CN106176764B - 拟缺香茶菜中2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属天然产物提取技术领域，涉及拟缺香茶菜中2ａ，3β,19ａ‑三羟基‑12烯‑28‑乌苏酸在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明以EC‑9706、SUDHL‑4、HepG2和SMMC‑7721细胞株为模型，对2ａ，3β,19ａ‑三羟基‑12烯‑28‑乌苏酸的体外抗肿瘤活性进行实验，发现该化合物对多种肿瘤细胞株具有较强的抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物，也可作为治疗各种临床常见多发癌症的药物，具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域,具体涉及从拟缺香茶菜中分离得到的2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸及其用途。
背景技术
拟缺香茶菜别名野紫苏，为唇形科香茶菜属植物，香茶菜属植物是多年生草本、半灌木或灌木唇形科植物，大多具有清热解毒、活血化瘀、抗菌消炎、抗肿瘤等功效。该属植物在世界各地都有所发现, 共150余种,主要产于热带和亚热带的亚洲地区。中国有90个种、21 个变种,除新疆、青海及内蒙古外几乎遍布全国,但西南各省种数最多。香茶菜属植物是我国有着很长历史且广受欢迎的中草药,最早应用记载于明代朱繡所著的《救荒本草》。所述2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸是从河南洛阳龙浴湾采摘的拟缺香茶菜中提取分离到的五环三萜类化合物【李火云，焦珂，张鹏，等.拟缺香茶菜化学成分研究{J}.中草药:2014,45(2):154-160；邓芳叶，王国才，王春华等.理肺散化学成分研究.中草药，2012,43(5)：861-865】。三萜类化合物是香茶菜属植物中最重要的有效活性成分之一，该属植物中的三萜类化合物主要指母体结构为五个六元环相连的乌苏烷型或齐墩果酸型五环三萜，其结构具有显著的特点。三萜是一类具有独特空间结构的生物活性天然产物，不仅在抗炎、抗菌、保肝护肾等方面有着重要的应用价值，还具有很强的抗肿瘤活性，极有可能被开发为新一代的抗癌药物。三萜类化合物是自然界中数量最多的天然产物之一，主要以游离、苷或酯的形式广泛存在于蕨类、菌类、单子叶和双子叶植物中，少数存在于动物体内。由于目前治疗癌症的药物普遍具有较大的副作用，抑制肿瘤细胞的同时会给正常细胞带来伤害，三萜类化合物凭借其“靶向杀伤”特征成为近年来国内外抗肿瘤药物研究的焦点之一。大量研究表明，其对乳腺癌、肺癌、直肠癌和中枢神经癌等多种肿瘤均具有显著的抑制效果。但至今未见有关2a，3β,19 a-三羟基-12烯-28-乌苏酸具有抗肿瘤活性报道。该化合物的化学结构式如下：
发明内容
本发明对2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸活性进行了研究，目的在于提供2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸在制备抗癌药物方面的用途。
为实现本发明目的，本发明采用MTT法,用食管癌(EC-9706)、淋巴瘤(SUDHL-4)、肝癌(SMMC-7721)细胞株对2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸进行了细胞毒活性实验,实验结果发现它均具有显著的细胞毒活性,因此可用于制备抗癌药物。本发明为寻求抗癌药物提供了一种新的来源。
2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸的性质
分子式：C30H48O5；分子量：488；MP：222-224℃
性状：白色无定型粉末，溶于氯仿，丙酮，乙酸乙酯等
英文名：(2α,3β,19α-trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid)
提取来源：拟缺香茶菜全草【提取方法参见李火云，焦珂，张鹏，等.拟缺香茶菜化学成分研究{J}.中草药:2014,45(2):154-160；陈慧平，马方，邹敏，等】。
本发明优点：以EC-9706、SUDHL-4和SMMC-7721细胞株为模型，对2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸的体外抗肿瘤活性进行实验，发现该化合物对多种肿瘤细胞株具有较强的抑制作用，可作为研制新的抗肿瘤药物的先导化合物,也可作为治疗各种临床常见多发癌症的药物。
具体实施方案
下面通过体外抗肿瘤实验,对本发明作详细描述。
实施例1
1、供试细胞
人食管癌细胞EC-9706、人淋巴瘤细胞SUDHL-4、人肝癌细胞 SMMC-7721均为普通市售商品。
2、主要仪器与耗材
生物安全柜，力康发展有限公司，HFsafe-1200TE；
CO2培养箱，力康发展有限公司，HF160W；
倒置生物显微镜，奥林巴斯，BDS200；
恒温振荡器，国华，ZD-85型；
EXL800uv全自动酶标仪，Bio-Rad(美国)公司，168-1000XC；
精密可调微量移液器，Eppendorf(德国)公司；
96孔细胞培养板，LabServ
细胞培养瓶，LabServ
3、主要试剂
优级胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；
胰蛋白酶，Sigma公司；
RPMI1640培养基、DMSO和四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)，美国Solarbio公司。
4、主要试剂配制
PBS缓冲液配制(PH7.4)：NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na2HPO4 3.48g， KH2PO4 0.20g，溶于1000ml超纯水中，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用；
MTT配制：称取10mg MTT，加2ml PBS(PH7.4)搅拌30min，用 0.22μm微孔滤器过滤除菌，分装4℃避光保存，两周内有效；
胰蛋白酶消化液：用PBS溶液溶解胰酶，配置成质量百分浓度为 0.25％的胰酶溶液，调PH值为7.4左右，过滤除菌，分装-20℃保存。
台盼蓝：称取0.4g台盼蓝粉，溶于100ml超纯水中，过滤除菌分装后，-4℃保存备用。使用时，用超纯水稀释至质量百分浓度为0.04％。
5、方法
5.1细胞培养
人食管癌细胞EC-9706、人肝癌细胞SMMC-7721为贴壁细胞，人淋巴瘤细胞SUDHL-4为悬浮细胞，均使用含质量百分浓度10％胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃饱和湿度、体积百分浓度5％CO2培养箱中常规培养；每2-3d换液1次。实验过程中用台盼蓝染色法检测细胞活性。
EC-9706、SMMC-7721细胞消化传代方法：倒掉原培养基，加入 PBS缓冲液润洗两次，向培养瓶加1ml胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察，至细胞变圆、有间隙时将胰蛋白酶倒出，加入含质量百分浓度 10％胎牛血清RPMI1640培养基1ml，反复吹打细胞使其脱壁直至散开成单个，分装到新培养瓶中，加入含质量百分浓度10％胎牛血清的培养基中培养。
SUDHL-4细胞消化传代方法：将培养瓶中培养液连同细胞一起倒入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清，加入2ml新鲜培养液重悬细胞，向两个培养瓶中各吸取1ml细胞悬液，并分别加入适量新鲜的培养液进行传代培养。
5.2MTT法体外筛选抗肿瘤药物
5.2.1原理
MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，简称噻唑蓝。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氧酶能够使MTT还原为不溶于水的蓝紫色针状结晶甲瓚，并沉积在细胞中，而死细胞则没有该功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓚颗粒，使细胞着色，用酶标仪在490mn波长处测定其吸光度(A)，根据A值大小分析活细胞多少，A值可间接反映活细胞数量。
5.2.2实验方法
MTT：收集对数生长期细胞，用细胞计数板计数，调整细胞悬液浓度为5×107·L-1(SUDHL-4细胞为8×107·L-1)，96孔细胞培养板中每孔加入100μl，(SUDHL-4细胞实验孔加入含有不同药物浓度的培养基各100μl)，每个浓度设四个复孔，细胞培养箱(5％CO2，37℃)中孵育24h，待细胞贴壁后，小心吸去上清，加入含有不同药物浓度的培养基100μl，并设阴性对照孔、空白孔及阳性对照孔。连续培养48h后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h后，将培养板取出(SUDHL-4细胞需离心25min)，用移液器吸弃上清液，每孔加入150μLDMSO，震荡混匀后，用酶联免疫检测仪，在570nm 波长下检测各孔的吸光度(A)值；实验重复三次，按以下公式求取细胞增殖抑制率，用SPSS软件计算其IC50值。抑制率(％)＝(1-给药孔A值/对照孔A值)×100％。
6、结果
本研究以EC-9706、SUDHL-4和SMMC-7721细胞株为模型，对2 a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸的体外抗肿瘤活性进行筛选，结果显示：2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸对上述3种细胞均有不同程度的抗肿瘤活性，其中对食管癌细胞EC-9706的抑制作用最强，IC50为2.88uM，对淋巴瘤细胞SUDHL-4的作用次之，IC50为 5.97uM，对肝癌细胞SMMC-7721的IC50为31.38uM，结果见表1、表 2，提示可用于制备抗肿瘤药物。
表1 2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸对EC-9706、SUDHL-4细胞72h体外抑制活性结果
表2 2a，3β,19a-三羟基-12烯-28-乌苏酸对SMMC-7721细胞72h体外抑制活性结果
Claims (1)
1.拟缺香茶菜中2ａ，3β,19ａ-三羟基-12烯-28-乌苏酸在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，以其为活性成分，应用于抗食管癌药物的制备。
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