JP2005029571A - ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有する化合物とその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】 ＤＮＡ合成酵素λ阻害物質を用いた抗癌剤、抗炎症剤などを提供すること。
【解決手段】 ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有する物質として今回新たにクルクミン及びその誘導体などを見出した。クルクミンはＤＮＡ合成酵素λを選択的に阻害し、同様にＤＮＡ合成酵素λを選択的に阻害するペタシフェノールはクルクミンと共に抗炎症作用を有していた。ペタシフェノール及びクルクミンはまた、複数のヒト癌細胞株に対する細胞増殖抑制効果を示した。したがって、これらＤＮＡ合成酵素λ阻害物質は、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤としての用途のほか、抗癌剤および抗炎症剤として医薬品等へ利用可能である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有する化合物とその利用に関する。これらの化合物は、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤として例えば生化学試薬などに利用できるほか、抗癌剤、抗炎症剤、又はこれらのリード化合物として利用し得るものである。

真核生物のＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、及びμの１２種類のＤＮＡ合成酵素が知られている。これらのＤＮＡ合成酵素群は、細胞の増殖、分裂、分化などに関与しているが、α型はＤＮＡ複製、β型は修復と組換え、λ型は修復、δ型及びε型は複製と修復の双方を担うといった具合にタイプによって異なる機能を有することが知られている。

このようにＤＮＡ合成酵素は細胞の増殖等に関与することから、その酵素活性を阻害するＤＮＡ合成酵素阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制作用を示し、エイズに対してＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害作用を示し、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制作用を示すことが考えられる。このため、ＤＮＡ合成酵素阻害剤を用いた癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に効果のある医薬品の開発が期待されている。

例えば、ＤＮＡ合成酵素阻害活性を有する糖脂質が、制癌剤、ＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤、免疫抑制剤として有用であることが報告されている（下記特許文献１参照）。現在、ＤＮＡ合成酵素阻害剤として、ジデオキシＴＴＰ(ｄｄＴＴＰ)、Ｎ−メチルマレイミド、ブチルフェニル−ｄＧＴＰなどが知られている（下記非特許文献１参照）。また植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにもＤＮＡ合成酵素阻害作用が見出されている（下記特許文献２参照）。

最近、本発明者は、日本産高等植物ふきのとう（Petasites japonicus）から単離・精製した物質ペタシフェノール（petasiphenol）が、in vitroにおいてＤＮＡ合成酵素λを選択的に阻害する活性を有することを明らかにした（下記非特許文献２参照）。さらに解析の結果、このペタシフェノールはＤＮＡ合成酵素λのＮ末端側に在るＢＲＣＴドメインに結合し、同酵素の立体構造を変化させることで酵素活性を阻害するものと推測された。

クルクミン（curcumin (diferuloylmethane)）は、上記ペタシフェノールと同じフェノール化合物であり、抗炎症作用および抗酸化作用を有することが知られている（例えば下記非特許文献３参照）。

特開平１１−１０６３９５号公報 特開平２０００−１４３５１６号公報 Annual Review of Biochemistry, 1991, 60, 513-552頁 Biochemistry, 2002, 41, 14463-14471頁 Planta Med., 1991, 57, 1-7頁

上述のように、ペタシフェノールは、ＤＮＡ合成酵素λのＢＲＣＴドメインに結合することで、その酵素活性を阻害するものと考えられる。とすれば、ペタシフェノールと類似の化学構造を持つ物質（特にフェノール化合物）もまた、同酵素のＢＲＣＴドメインに結合し、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有する可能性がある。実際にこのようなＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を示す物質が得られれば、同物質はＤＮＡ合成酵素λの機能解析に使用する生化学試薬として有用であるばかりでなく、前述した抗癌剤などへの医薬品応用が期待できる。

また今回、本発明者は特にＤＮＡ合成酵素λ阻害作用、抗炎症作用および抗発癌作用の関連性について調査し、ＤＮＡ合成酵素λ阻害物質の抗炎症剤・抗発癌剤への応用、並びに、抗炎症作用を有する物質のＤＮＡ合成酵素λ阻害作用の有無について検討を行った。

本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、λ型のＤＮＡ合成酵素阻害作用を有する化合物を見出すと共に、同化合物を利用した新たなＤＮＡ合成酵素λ阻害剤、抗癌剤および抗炎症剤を提供することにある。

本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（１）上記ペタシフェノールと同じフェノール化合物であり、構造が類似するクルクミンがＤＮＡ合成酵素λを選択的に阻害する阻害活性を有すること、（２）上記クルクミンの複数の誘導体についても、阻害の程度は異なるものの、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用が認められること、（３）上記クルクミンは抗炎症作用を有するが、同じＤＮＡ合成酵素λ阻害剤であるペタシフェノールもまた抗炎症作用（および抗発癌作用）を有すること、（４）抗炎症作用を有する物質（後述のＭＡＡ、ＴＡ及びＥＡ）に、いずれもＤＮＡ合成酵素λ阻害作用が認められたこと、（５）ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤であるペタシフェノールおよびクルクミンは、いずれも実際に複数の癌細胞株に対する細胞増殖抑制効果を発揮したこと、等を見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は、医学上及び産業上有用な下記Ａ）〜Ｉ）の発明を含むものである。
Ａ） 下記の式（１）により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。

Ｂ） 下記の式（１）により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗炎症剤。

Ｃ） 下記の式（２）〜（１５）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素λ阻害剤。

Ｄ） 上記Ｃ）記載の式（３）〜（１５）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
Ｅ） 上記Ｃ）記載の式（３）〜（１５）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗炎症剤。
Ｆ） 下記の式（１６）〜（１８）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素λ阻害剤。

Ｇ） 上記Ｆ）記載の式（１６）〜（１８）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
Ｈ） ＤＮＡ合成酵素λに対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤または抗炎症剤の候補化合物をスクリーニングする方法。
Ｉ） 上記Ｇ）記載のスクリーニング方法を用いて選ばれた化合物を有効成分とする医薬組成物。

本発明に係る化合物は、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有し、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤として例えば生化学試薬などに利用できるほか、抗癌剤、抗炎症剤、又はこれらのリード化合物として利用することができる。

以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
（１）ペタシフェノール及びその構造類似物質のＤＮＡ合成酵素λ阻害作用
前述のように、本発明者は、ふきのとう（Petasites japonicus）からフェノール化合物であるペタシフェノールを単離・精製すると共に、同物質が選択的にＤＮＡ合成酵素λを阻害することを明らかにした（詳細は、Biochemistry, 2002, 41, 14463-14471頁参照）。

図１（ａ）は、ペタシフェノールのＤＮＡ合成酵素λ選択的阻害作用を示すグラフである。グラフ中、黒丸印はλ型のＤＮＡ合成酵素に対する阻害結果を示し、菱形印、四角印、三角印、逆三角印は、それぞれα型、β型、δ型、ε型のＤＮＡ合成酵素に対する阻害結果を示す。ペタシフェノールは濃度依存的にＤＮＡ合成酵素λを阻害し、その５０％阻害濃度（IC₅₀）は約７．８μＭであった。

解析の結果、このペタシフェノールはＤＮＡ合成酵素λのＢＲＣＴドメインに結合し、同酵素の立体構造を変化させることで酵素活性を阻害するものと推測された。それ故、本発明者は、ペタシフェノールと類似の化学構造を持つ物質（特にフェノール化合物）もまた、同酵素のＢＲＣＴドメインに結合し、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有するのではないかと考えた。ペタシフェノールは前記式（１）により表される化学構造を有する。本発明者は、このペタシフェノールと同じフェノール化合物であり、構造が極めて類似する物質クルクミン（その化学構造は前記式（２）により表される）に着目し、そのＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を調べた。

その結果、図１（ｂ）のグラフに示すように、クルクミンもまたペタシフェノールと同様にＤＮＡ合成酵素λを選択的に阻害した。グラフ中、黒丸印はλ型のＤＮＡ合成酵素に対する阻害結果を示し、菱形印、四角印、三角印、逆三角印は、それぞれα型、β型、δ型、ε型のＤＮＡ合成酵素に対する阻害結果を示す。クルクミンは濃度依存的にＤＮＡ合成酵素λを阻害し、その５０％阻害濃度（IC₅₀）は約７．０μＭであった。

さらに植物や原核生物のＤＮＡ合成酵素、その他のＤＮＡ代謝系酵素に対する酵素活性阻害作用についても調査した。その結果、図２に示すように、ペタシフェノール及びクルクミンは、いずれもin vitroにおいてヒトＤＮＡ合成酵素λのみを特異的に阻害し、他の哺乳類ＤＮＡ合成酵素、植物や原核生物のＤＮＡ合成酵素、その他のＤＮＡ代謝系酵素に対する阻害作用を有しなかった。

次に、クルクミンの誘導体、具体的には前記式（３）〜（１５）により表される各化合物についてもＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を調べた。
図３に示すように、上記クルクミン誘導体はＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を示した。図中、化合物１はペタシフェノール、化合物２はクルクミン、化合物３〜１５はそれぞれ前記式（３）〜（１５）により表される化合物を意味する（以下、便宜上ペタシフェノール及びクルクミンをそれぞれ「化合物１」「化合物２」と称することがある）。化合物３は、ペタシフェノール及びクルクミンよりもＤＮＡ合成酵素λを強く阻害した。また、化合物１０は、化合物１〜１５の中で最も強くＤＮＡ合成酵素λを阻害した。

以上のように、本発明者は、（１）ペタシフェノールのみならず、その構造類似物質クルクミンもＤＮＡ合成酵素λを選択的に阻害し、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤として利用し得ること、及び（２）クルクミンの誘導体もＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有し、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤として利用し得ること、を見出した。

（２）ペタシフェノールの抗炎症作用および抗発癌作用と抗炎症物質のＤＮＡ合成酵素λ阻害作用
ＤＮＡ合成酵素λを特異的に阻害する上記クルクミンは、抗炎症作用を有することが知られており、ＴＰＡ（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）によって誘発される慢性炎症を抑制するが、その分子機構は不明である。一方、ＴＰＡは、慢性炎症を誘発するのみならず、発癌プロモーターとして哺乳類の細胞増殖を促進する。こうした知見から、本発明者は、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用、抗炎症作用および抗発癌プロモーター活性の間には互いに関連性があるのではないかと考えた。そこで、ＤＮＡ合成酵素λを特異的に阻害する上記ペタシフェノールが、クルクミンと同様に抗炎症活性を有するかどうかを調べた。その結果を下記の表１に示す。

実験では、マウス耳に予め所定量のペタシフェノール（化合物１）又はクルクミン（化合物２）を塗布後、ＴＰＡによって誘発される炎症性浮腫の重量を測定することで各阻害効果を算出した（詳細は後述する）。表１に示すように、クルクミン（化合物２）は塗布量200μg・500μgのいずれの場合も炎症を抑制し（阻害効果８３％）、ペタシフェノール（化合物１）は塗布量500μgの場合に強い抗炎症活性を示した（阻害効果４２％）。この実験結果から、ペタシフェノールは抗炎症作用を有するものと認められた。

また、この実験結果から、ペタシフェノールは、発癌プロモーターＴＰＡの働きを抑制する抗発癌プロモーター活性（換言すれば、抗発癌作用）を有するものと認められた。

次に、抗炎症作用を有することが知られている３種類の化合物、具体的には前記式（１６）〜（１８）により表される各化合物についてＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を調べた。なお、式（１６）の化合物は、テルペノ安息香酸（terpeno benzoic acid）であるmyrsinoic acid A（5-geranyl-4-hydroxy-5-(3’-methyl-2’-butenyl)-benzoic acid：以下、「ＭＡＡ」という）、式（１７）の化合物は、トリテルペン（triterpene）であるtormentic acid（以下、「ＴＡ」という）、式（１８）の化合物は、同じくトリテルペンのeuscaphic acid（以下、「ＥＡ」という）である。

その結果、図２に示すように、これら３種類の化合物（即ち、ＭＡＡ、ＴＡ及びＥＡ）は、いずれもヒトＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を示した。これらの化合物は、他の哺乳類のＤＮＡ合成酵素阻害作用も有していたが、今回調べた範囲ではＤＮＡ合成酵素λを最も強く阻害した。また、植物や原核生物のＤＮＡ合成酵素、その他のＤＮＡ代謝系酵素に対する阻害作用は有していなかった。

このように、今回の実験結果から、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用、抗炎症作用および抗発癌作用の間には互いに関連性が認められ、（１）ペタシフェノールは抗炎症剤および抗発癌剤として有用であること、及び（２）抗炎症作用を有する上記３種類の化合物（ＭＡＡ、ＴＡ及びＥＡ）は、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤としても利用し得ること、が示された。

（３）ペタシフェノール及びクルクミンの癌細胞増殖抑制効果
本発明者はさらに、ペタシフェノール及びクルクミンが癌細胞増殖抑制作用を有するかどうか検討した。その結果、図４〜図６に示すように、これらのフェノール化合物はいずれも３種類のヒト癌細胞株に対して強力な細胞増殖抑制効果を発揮した。図４は、ヒト胃癌細胞株であるＮＵＧＣ−３細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果（黒四角印はペタシフェノール、黒丸印はクルクミンの結果）であり、図５は、ペタシフェノール（化合物１）のヒト末梢血癌細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果（白丸印はヒトＢ細胞由来末梢血癌細胞株であるＢＡＬＬ−１細胞、黒丸印はヒトＴ細胞由来末梢血癌細胞株であるＭＯＬＴ−４細胞の結果）であり、図６は、クルクミン（化合物２）のヒト末梢血癌細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果（白丸印はヒトＢ細胞由来末梢血癌細胞株であるＢＡＬＬ−１細胞、黒丸印はヒトＴ細胞由来末梢血癌細胞株であるＭＯＬＴ−４細胞の結果）である。

下記の表２は、上記実験結果をまとめたものであり、化合物１・２の各癌細胞に対する５０％抑制濃度（ＬＤ₅₀）の値が示される。

また、ペタシフェノール及びクルクミンの細胞周期に対する影響をフローサイトメトリー解析によって調べたところ、ペタシフェノールはＮＵＧＣ−３細胞をＧ１期に停滞させ、クルクミンは同細胞をＧ２／Ｍ期に停滞させた（図７参照）。

以上のように、今回の実験結果から、ＤＮＡ合成酵素λを特異的に阻害するペタシフェノール及びクルクミンが、いずれも実際に複数のヒト癌細胞株に対する細胞増殖抑制効果を発揮し、抗癌剤として利用し得ることが示された。

（４）本発明の利用分野（有用性）
本発明者がふきのとうから単離・精製したペタシフェノール、即ち、前記式（１）により表される化合物は、前述のように、ＤＮＡ合成酵素λ選択的阻害剤としての利用に止まらず、抗癌剤および抗炎症剤として医薬品等への応用が可能であり、その薬理上許容される塩についても同様に医薬品等への応用が可能である。

なお、従来の抗癌剤は、その多くが発生した癌細胞を殺すこと並びに癌細胞の増殖抑制作用を有するものであったが、近年発癌防止を目的とした抗発癌剤の開発も進められている。この点について、特開平９−１７６１８４号公報に記載されるように、正常細胞の癌化のステップにおいて、「イニシエーター」と「プロモーター」とが関係しており、正常細胞の癌化は「（１）正常細胞の染色体がイニシエーターによりＤＮＡレベルでの障害を受けて潜在的腫瘍細胞に変化する。（２）潜在的腫瘍細胞にプロモーターが作用して腫瘍細胞に変化させる。」の２段階を経て起こるという発癌２段階説が一般化しつつある。 このプロモーターとしての作用を持つ化合物の代表として前記ＴＰＡ等が知られており、癌研究の場でこのような発癌プロモーターを用いた発癌実験が行われると共に、発癌予防及び抗発癌剤の探索においてこのような発癌プロモーターの作用を阻害する抗発癌プロモーターの探索が進められている。

本発明のペタシフェノールは、前述のように、ＴＰＡによって誘発される炎症を抑制する作用を有しており、発癌プロモーターＴＰＡの働きを抑制する作用を有するものと認められる。したがって、本発明のペタシフェノール、並びに同様の作用を有する他の化合物は、発癌プロモーター抑制剤および抗発癌剤（換言すれば、発癌防止剤・発癌抑制剤）として有用であり、本発明における「抗癌剤」は、このような発癌プロモーター抑制作用を有する抗発癌剤を含む意味で用いている。

また、本発明における「その薬理上許容される塩」の塩としては、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、スルホン酸塩、有機酸塩、及び、アミノ酸塩が挙げられ、好適には塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩を挙げることができる。

ペタシフェノールと構造が類似するクルクミン及びその誘導体（即ち、前記式（２）及び式（３）〜（１５）により表される化合物）、並びにその薬理上許容される塩についても、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤として、さらにこのような阻害能をもつ生化学試薬として、また、抗癌剤あるいは抗炎症剤として医薬品等への利用が可能である。

前記ＭＡＡ、ＴＡ及びＥＡの３種類の化合物（即ち、前記式（１６）〜（１８）により表される化合物）、並びにその薬理上許容される塩についても、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤として、さらにこのような阻害能をもつ生化学試薬として、また、抗癌剤として医薬品等への利用が可能である。

本発明の各化合物、及びその薬理上許容される塩は、植物などから単離・精製した天然物であってもよいし、公知の合成方法により合成したものであってもよい。例えば、ペタシフェノールは、文献Biochemistry, 2002, 41, 14463-14471頁記載の方法によって単離・精製することができるが、この方法に限定されるものではなく、適宜改変・改良を加えた方法やさらに別工程を付加した方法であってもよく、また、合成したものであってもよい。化合物３〜１５の製造方法についても特に限定されるものではないが、後述の実施例において使用したこれら化合物の合成方法を例示すれば次のとおりである。

化合物３の合成：市販のクルクミン（化合物２）200mgをピリジン5mlに溶解し、室温で無水酢酸を0.2ml加えて1時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和酢酸ナトリウム水溶液を加え有機層を分取した。水層を酢酸エチルで２回抽出した。有機層と一緒にして飽和食塩水で洗い、乾燥、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し185mgを得た。

化合物４，５の合成：市販のクルクミン（化合物２）500mgをアセトン15mlに溶解し、炭酸カリウム1.88gとヨードメタン1.69mlを加え、一晩加熱還流した。固形物をろ過、ろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物４，５を得た。

化合物６の合成：市販のクルクミン（化合物２）200mgをテトラヒドロフラン5mlに溶解し、水素化ホウ素ナトリウム41mgを加え、室温で一晩撹拌した。メタノールで希釈し、１時間撹拌後、反応液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し86mgを得た。

化合物７，８，９の合成：市販のクルクミン（化合物２）100mgを酢酸エチルに溶解し、10%パラジウムカーボン5mgを加え、反応容器内を水素で置換し、室温で4時間撹拌した。反応液をセライト層を通してろ過し、ろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物７を44.5mg、化合物８を27.3mg、化合物９を16.1mg得た。

化合物１０，１１の合成：市販のクルクミン（化合物２）500mgをジメチルホルムアミド10mlに溶解しイミダゾール278mgとtert-ブチルクロロジメチルシラン225mgを加え、室温で90分撹拌した後、さらに、tert-ブチルクロロシラン103mgを加え、10分間室温で撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで有機層を分取した。水層を酢酸エチルで２回抽出した。有機層と一緒にして飽和食塩水で洗い、乾燥、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製しモノTBS（tert-ブチルジメチルシリル基）体243mgを得た。モノTBS体20mgをジメチルホルムアミド400μlに溶解し、トリエチルアミン20μl、塩化アセチル5μlを順に加え、室温で30分撹拌した。反応液に水を加え、有機層を酢酸エチルで分取した。水層を酢酸エチルで２回抽出した。有機層と一緒にして飽和食塩水で洗い、乾燥、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製しアセチル体6.5mgを得た。アセチル体6.5mgをテトラヒドロフラン1mlに溶解し、テトラ-n-ブチルアンモニウムフルオリド4.2mgを加え、３分間撹拌した後、緩衝液を加え、酢酸エチルで有機層を分取した。水槽を酢酸エチルで抽出した。有機層と一緒にして飽和食塩水で洗い、乾燥、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１０を2mg得た。

モノTBS体20mgをテトラヒドロフラン10mlに溶解し、メタノール5μl、トリフェニルホスフィン27.8mg、アゾジカルボン酸ジイソプロピル(40%トルエン溶液)57μlを順に加え、室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、トリメチル体を2.5mg得た。トリメチル体2.5mgをテトラヒドロフラン200μlに溶解し、テトラ-n-ブチルアンモニウムフルオリド1.3mgを加え、３分間撹拌した後、緩衝液を加え、酢酸エチルで有機層を分取した。水槽を酢酸エチルで抽出した。有機層と一緒にして飽和食塩水で洗い、乾燥、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１１を0.8mg得た。

化合物１２，１３，１４の合成：化合物３ 20mgを酢酸エチル5mlに溶解し、10%パラジウムカーボン2mgを加え、反応容器内を水素で置換し、室温で１時間撹拌した。反応液をセライト層を通してろ過し、ろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１２を10.6mg、化合物１３を1.1mg、化合物１４を2.8mg得た。

化合物１５の合成：化合物３ 50mgをアセトン5mlに溶解し、炭酸カリウム153mgとヨードメタン138μlを加え、一晩加熱還流した。固形物をろ過、ろ液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１５を32.3mg得た。

本発明の医薬品への利用には、本発明の化合物を医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することも含まれる。なお、本発明の化合物を体内投与する際は経口投与よりも非経口投与が好ましく、またリポソームなどの運搬体に封入して投与することが好ましい。このとき癌細胞を特異的に認識する運搬体などを利用すれば、標的部位（病変部位）に本発明の化合物を効率よく運ぶことができ効果的である。

また本発明の化合物は、医薬品への利用以外に、飲食品へ添加・配合することにより抗癌効果、抗発癌効果、あるいは抗炎症効果をもった健康食品として利用することも可能である。

次に、本発明の化合物を配合してなる医薬用組成物および食用組成物について説明する。本発明の化合物を有効成分とする抗癌剤および抗炎症剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。

本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく適宜設計できる。この種の製剤には本発明の化合物の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。

ここに、結合剤としてデンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を例示できる。崩壊剤としてはデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース等を例として挙げることができる。界面活性剤の例としてラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等を挙げることができる。滑沢剤では、タルク、ロウ類、水素添加植物油、蔗糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール等を例示できる。流動性促進剤では、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等を例として挙げることができる。また、本発明の化合物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。

非経口剤として本発明の所望の効果を発現せしめるには、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で本発明の化合物の重量として１日あたり１〜６０ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。さらに必要に応じて、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤を加えてもよい。これら製剤中の本発明の化合物の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。その他の非経口剤の例として、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらも常法に従って製造される。

本発明の他の組成物の好適な態様は食用組成物である。即ち、本発明の化合物は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。

なお、ヒトと他の哺乳動物のＤＮＡ合成酵素の構造は殆ど同じであるため、本発明のＤＮＡ合成酵素λ阻害剤は、ヒト以外の哺乳動物由来のＤＮＡ合成酵素λ阻害剤としても利用可能である。

また、前述のように、ＤＮＡ合成酵素λ阻害作用、抗炎症作用および抗発癌作用の間には互いに関連性が認められ、ＤＮＡ合成酵素λを特異的に阻害するペタシフェノールは、ＴＰＡによって誘発される慢性炎症を抑制した。この結果は、ＴＰＡによる慢性炎症の発症においてＤＮＡ合成酵素λが重要な役割を担っている可能性を示すものである。また、ＴＰＡは、慢性炎症を誘発するのみならず、発癌プロモーターとして哺乳類の細胞増殖を促進する。ＤＮＡ合成酵素λ特異的阻害剤であるペタシフェノールは、このような発癌プロモーターＴＰＡの働きを抑制する抗発癌作用を示した。したがって、ＤＮＡ合成酵素λに対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤または抗炎症剤の候補化合物の効率的なスクリーニングが期待できる。本発明には、このようなスクリーニング方法、及び同スクリーニング方法を用いて選ばれた化合物を有効成分とする医薬組成物（抗癌剤・抗炎症剤）も含まれる。なお、本スクリーニング方法において、ＤＮＡ合成酵素λに対する阻害活性を調べる方法は後述の実施例記載の方法に限定されるものではなく、公知の試験方法の中から適した方法を選択すればよい。

以下図面を参照して、本発明の実施例について説明する。

〔実施例１：ペタシフェノール及びその構造類似物質のＤＮＡ合成酵素λ阻害作用〕
ペタシフェノール及びクルクミンのＤＮＡ合成酵素群に対する活性を以下の方法で測定した。
ペタシフェノールは、Biochemistry, 2002, 41, 14463-14471頁記載の方法によりふきのとう（Petasites japonicus）から単離・精製したものを使用し、クルクミンは市販のものを使用した。

ＤＮＡ合成酵素として哺乳動物由来のＤＮＡ合成酵素α、β、δ、εおよびλについて試験を行った。ウシＤＮＡ合成酵素αおよびδは、牛胸腺から常法により抽出精製した標品を、ラットＤＮＡ合成酵素βおよびヒトＤＮＡ合成酵素λは、大腸菌発現系を用いて生産し抽出精製した標品を、ヒトＤＮＡ合成酵素εはヒト子宮癌（HeLa）細胞の抽出液からサブユニットカラムクロマトグラフィー、抗体カラムクロマトグラフィーで精製した標品を用いた。

これらのＤＮＡ合成酵素に対するペタシフェノール及びクルクミンの阻害作用の測定には、一般的なＤＮＡ合成酵素反応系（日本生化学会編、新生化学実験講座２，核酸IV、東京化学同人、第63頁〜66頁）を用いた。すなわち、放射性同位元素で標識した[³Ｈ]-ＴＴＰを含む系においてＤＮＡ合成反応を行い、放射比活性を生成物（合成ＤＮＡ鎖）量の指標とするものである。阻害率は、(a)コントロールでの合成ＤＮＡ量、(b) ペタシフェノールまたはクルクミン存在下での合成ＤＮＡ量について、
(a - b) / a × 100 = 阻害率（％）
として評価した。得られた結果を図１（ａ）（ｂ）の各グラフに示す。グラフ中、黒丸印はλ型のＤＮＡ合成酵素に対する阻害結果を示し、菱形印、四角印、三角印、逆三角印は、それぞれα型、β型、δ型、ε型のＤＮＡ合成酵素に対する阻害結果を示す。同図に示すように、ペタシフェノール及びクルクミンはＤＮＡ合成酵素α、β、δ、εおよびλのうち、ＤＮＡ合成酵素λを選択的に阻害した。ペタシフェノール及びクルクミンは濃度依存的にＤＮＡ合成酵素λを阻害し、その５０％阻害濃度（IC₅₀）はそれぞれ約７．８μＭ、７．０μＭであった。

また同様の方法で、各種ＤＮＡ合成酵素およびＤＮＡ代謝系酵素に対する酵素活性阻害作用についても調査した。その結果、図２に示すように、ペタシフェノール及びクルクミンは、いずれもin vitroにおいてヒトＤＮＡ合成酵素λのみを特異的に阻害し、他の哺乳類ＤＮＡ合成酵素、植物や原核生物のＤＮＡ合成酵素、その他のＤＮＡ代謝系酵素に対する阻害作用を有しなかった。

次に、クルクミンの誘導体、具体的には前記式（３）〜（１５）により表される各化合物を化学合成し、各化合物のＤＮＡ合成酵素阻害活性を調査した。その結果を図３に示す。実験では、哺乳動物由来のＤＮＡ合成酵素α、βおよびλに対する阻害を調査した。同図に示すように、上記クルクミン誘導体はＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を示した。図中、化合物１はペタシフェノール、化合物２はクルクミン、化合物３〜１５はそれぞれ前記式（３）〜（１５）により表される化合物を意味する。化合物３は、化合物１（ペタシフェノール）及び化合物２（クルクミン）よりもＤＮＡ合成酵素λを強く阻害した。また、化合物１０は、化合物１〜１５の中で最も強くＤＮＡ合成酵素λを阻害した。

〔実施例２：ペタシフェノールの抗炎症作用と抗炎症物質のＤＮＡ合成酵素λ阻害作用〕
ペタシフェノールがクルクミンと同様に抗炎症活性を有するかどうかを、ＴＰＡを用いたマウス耳炎症試験によって調査した。試験は、基本的にCancer Lett. 1984, 25, 177-85頁記載の方法にしたがって行い、マウスの一方の耳にペタシフェノール（化合物１）又はクルクミン（化合物２）を200μｇもしくは500μｇ塗布し、３０分後、同じ箇所と反対側の耳にＴＰＡを0.5μｇ塗布する。７時間後、ＴＰＡによって誘発される炎症性浮腫の重量を測定し、コントロール（反対側の耳）と比較することで各阻害効果を算出した。

その結果、前記表１に示すように、クルクミン（化合物２）は塗布量200μg・500μgのいずれの場合も炎症を抑制し（阻害効果８３％）、ペタシフェノール（化合物１）は塗布量500μgの場合に強い抗炎症活性を示した（阻害効果４２％）。

次に、抗炎症作用を有することが知られている前記ＭＡＡ、ＴＡ及びＥＡの３種類の化合物についてＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を調べた。ＭＡＡは、Biochim Biophys Acta 2000, 1475, 1-4頁記載の方法によりタイミンタチバナ（Myrsine seguinii）から単離・精製したものを使用し、ＴＡ及びＥＡは、Biochim Biophys Acta 2002, 1596, 193-200頁記載の方法によりホウロクイチゴ（Rubus sieboldii）から単離・精製したものを使用した。また、阻害作用の測定は、実施例１と同様に行った。

その結果、図２に示すように、これら３種類の化合物（即ち、ＭＡＡ、ＴＡ及びＥＡ）は、いずれもヒトＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を示した。これらの化合物は、他の哺乳類のＤＮＡ合成酵素阻害作用も有していたが、今回調べた範囲ではＤＮＡ合成酵素λを最も強く阻害した。また、植物や原核生物のＤＮＡ合成酵素、その他のＤＮＡ代謝系酵素に対する阻害作用は有していなかった。

〔実施例３：ペタシフェノール及びクルクミンの癌細胞増殖抑制効果〕
次に、ペタシフェノール及びクルクミンが癌細胞増殖抑制作用を有するかどうか検討した。実験では、ヒト胃癌細胞株であるＮＵＧＣ−３細胞、ヒトＢ細胞由来末梢血癌細胞株であるＢＡＬＬ−１細胞、ヒトＴ細胞由来末梢血癌細胞株であるＭＯＬＴ−４細胞の３種類の癌細胞を使用し、種々の濃度のペタシフェノール又はクルクミンを添加してインキュベーションし、４８時間後、各癌細胞の生存率をＭＴＴアッセイにより決定した。

その結果、図４〜図６に示すように、ペタシフェノール及びクルクミンはいずれも３種類のヒト癌細胞株に対して濃度依存的に強力な細胞増殖抑制効果を発揮した。図４は、ＮＵＧＣ−３細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果（黒四角印はペタシフェノール、黒丸印はクルクミンの結果）であり、図５は、ペタシフェノール（化合物１）のヒト末梢血癌細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果（白丸印はＢＡＬＬ−１細胞、黒丸印はＭＯＬＴ−４細胞の結果）であり、図６は、クルクミン（化合物２）のヒト末梢血癌細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果（白丸印はＢＡＬＬ−１細胞、黒丸印はＭＯＬＴ−４細胞の結果）である。

また、ペタシフェノール及びクルクミンの細胞周期に対する影響をフローサイトメトリー解析によって調べた。その結果を図７に示す。
６６μＭのペタシフェノールで４８時間インキュベーションするとＮＵＧＣ−３細胞はＧ１期に停滞した（コントロールと比較してＧ１期は１４．９％増加、Ｇ２／Ｍ期は４．３％減少）。一方、１３μＭのクルクミンで４８時間インキュベーションすると同細胞はＧ２／Ｍ期により多く分布した（コントロールと比較してＧ２／Ｍ期は２５．６％増加、Ｇ１期は０．４％減少）。また、これらの分布傾向はインキュベーション時間に依存しており、ＮＵＧＣ−３細胞の代わりにＨｅＬａ細胞を用いた実験でもペタシフェノール及びクルクミンはそれぞれ細胞を細胞周期のＧ１期とＧ２／Ｍ期とに停滞させた（データ示さず）。

これらの実験結果から、ＤＮＡ合成酵素λを特異的に阻害するペタシフェノール及びクルクミンが、いずれも実際に複数のヒト癌細胞株に対する細胞増殖抑制効果を発揮し、抗癌剤として利用し得ることが示された。

以上のように、本発明は、ペタシフェノール、クルクミン及びその誘導体などＤＮＡ合成酵素λ阻害作用を有する化合物に関するものであり、前述したとおり、ＤＮＡ合成酵素λ阻害剤として、生化学試薬として、さらには抗癌剤および抗炎症剤として医薬品等へ利用できるほか種々の有用性を有するものである。

（ａ）は、ペタシフェノールのＤＮＡ合成酵素λ選択的阻害作用を示すグラフであり、（ｂ）は、クルクミンのＤＮＡ合成酵素λ選択的阻害作用を示すグラフである。 ペタシフェノール、クルクミン、ＭＡＡ、ＴＡおよびＥＡの哺乳類ＤＮＡ合成酵素、植物や原核生物のＤＮＡ合成酵素、その他のＤＮＡ代謝系酵素に対する阻害作用を調べた結果を示す図である。 ＤＮＡ合成酵素α、β、λに対するペタシフェノール、クルクミンおよびクルクミン誘導体の阻害作用を調べた結果を示すグラフである。 ＮＵＧＣ−３細胞に対するペタシフェノール及びクルクミンの増殖抑制効果を調べた結果を示すグラフである。 ペタシフェノールのヒト末梢血癌細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果を示すグラフである。 クルクミンのヒト末梢血癌細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果を示すグラフである。 ペタシフェノール及びクルクミンの細胞周期に対する影響をフローサイトメトリー解析によって調べた結果を示す図である。

Claims (9)

1. 下記の式（１）により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
   

   
2. 下記の式（１）により表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗炎症剤。
   

   
3. 下記の式（２）〜（１５）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素λ阻害剤。
   

   

   
   

   
4. 請求項３記載の式（３）〜（１５）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
5. 請求項３記載の式（３）〜（１５）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗炎症剤。
6. 下記の式（１６）〜（１８）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とするＤＮＡ合成酵素λ阻害剤。
   

   
7. 請求項６記載の式（１６）〜（１８）の何れかにより表される化合物、又はその薬理上許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
8. ＤＮＡ合成酵素λに対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤または抗炎症剤の候補化合物をスクリーニングする方法。
9. 請求項８記載のスクリーニング方法を用いて選ばれた化合物を有効成分とする医薬組成物。
   
   

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