松针总黄酮浓度为40µg/mL和80µg/mL时，与空白对照组相比阻滞作用显著(P<0.05)；当雪松松针总黄酮浓度为160µg/mL时，G0/G1期细胞比例与空白对照组相比具极显著差异（P<0.01）；表明雪松松针总黄酮能够影响HepG2肿瘤细胞周期进程，使其停滞于G0/G1期，且此作用具有浓度依赖性。见表2、图1~6。
注：与空白对照组相比，* P<0.05，** P<0.01。
2.3.3 雪松松针总黄酮诱导HepG2细胞凋亡
不同质量浓度雪松松针总黄酮作用于HepG2 细胞48 h 后，采用流式细胞仪分析，结果显示，随着雪松松针总黄酮质量浓度的增加，HepG2 细胞凋亡率逐渐升高。当药物作用浓度为20µg/mL时，凋亡率为（12.71±1.29）%，与空白对照组相比诱导凋亡作用显著(P<0.05)；当雪松松针总黄酮浓度为40µg/mL、80µg/mL、160µg/mL时，凋亡率分别为（20.53 ±2.07）%、 （33.86±1.17）%、 (64.56±2.05)%，与空白对照组相比具极显著差异（P<0.01）。表明雪松松针总黄酮能够诱导HepG2细胞凋亡，且此作用具有浓度依赖性。见图7~13。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明雪松松针总黄酮对HepG2肿瘤细胞周期影响（对照组）。
图2为本发明雪松松针总黄酮对HepG2肿瘤细胞周期影响（10µg/mL雪松松针总黄酮）。
图3为本发明雪松松针总黄酮对HepG2肿瘤细胞周期影响（20µg/mL雪松松针总黄酮）。
图4为本发明雪松松针总黄酮对HepG2肿瘤细胞周期影响（40µg/mL雪松松针总黄酮）。
图5为本发明雪松松针总黄酮对HepG2肿瘤细胞周期影响（80µg/mL雪松松针总黄酮）。
图6为本发明雪松松针总黄酮对HepG2肿瘤细胞周期影响（160µg/mL雪松松针总黄酮）。
图7为本发明雪松松针总黄酮诱导HepG2细胞的凋亡率（* P<0.05，** P<0.01 vscontrol group）。
图8为本发明雪松松针总黄酮对HepG2细胞凋亡的影响（空白对照组）。
图9为本发明雪松松针总黄酮对HepG2细胞凋亡的影响（10µg/mL雪松松针总黄酮）。
图10为本发明雪松松针总黄酮对HepG2细胞凋亡的影响（20µg/mL雪松松针总黄酮）。
图11为本发明雪松松针总黄酮对HepG2细胞凋亡的影响（40µg/mL雪松松针总黄酮）。
图12为本发明雪松松针总黄酮对HepG2细胞凋亡的影响（80µg/mL雪松松针总黄酮）。
图13为本发明雪松松针总黄酮对HepG2细胞凋亡的影响（160µg/mL雪松松针总黄酮）。
具体实施方式
实施例1 一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；取0.3kg干燥的雪松松针置于上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐中，加入其重量22倍的体积浓度为40%的乙醇，在温度为85℃的条件下回流提取，共提取2次，其中一次2 h，一次1h；然后过滤、合并，得雪松松针提取液及料渣，料渣废弃。
⑵将雪松松针提取液在压力0.07MPa、水浴温度50℃条件下采用上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐进行减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.05的流浸膏81.60 g；同时回收乙醇经处理再次使用。
⑶将流浸膏分散于其质量3倍的水中，用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ2200B超声清洗仪器在功率35KHz、温度40℃条件下进行超声溶解，然后用湘仪H-2050R台式高速冷冻离心机以2500r/min速率离心除去不溶性杂质，得浓度为3.85 mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液。
⑷称取HPD722型大孔树脂湿法装柱，将雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的盐酸调pH至3，然后以1mL／min流速上样，最大上样量为0.5倍柱体积，上样完成后先用3BV水洗除杂，然后用1BV的体积浓度为60%的乙醇洗脱，收集洗脱液。
⑸洗脱液采用河南巩义市予华仪器有限公司生产的RE-501型旋转蒸发仪在压力0.07MPa、水浴温度50℃条件下减压浓缩，再经江苏南通电器厂生产的766-3型远红外快速干燥箱60℃干燥，即得雪松松针总黄酮19.06g，经日本岛津公司生产的SHIMADZU UV-240紫外分光光度计检测，该雪松松针总黄酮纯度大于50%。
实施例2 一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；取0.3kg干燥的雪松松针置于上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐中，加入其重量28倍的体积浓度为80%的乙醇，在温度为90℃的条件下回流提取，共提取2次，其中一次2 h，一次1h；然后过滤、合并，得雪松松针提取液及料渣，料渣废弃。
⑵将雪松松针提取液在压力0.08MPa、水浴温度60℃条件下采用上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐进行减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.10的流浸膏82.20g；同时回收乙醇经处理再次使用。
⑶将流浸膏分散于其质量4倍的水中，用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ2200B超声清洗仪器在功率45KHz、温度50℃条件下进行超声溶解，然后用湘仪H-2050R台式高速冷冻离心机以3500r/min速率离心除去不溶性杂质，得浓度为3.85 mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液。
⑷称取HPD450型大孔树脂湿法装柱，将雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的盐酸调pH至6，然后以3mL／min流速上样，最大上样量为4.0倍柱体积，上样完成后先用5BV水洗除杂，然后用3BV的体积浓度为90%的乙醇洗脱，收集洗脱液。
⑸洗脱液采用河南巩义市予华仪器有限公司生产的RE-501型旋转蒸发仪在压力0.08MPa、水浴温度60℃条件下减压浓缩，再经江苏南通电器厂生产的766-3型远红外快速干燥箱50℃干燥，即得雪松松针总黄酮19.08g，经日本岛津公司生产的SHIMADZU UV-240紫外分光光度计检测，该雪松松针总黄酮纯度大于50%。
实施例3 一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；取0.3kg干燥的雪松松针置于上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐中，加入其重量25倍的体积浓度为60%的乙醇，在温度为87℃的条件下回流提取，共提取2次，其中一次2 h，一次1h；然后过滤、合并，得雪松松针提取液及料渣，料渣废弃。
⑵将雪松松针提取液在压力0.075MPa、水浴温度55℃条件下采用上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐进行减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.08的流浸膏81.00 g；同时回收乙醇经处理再次使用。
⑶将流浸膏分散于其质量3.5倍的水中，用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ2200B超声清洗仪器在功率40KHz、温度45℃条件下进行超声溶解，然后用湘仪H-2050R台式高速冷冻离心机以3000r/min速率离心除去不溶性杂质，得浓度为3.85 mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液。
⑷称取AB-8型大孔树脂湿法装柱，将雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的盐酸调pH至4.5，然后以2mL／min流速上样，最大上样量为1.0倍柱体积，上样完成后先用4BV水洗除杂，然后用2BV的体积浓度为70%的乙醇洗脱，收集洗脱液。
⑸洗脱液采用河南巩义市予华仪器有限公司生产的RE-501型旋转蒸发仪在压力0.075MPa、水浴温度55℃条件下减压浓缩，再经江苏南通电器厂生产的766-3型远红外快速干燥箱55℃干燥，即得雪松松针总黄酮19.04g，经日本岛津公司生产的SHIMADZU UV-240紫外分光光度计检测，该雪松松针总黄酮纯度大于50%。
实施例4 一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；取0.3kg干燥的雪松松针置于上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐中，加入其重量23倍的体积浓度为50%的乙醇，在温度为85℃的条件下回流提取，共提取2次，其中一次2 h，一次1h；然后过滤、合并，得雪松松针提取液及料渣，料渣废弃。
⑵将雪松松针提取液在压力0.07MPa、水浴温度50℃条件下采用上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐进行减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.06的流浸膏81.68 g；同时回收乙醇经处理再次使用。
⑶将流浸膏分散于其质量3倍的水中，用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ2200B超声清洗仪器在功率35KHz、温度40℃条件下进行超声溶解，然后用湘仪H-2050R台式高速冷冻离心机以2500r/min速率离心除去不溶性杂质，得浓度为3.85 mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液。
⑷称取D101型大孔树脂湿法装柱，将雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的氢氧化钠调pH至4，然后以1.5mL／min流速上样，最大上样量为2.0倍柱体积，上样完成后先用3.5BV水洗除杂，然后用1.5BV的体积浓度为65%的乙醇洗脱，收集洗脱液。
⑸洗脱液采用河南巩义市予华仪器有限公司生产的RE-501型旋转蒸发仪在压力0.07MPa、水浴温度50℃条件下减压浓缩，再经江苏南通电器厂生产的766-3型远红外快速干燥箱60℃干燥，即得雪松松针总黄酮19.06g，经日本岛津公司生产的SHIMADZU UV-240紫外分光光度计检测，该雪松松针总黄酮纯度大于50%。
实施例5 一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；取0.3kg干燥的雪松松针置于上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐中，加入其重量26倍的体积浓度为40%的乙醇，在温度为90℃的条件下回流提取，共提取2次，其中一次2 h，一次1h；然后过滤、合并，得雪松松针提取液及料渣，料渣废弃。
⑵将雪松松针提取液在压力0.08MPa、水浴温度60℃条件下采用上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐进行减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.10的流浸膏81.48 g；同时回收乙醇经处理再次使用。
⑶将流浸膏分散于其质量4倍的水中，用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ2200B超声清洗仪器在功率45KHz、温度50℃条件下进行超声溶解，然后用湘仪H-2050R台式高速冷冻离心机以3500r/min速率离心除去不溶性杂质，得浓度为4.25 mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液。
⑷称取HPD722型大孔树脂湿法装柱，将雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的氢氧化钠调pH至5，然后以2.5mL／min流速上样，最大上样量为3.0倍柱体积，上样完成后先用4.5BV水洗除杂，然后用2.5BV的体积浓度为80%的乙醇洗脱，收集洗脱液。
⑸洗脱液采用河南巩义市予华仪器有限公司生产的RE-501型旋转蒸发仪在压力0.08MPa、水浴温度60℃条件下减压浓缩，再经江苏南通电器厂生产的766-3型远红外快速干燥箱55℃干燥，即得雪松松针总黄酮19.04g，经日本岛津公司生产的SHIMADZU UV-240紫外分光光度计检测，该雪松松针总黄酮纯度大于50%。
实施例6 一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；取0.3kg干燥的雪松松针置于上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐中，加入其重量22倍的体积浓度为40%的乙醇，在温度为87℃的条件下回流提取，共提取2次，其中一次2 h，一次1h；然后过滤、合并，得雪松松针提取液及料渣，料渣废弃。
⑵将雪松松针提取液在压力0.075MPa、水浴温度55℃条件下采用上海雅程仪器设备有限公司生产的YC-10型多功能提取罐进行减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.05的流浸膏81.79 g；同时回收乙醇经处理再次使用。
⑶将流浸膏分散于其质量3.5倍的水中，用昆山市超声仪器有限公司生产的KQ2200B超声清洗仪器在功率40KHz、温度45℃条件下进行超声溶解，然后用湘仪H-2050R台式高速冷冻离心机以3000r/min速率离心除去不溶性杂质，得浓度为2.85 mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液。
⑷称取HPD722型大孔树脂湿法装柱，将雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的氢氧化钠调pH至5.5，然后以2mL／min流速上样，最大上样量为4.0倍柱体积，上样完成后先用4BV水洗除杂，然后用2BV的体积浓度为70%的乙醇洗脱，收集洗脱液。
⑸洗脱液采用河南巩义市予华仪器有限公司生产的RE-501型旋转蒸发仪在压力0.075MPa、水浴温度55℃条件下减压浓缩，再经江苏南通电器厂生产的766-3型远红外快速干燥箱60℃干燥，即得雪松松针总黄酮19.06g，经日本岛津公司生产的SHIMADZU UV-240紫外分光光度计检测，该雪松松针总黄酮纯度大于50%。
上述实施例1~6中制得的雪松松针总黄酮在抗肿瘤中的应用是指：该雪松松针总黄酮作为有效组分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类抗肿瘤的药用制剂。
其中：药用制剂是指胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液及其复方制剂。

Claims (6)

1.一种雪松松针总黄酮的富集方法，包括以下步骤：
⑴将新鲜雪松松针置阴凉处晾干，得到干燥的雪松松针；该干燥的雪松松针中加入其重量22~28倍的体积浓度为40~80%的乙醇进行回流提取，经过滤，得到雪松松针提取液；
⑵将所述雪松松针提取液经减压回收乙醇至无醇味，得60℃热测密度为1.05~1.10的流浸膏；
⑶将所述流浸膏分散于其质量3~4倍的水中，经超声溶解、离心分离，得到浓度为2.85~4.25mg/mL的雪松松针总黄酮粗提液；
⑷大孔树脂湿法装柱后，将所述雪松松针总黄酮粗提液用体积浓度为10%的盐酸或氢氧化钠调pH至3~6，然后以1~3mL／min流速上样，最大上样量为0.5~4.0倍柱体积，上样完成后先用3~5BV水洗除杂，然后用1~3BV的体积浓度为60~90%的乙醇洗脱，收集洗脱液；所述大孔树脂是指D101、AB-8、HPD450、HPD722型大孔树脂中的任意一种；
⑸所述洗脱液经减压浓缩、干燥，即得含量超过50%的雪松松针总黄酮。
2.如权利要求1所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法，其特征在于：所述步骤⑴中回流提取的条件是指温度为85~90℃，共提取2次，其中一次2 h，一次1h。
3.如权利要求1所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法，其特征在于：所述步骤⑵中减压回收及所述步骤⑸中减压浓缩的条件均是指压力0.07~0.08MPa，水浴温度50~60℃。
4.如权利要求1所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法，其特征在于：所述步骤⑶中超声溶解的条件是指功率35~45KHz，温度40~50℃。
5.如权利要求1所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法，其特征在于：所述步骤⑶中离心分离的条件是指转速2500~3500r/min。
6.如权利要求1所述的一种雪松松针总黄酮的富集方法，其特征在于：所述步骤⑸中中干燥的条件是指50~60℃。
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