KR20140032621A - 산국 추출물로부터 분리된 한델린을 포함하는 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염증질환을 예방 및 치료할 수 있는 항염증 활성을 갖는 산국 추출물로부터 분리된 한델린을 함유하는 약리적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 대식세포에서 내독소인 LPS에 의해 증가된 iNOS 및 COX-2의 발현량을 감소시킬뿐만 아니라, 동물 모델에서도 생성된 부종을 감소시키는 한델린이 비염, 기관지염, 간염, 관절염, 천식 등 염증반응에 관련 질병들에 대해 항염증 효과를 발휘하면서 이들 질병 예방과 치료에 도움을 줄 수 있다는 점을 확인하였다.

Description

산국 추출물로부터 분리된 한델린을 포함하는 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강식품 {Composition and health food comprising handelin isolated from the extract of Chrysanthemum boreale Makino for prevention and treatment of inflammatory-involved disease}

본 발명은 산국 추출물로부터 분리된 한델린을 포함하는 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

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본 발명은 산국 추출물로부터 분리된 한델린을 포함하는 염증 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

염증(inflammation)은 외상이나 화상과 같은 물리화학적인 요인 또는 세균이나 바이러스와 같은 생물학적 요인에 의해 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 충혈, 부종, 발열, 통증 등의 증상이 특징적이다. 생화학적으로는, 염증은 염증유발 인자가 생체에 작용할 때 염증소에서의 항체나 히스타민, 세로토닌 등의 화학물질을 함유한 혈장 성분이나 조직액의 국소적 삼출, 백혈구의 침윤, 회복을 위한 섬유 증생 등의 생체 측에서 생기는 반응 현상을 말한다. 염증유발 인자의 종류, 양이나 생체 측의 면역 상태에 따라서 염증 반응이 생기는 양상은 다르다.

염증 반응을 조절하는 인자들은 종류에 따라서 크게 혈관의 투과성을 증대시키는 물질과 백혈구 유주를 촉진하는 화학 전달 물질 등으로 나눌 수 있다 (Rubin E. Lippincott Williams and wilkins, 24-46, 2001). 또한 염증은 체내 다양한 기관에서 발생할 수 있으며 만증 염증 질환의 경우 암화 (carcinogenesis)와 밀접한 관련이 있기 때문에 암으로 발전할 가능성이 있다고 알려져 있다 (Shacter E et al., Oncology, 16, 217-226, 229, 2002; Coussens LM et al., Nature, 420, 860-867, 2002).

염증반응이 일어나면 여러 가지 염증인자들이 만들어지는데, 염증인자에는 inducible nitric oxide synthase (iNOS)에 의해서 만들어지는 nitric oxide (NO)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해서 만들어지는 prostaglandin E₂ (PGE₂) 등이 있다. 이러한 염증 인자는 염증반응의 전사인자인 nuclear factor-kB (NF-kB)를 활성화시키며, 그 결과 과량의 NO와 PGE₂를 생성하여 염증을 일으킨다. 포유동물 세포의 nitric oxide synthase (NOS)의 경우, 유사형태가 3가지 존재하는데 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), 그리고 inducible NOS (iNOS)이다. 그 중에서 특히 iNOS가 염증반응에 관여하는데, iNOS의 경우 Interferon-gamma, lipopolysaccharide (LPS), 그리고 여러 가지 염증성 사이토카인의 자극이 있을 때 발현된다 (John TG et al., Curr Opin Chem Biol, 4, 687-695, 2002; John WC, Int Immunopharmacol, 1, 1397-1406, 2001). PGE₂는 cyclooxygenase (COX)에 의해서 arachidonic acid로부터 생산된다. COX 또한 2가지 유사형태로 존재한다. COX-1은 거의 모든 조직에 발현되어 있고, prostaglandin을 생산하여 신장의 혈액 흐름을 조절하거나 위장의 세포를 보호하는 등의 생리적인 기능을 조절한다. 반대로 COX-2의 경우는 미생물에 의한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 감염이나 손상 혹은 여러 요인의 스트레스에 반응한 대식세포(Macrophage)에서 발현된다 (Vane JR et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol, 38, 97-120, 1998). 즉 iNOS와 COX-2의 발현과 NO, PGE₂의 생산은 면역세포의 대표적인 염증인자이다. 또한 염증인자로 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)인 tumor necrosis factor-alpha(TNF-a), interleukin-1beta(IL-1b) 등이 포함된다.

한편 염증 반응에 관련된 효소 및 사이토킨의 유전자 발현은 주로 NF-κB가 조절한다. NF-κB는 Rel 패밀리의 구성요소인 RelA (p65), RelB, c－Rel, NF-κB1（p50）, NF-κB2（p52)가 각기 결합하여 동형 이합체 (homodimer) 혹은 이형 이합체 (heterodimer) 형태를 이루고 있는 전사인자이다. NF-κB라고 알려진 대부분은　RelA／NF-κB 1 (p65/p50)의　결합으로　이뤄진　이형 이합체의 형태로　세포질에서 존재하고 있다(Baeuerle PA et al., Cell, 87, 1320, 1996; Thanos D et al., Cell, 80, 52932, 1995).

NF-κB는 세포질에서 κB (IκBs) 저해제와 결합하여 불활성화 상태로 존재하는데, LPS나 염증성 물질에 의한 자극이 가해지면 NF-κB가 활성화된다. 그 과정은 IκB를 조절하는 세 가지 물질인 IκB 키나제 (IKK), 유비퀴틴 리가제 및 26s 프로테오솜에 의해 일어난다. IκB가 IKK에 의해 인산화가 된 후, 유비퀴틴 리가제에 의해 NF-κB가 유비퀴틴화 되고 마지막으로 26s 프로테오솜과 IκB와　분리되어NF-κB가 따로 떨어져 나오게 된다. 유리 NF-κB가 핵 안으로 이동하여 κB-결합부위에 결합하게 되면 유전자 전사가 일어나서 염증에 관련하는 효소인 iNOS와 COX-2, 염증성 사이토킨인 TNF-α, IL-1β 등의 유전자의 발현을 조절하게 된다 (Pahl HL, Oncogene, 18, 685366, 1999). 따라서 NF-κB, 염증 관련 효소 iNOS, COX-2 및 염증성 사이토킨 TNF-α, IL-1β의 발현/억제 시험으로 염증성 질환 치료 물질의 효과를 분석할 수 있다.

NF-kB를 활성화시키는 물질들은 MAPK도 활성화시키는 경우가 많은데, 이는 두 전사 인자들의 작용 기전이 서로 연관되어 있기 때문이다. MAPK는 여러 단백질들의 serine 및 tyrosine residue를 인산화시켜 유전자 발현, 분열, 대사, 세포사멸 등의 작용을 한다(Ray LB et al., J Biol Chem., 263, 1272112727, 1988). MAPK는 크게 extracellular signal regulated kinase(ERK)1/2, c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase (JNK/SAPK), p38 MAPK로 나뉘며 NF-kB의 활성화는 MAPK/ERK kinase kinase-1과 p38, JNK에 의해 조절된다 (Lee FS et al., Cell, 88, 213222, 1997). MAPK는 MAPK kinase에 의해 인산화 과정이 일어나 활성화되어 NF-kB와 마찬가지로 핵 내로 들어가 여러 전사 인자들과 cross-linking되어 활성화 시킨다. 이로 인해 염증반응과 면역 반응에 여러 가지 작용기전을 통해 관여하게 된다.

국화과(Compositae) 식물은 전세계에 분포하고 있으며 약 920속 20,000종이 알려져 있고, 지금까지 우리나라에서 자생 또는 귀화되어있는 것으로 밝혀진 국화과 식물의 수는 약 300여 종이 있다(Choi SH et al., Korea J Food Cookery Sci 22,768-773, 2006; Kang JR et al., J Korea Soc Appl Biol Chem, 51, 321-328, 2008). 기능성식품의 소재로서 위장, 감기, 두통, 현기증, 고혈압 등에 유효하며(Park NY et al., Korean J Food Sci Technol, 31, 1189-1196, 1998) 바이러스 억제효과(Nam SH et al., J Agric Food Chem, 38, 269-272,1995), 항균활성 및 항암활성 등에 효과가 있는 것으로 알려져있다(Nam SH et al., J Agric Food Chem, 38, 273-277,1995).

산국(Chrysanthemum boreale Makino)은 우리나라를 포함한 일본, 만주, 중국에 분포하며 여러해살이풀로써 9~10월에 황색 꽃을 핀다. 예로부터 특히 청열해독의 효능이 있어, 옹종, 정창, 농가진, 습진 등을 치료하는데 약용소재로 사용되어 왔다. 산국의 화학성분으로는 리나린 (linarin), 루테올린(luteolin), 크리산테민(chrysanthemin), 크리산테마-크산틴(chrysanthema-xanthin), 쿠마린(coumarin) 등의 성분이 알려져 있으며, 이중 한델린(handelin)은 산국의 꽃에서부터 추출된 sesquiterpene계 물질이며, 구조적 특징으로는 diguaianolide dimer 형태를 띠고 있다(정보섭외, 도해향약대사전, 영림사,p1038-1039, 1998).

그러나 상기 문헌의 어디에도 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증관련 질환의 치료 및 예방용 조성물에 대한 어떠한 개시내용 또는 시사된 바는 없다.

이에 따라, 본 발명자들은 본 연구자가 개발한 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin)이 산국의 분리화합물인 한델린이 NF-kB와 MAPK 신호전달을 억제하고, iNOS와 COX-2 유도 발현의 억제 작용을 통하여 항염증 효과를 갖는 것을 처음으로 확인하였고, 동물실험을 통해 항염증 효과를 증명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증관련 질환의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증관련 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본원에서 정의되는 염증관련 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크; 류마티스 관절염, 골관절염, 강직 척추염; 혈관염, 흉막염, 심장막염, 허혈 관련 염증, 염증성 동맥류; 신장염; 간염; 만성 폐염증 질환; 기관지 염증, 비염; 피부염; 위염; 대장염, 과민성대장증후군; 감염에 의한 열 및 근육통으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환, 바람직하게는 비염, 기관지염, 간염, 천식, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염, 보다 바람직하게는 비염, 천식, 또는 류마티스 관절염을 포함하는 것을 특징으로 한다.

현재 의약품으로 사용되고 있는 항염증제는 다양한 부작용을 가지고 있지만 천연 식물성 소재인 산국 추출물은 이들 부작용을 최소화할 수 있는 항염증 기능성 소재로 사용될 수 있으므로 항염증제를 필요로 하는 비염, 기관지염, 간염, 천식, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 등의 예방 및 치료를 위한 기능성 소재로 활용 가능하다.

따라서 본 발명에서는 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 함유하는 염증관련 질환의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

상기 화합물은 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin)이 NF-kB와 MAPK 신호전달을 억제하고, iNOS와 COX-2 유도 발현의 억제 작용을 통하여 항염증 효과를 갖는 것을 처음으로 확인하였고, 동물실험을 통해 항염증 효과를 나타냄으로써 항염증제로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 유효농도의 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 염증 관련질환을 나타내는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 관련질환을 치료하는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 화합물 의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 경구 투여가 바람직하다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.

또한 본 발명은 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 염증 관련질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 건강기능식품은 목적 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

따라서 또한, 본 발명은 산국 추출물로부터 분리된 항염활성을 나타내는 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 화합물을 첨가 가능한 식품형태는 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류인 식품 등을 포함한다.

본 발명의 화합물은 목적 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물의 혼합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 화합물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin)이 NF-kB와 MAPK 신호전달을 억제하고, iNOS와 COX-2 유도 발현의 억제 작용을 통하여 항염증 효과를 갖는 것을 확인하였고, 동물실험을 통해 항염증 효과를 나타냄으로써 다양한 부작용을 가지고 있는 기존 항염제를 대체하여 천연 식물성 소재인 산국 추출물은 이들 부작용을 최소화할 수 있는 항염증 기능성 소재로 사용될 수 있으므로 항염증제를 필요로 하는 비염, 기관지염, 간염, 천식, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 등의 예방 및 치료를 위한 기능성 소재로 활용 가능하다.

도 1은 본 발명인 한델린의 구조를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 한델린의 ¹H- 및 ¹³C-NMR 데이타를 나타낸 그래프이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 세포 독성 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 NO 생성 억제 효능(도 3a)과 PGE2 생성 억제 효능(도 4b)을 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 iNOS 단백질 및 COX-2 단백질 발현 저해 효과 (도 5a) 및 iNOS 유전자 및 COX-2 유전자 발현 저해 효과 (도 5b)를 나타낸 사진이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 IκBa 단백질 분해와 NF-κB의 서브유니트인 p65와 p50의 단백질에 대한 발현 저해 효과를 나타낸 사진이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 NF-κB의 전사능을 SEAP로 확인하여 본 결과 그래프이다.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 MAPK 패밀리의 단백질 발현 저해 효과를 본 결과 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 TNF-α단백질과 IL-1b 단백질 발현 저해 효과 (도 9a) 및 TNF-α유전자와 IL-1b 유전자 발현 저해 효과 (도 9b)를 나타낸 사진이다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따라, 한델린의 마이크로유전자-155 발현 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11a 및 11b는 본 조성물의 유효성분인 한델린의 카라기난으로 족부종을 유발한 동물 모델에서 족부종 증가율 (도 11a) 및 조직에서의 iNOS 단백질, COX-2 단백질, 및 IL-1b 단백질 발현 저해 효과 (도 11b)를 보여주는 그래프와 사진이다.
도 12a 및 12b는 본 조성물의 한델린의 TPA로 귀부종을 유발한 동물 모델에서 귀부종 증가율 (도 12a) 및 조직에서의 iNOS 단백질, COX-2 단백질, 및 IL-1b 단백질 발현 저해 효과 (도 12b)를 보여주는 그래프와 사진이다.

이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 산국으로부터 한델린 ( handelin ) 화합물의 분리

건조시킨 산국(2.15 kg)를 수욕조에서 메탄올 용매로 3회 추출하였고, 이를 다시 CH₂Cl₂, EtOAc 및 n-BuOH 가용성 분획들로 분획을 수행하였다. 상기 CH₂Cl₂, 분획 (1439 g) 을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(용매: n-hexane-EtOAc 경사 시스템, 5:1 → 5:5 및 최종 EtOAc)로 통한 정제를 수행하여 17개 소분획으로 나누었다. 14번째 소분획을 재결정하여 하기한 바와 같은 compounds IV (handelin)을 분리하고 이를 문헌에 기재된 물성치를 참조하여 구조를 확인하였다 (Kang SS et al., Arch Pharm Res, 19, 406-410, 1996)

한델린 ( handelin ) (도 1 및 도 2)

: 흰색의 무정형;

Amorphous from MeOH (540 mg), mp 235-237

UV λ_max nm 204 (end absorption);

IR ν_max (KBr) cm^-1 3463 (OH), 2975, 2942, 2868 (CH), 1753, 1745 (lactone),

1725,1248 (OAc), 1453, 1152, 1024, 988, 930, 910, 814, 799

EI-MS (70 eV), re/. int. (%), m/z 456 [M-2H₂0-HOAc]⁺ (0.5), 288 [C₁₇H₂₂O₅-H₂0]⁺ (1.7), 246 [C₁₅H₁₈O₃]⁺ (33.9), 228 [C₁₇H₂₂O₅-H₂0-HOAc]⁺ (100), 213 (45.3), 203 (36.4), 200 (31.5)

¹H- 및 ¹³C-NMR : (도 2 참조).

실험예 1. 시험관 내 시험을 통한 항염 활성

상기 실시예에서 얻은 시료의 시험관 내 시험법(in vitro)에서의 활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다

1-1. 산화질소( Nitric oxide ) 생성 저해 활성 검색 ( iNOS assay )

상기 실시예에서 얻은 시료의 산화질소(Nitric oxide) 생성 저해 활성을 확인하기 위하여 iNOS 실험을 수행하였다.

염증 반응 및 외상이 있을 때 발현이 증가하는 효소 iNOS (inducible nitric oxide synthase)에 대한 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 저해 활성을 시험하였다.

구체적으로는 RAW 264.7 (American Type Culture Collection, ATCC; Manassas, VA, USA) 세포를 3 x 10⁵ cells/ml 수가 되도록 희석하여 10% FBS (Fetal bovine serum)가 포함된 (Dulbeco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지(medium))로 24-웰 플레이트의 각 웰에 1ml씩 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후 부착된 세포를 PBS (phosphate-buffered saline)으로 세척 후 10% FBS-DMEM 배지와 본 발명의 조성물 (한델린을 각각 10, 20, 40 μM)로 처리하고 30분 후 1 μg/ml LPS (lipopolysaccharide, 지질다당류)(Sigma-Aldrich, Sr.Louis, MO, USA)를 넣어 주고 37℃, 5% CO₂에서 20시간 배양하였다 (실험군). 블랭크(blank)로서 LPS 및 본 발명에 따른 조성물 첨가 없이 배양된 RAW 264.7 세포와 대조군으로서 LPS만 첨가되어 배양된 RAW 264.7 세포를 사용하였다.

각 웰의 상징액을 100μl씩 취하여 phosphoric acid (Sigma, P-5811) 에 녹인 2% 술파닐아미드 (Sulfanilamide) 용액 (Sigma, S-9251) 및 2% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 (N-(1-naphtyl)-ethylenediamine) 용액(Sigma, N-9125)과 각각 90μl씩과 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 배양액에 생성된 질산염(nitrate) 또는 아질산염(nitrite)의 양을 확인하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

NaNO₂ 용액을 이용하여 표준 검량선을 작성하고 측정한 흡광도를 바탕으로 하기 수학식 1에 의해 대조군에 대한 실험군의 각 실험 물질 처리에 따른 NaNO₂ 농도로 환산하여 LPS만 처리한 군과 비교하는 방법으로 시료의 산화질소(NO) 생성 저해 활성을 평가하였다. 하기 수학식 1을 이용하여 질산염 농도로 저해율(%)을 구한 후 IC₅₀ 값을 산출하였다. IC₅₀ 값은 50% 억제율에 대한 시험 물질의 농도이다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 한델린을 10, 20, 40 μM의 농도를 처리한 결과 NO 생성은 농도 의존적으로 억제되었고 (도 4a 참조). IC₅₀ 은 6.65 μM이었다. 본 발명의 조성물의 IC₅₀ 값은, 대조 물질로 사용한 L-NMMA의 IC₅₀ 값 (14.74 μM)에 비해 약 1/2인 바, 본 발명의 조성물은 저농도에서도 NO 생성 저해율이 뛰어남을 알 수 있었다. iNOS 생성 저해 효과가 시료 자체 (한델린)의 독성에 의한 것인지를 확인하기 위해서 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 분석을 수행한 결과, 한델린의 최고 농도인 40 μM에서 세포 독성 (세포 생존율(cell viability): 82.45%)을 나타내었지만, 일반적인 기준인 80%이상 살아있었던바 (도 4), 본 한델린의 효과가 독성에 의한 것이 아님을 확인할 수 있었고, 실험은 10, 20, 40 μM를 기준으로 계속 수행하였다.

1-2. 프로스타글란딘 E ₂ ( ProstaglandinE ₂ , PGE ₂ ) 생성 저해 활성 검색( PGE ₂ assay )

상기 실시예에서 얻은 시료의 프로스타글란딘E₂(ProstaglandinE₂,PGE₂) 생성 저해 활성을 확인하기 위하여 PGE2 assay를 실시하였다.

세포 배양액 내의 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)양을 측정하기 위해 정량키트(commercial competitive enzyme immunoassay kit)를 사용하였다 (R&D systems, Cat#.KGE004B). RAW 264.7 세포에 한델린을 10, 20, 40 μM의 농도로 전처리하고 1시간 후 1 μg/ml LPS를 처리하고, 18 시간 후 세포 배양액을 얻어 PGE₂ 측정에 사용하였다. 배양액을 goat anti-mouse로 coating된 96 well plate에 각각 100 μl씩 넣고, 여기에 primary antibody solution 50 μl와 PGE₂ conjugate 50μl씩 첨가하여 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. Washing buffer로 4회 세척하고 substrate solution을 200 μl씩 처리하여 5-20분간 반응시킨 후, 50 μl의 stop solution을 처리한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 4b에 나타난 바와 같이, 한델린을 10, 20, 40 μM의 농도를 처리한 결과 PGE₂ 생성은 농도 의존적으로 억제되었고, IC₅₀ 은 14.3 μM이었다.

1-3. inducible nitric oxide synthase ( iNOS ) 및 사이클로옥시게나아제 -2 (cyclooxygenase-2, COX -2)의 단백질 및 유전자 발현 저해 효능 평가

상기 실시예에서 얻은 시료의 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 및 사이클로옥시게나아제-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)의 단백질 및 유전자 발현에 대한 저해 활성을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.

본 발명 조성물의 iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 (Western blot analysis)을 통해 확인하였다.

구체적으로는 RAW 264.7 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 100mm 배양 접시 당 3 ⅹ 10⁵ 세포수가 되도록 희석하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 10% FBS가 포함된 배지에 세포 독성을 나타내지 않는 최고 농도인 한델린 10, 20, 및 40 μM의 본 발명의 조성물로 전처리하고 LPS (1μg/ml)로 염증반응을 유도하여 16시간 배양하였다. 세포 배지 내에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모아 PBS로 2회 세척한 후 끓고 있는 세포 용해 완충액을 넣어 세포를 현탁 시키고 이를 100℃ 중에 5분간 가열하였다. 이를 식힌 후 20°C에서 보관하였고 사용 직전에 37°C에서 녹여 단백질 정량 및 전기영동에 이용하였다.

단백질 정량은 Bicinchoninic Acid (BCA) 법을 이용하였고 30~50 mg의 단백질을 8~12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 150 V 에서 110분 동안 전기영동하였다. 원하는 부위의 겔을 잘라 1시간 동안 PVDF(polyvinylidene fluoride)(Milipore, Bedford, MA, USA) 막으로 이동시킨 후 PBST(0.1% Tween-20(Amresco, Cat#.0777)이 함유된 PBS)로 2회 세척하고 블로킹 완충액에 넣어 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음 PBST로 5분 간 3회씩 세척한 후 다음의 1차 항체를 3% 탈지유/PBST로 1:1,000 ~1:2,000의 비율로 희석하여 막과 함께 밀봉하여 4℃에서 교반하면서 12시간 이상 배양하였다. 막을 PBST로 5분간 2-3회씩 세척한 후 HRP-결합된 2차 항체를 1:1,500~1:2,000으로 희석하여 막과 함께 상온에서 2-3시간 배양하였다. 이를 PBST로 5분간 3회 세척한 후 웨스턴 블랏팅 기질 (WEST-ZOL PLUS(Intron, Cat#.16021))을 처리하여 생성된 발광(luminescence)을 측정기기(LAS-3000, Fuji Film Corp, Japan)을 이용하여 확인하였다. 대조군으로는 LPS만 처리한 군 (+control)과 LPS와 본 발명의 조성물을 모두 처리하지 않은 군 (-control)을 사용하여 단백질 발현을 비교하였고, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.

도 5a에서 나타난 바와 같이, LPS만 (본 발명의 조성물 -) 처리한 대조군(도 5b에서 왼쪽에서 2번째 참조)과 비교하였을 때, 본 발명의 조성물(한델린 10, 20, 40 μM)은 농도 의존적으로 iNOS 단백질과 COX-2 단백질 발현을 모두 저해시켰다.

iNOS와 COX-2 단백질 발현 저해를 확인하였으므로 단백질 선행 단계인 유전자 발현에 어떠한 작용을 나타내는지에 대해 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)법을 이용하여 확인하였다.

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 100mm 배양 접시 당 3 ⅹ 10⁵ 세포수가 되도록 희석하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 10% FBS가 포함된 배지에 한델린을 10, 20, 40 μM 농도로 본 발명의 조성물을 희석한 후, 100 mm 배양 접시에 준비된 배지를 10 ml 첨가하여 일정 시간 배양하였다. 세포 배지 내에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모아 PBS로 2회 세척한 후, TRI 시약(TRIzol(Invitrogen, Cat#.15596-026))을 이용하여 세포를 깨서 모은 후 CHCl3를 첨가하여 RNA를 추출하고, 이소프로필알코올을 이용하여 침전시켰다. RNA 침전물을 70% 에탄올(Sigma, E7148)로 세척한 후 공기 중에서 건조시킨 후 뉴클레아제로 오염되지 않은 물 (nuclease-free water)(Ambion, AM9937)에 현탁시켰다. 55℃에서 10분간 가열하고, 70℃에서 5분간 가열하여 RNA가 단일 사슬 상태로 존재하게끔 하였다. 총 RNA를 나노 드롭(nano-drop)으로 정량한 후, 1 μg/μl 농도로 희석하여 조류 골수아세포증 바이러스 (avian myeloblastosis virus: AMV) 역전사효소(Promega, M5108)와 올리고(dT)15 프라이머(Promega, C110B)를 이용하여 cDNA를 만들었다. 0.2 mM dNTP 혼합물(Promega, C114B), 10pmol 표적 유전자-특이적 프라이머 (표 1), 및 0.25 유니트 Taq DNA 폴리머라제(Promega, M791A)를 GeneAmp PCR 시스템 2400(Applied Biosystem)에서 증폭시킨 후 생성된 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔에서 100V, 40분간 전기영동하고 SYBR Safe(Invitrogen, S33102)로 염색시킨 후 영상기기 GEL Doc EZ Imager (Bio Rad)를 이용하여 염색된 RNA를 확인하였고 그 결과를 도 5b에 나타내었다.

사용된 프라이머

유전자
iNOS	센스 (sense)	5'-ATGTCCGAAGCAAACATCAC-3'
	안티센스 (antisense)	5'-TAATGTCCAGGAAGTAGGTG-3'
COX-2	센스 (sense)	5'-CCCCCACAGTCAAAGACACT-3'
	안티센스 (antisense)	5'-CCCCAAAGATAGCATCTGGA-3'
b-actin	센스 (sense)	5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'
	안티센스 (antisense)	5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'

도 5b에서 알 수 있듯이, iNOS 및 COX-2 유전자 발현도 농도 의존적으로 저해한다는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과로부터 본 발명의 조성물(한델린)의 항염증 활성은 염증반응 관련 효소인 iNOS와 COX-2의 단백질과 유전자 수준의 조절을 통해서 효소 발현을 저해한다는 것을 알 수 있었다.

1-4. NF - kB ( nuclear factor kappa - light - chain - enhancer of activated B cells ) 신호전달에 미치는 영향

상기 실시예에서 얻은 시료의 NF-kB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 신호전달에 미치는 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 (Western blot analysis)을 통해 확인하였다.

NF-κB는 p65/p50으로 이뤄진 전사 인자로 세포질 내에서 IκB와 결합하여 불활성화 상태로 존재하지만 LPS와 같은 자극이 가해지면 IκB 키나제 (IKK)에 의해 IκB가 인산화되고 분해되는 일련의 과정을 거쳐 활성화된다. 유리 NF-κB 상태가 되면 핵 안으로 이동하여 κB-결합 부위에 결합하여 염증반응에 관련하는 iNOS, TNF-α(종양 괴사인자, Tumor necrosis factor), 및 IL-1β의 유전자의 발현을 조절한다. 따라서 본 발명의 조성물의 NF-κB 신호전달 체계에 미치는 영향을 웨스턴 블럿을 이용하여 알아보았다.

구체적으로는 RAW 264.7 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 100mm 배양 접시 당 3 ⅹ 10⁵ 세포수가 되도록 희석하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 10% FBS가 포함된 배지에 세포 독성을 나타내지 않는 최고 농도인 한델린 10, 20, 및 40 μM의 본 발명의 조성물로 전처리하고 LPS (1μg/ml)로 염증반응을 유도하여 30 분간 배양하였다. 세포 배지 내에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모아 PBS로 2회 세척한 후 끓고 있는 세포 용해 완충액을 넣어 세포를 현탁 시키고 이를 100℃ 중에 5분간 가열하였다. 이를 식힌 후 20°C에서 보관하였고 사용 직전에 37°C에서 녹여 단백질 정량 및 전기영동에 이용하였다.

실험 결과, LPS만 처리한 대조군에 비해서 본 발명의 조성물 (한델린)을 처리한 실험군에서는 IκB 단백질 분해가 뚜렷하게 억제되고, NF-kB 의 p65 및 p50의 발현이 감소하였다(도 6 참조).

1-5. NF - kB 전사능 ( transcriptional activity )에 미치는 영향

NF-κB는 LPS로 염증을 유도 시 iNOS 유전자 발현에 중요한 전사인자이므로 NF-κB의 전사능 (transcriptional activity)이 한델린에 미치는 영향을 확인하기 위하여 SEAP (secreted alkaline phosphatase)실험을 다음과 같이 수행하였다.

RAW 264.7 세포에 p-NF-κB-SEAP-NPT 플라스미드(plasmid)를 stable transfection 시킨 세포 (NF-κB-RAW)를 이용하여 reporter gene assay를 시행하였다. NF-κB-RAW 세포에 LPS 즉 NF-κB의 활성을 증가시키는 물질을 처리하면 transfection되어 있는 p-NF-κB-SEAP-NPT plasmid에 의해 secreted alkaline phosphatase(SEAP)이 배지 중으로 유리되게 된다. 이를 확인하기 위하여 4-methylumbelliferyl phosphate(4-MUP; Sigma, M8883)를 기질로 하여 회수한 배지와 반응시키고, 이 때 생성되는 4-methylumbelliferone (4-MU)의 형광 강도를 측정하였다.

실험 결과, LPS를 16 시간동안 처리한 군(도 7에서 왼쪽에서 2번째 참조)에서는 LPS를 처리하지 않은 군에 비해 NF-κB의 전사능이 5.04 배 증가하였고, 한델린을 처리한 군은 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 전사능 증가를 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다. (도 7 참조).

1-6. Mitogen - activated protein kinase ( MAPK ) 단백질 발현에 미치는 영향

MAPK 패밀리인 JNK (c-Jun N-terminal kinase), ERK (Extracellular signal regulated kinase), 및 p38은 NF-κB를 활성화시키고 활성화된 NF-κB는 다시 JNK, ERK, p38를 활성화시키는 상호작용에 의해 염증 작용과 면역작용에 관여하므로 한델린이 MAPK 패밀리 단백질의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 (Western blot analysis)을 통해 확인하였다.

도 7에서 알 수 있듯이, 본 발명의 조성물인 한델린은 ERK와 JNK 단백질 발현을 저해시키지만, p38 단백질 발현 억제 효능은 없는 것으로 나타났다.

1-7. 인터루킨-1ß ( Interleukin -1 beta , IL -1ß)및 종양괴사인자-α( Tumor necrosis factor , TNF -α) 단백질과 유전자 발현에 미치는 영향

상기 실시예에서 얻은 시료의 인터루킨-1ß(Interleukin-1 beta, IL-1ß )및 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor, TNF-α) 단백질과 유전자 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 (Western blot analysis)을 통해 확인하였다.

TNF-α와 IL-1ß 는 LPS에 의해 자극 받은 세포에서 발현이 증가하는 사이토킨(cytokine)으로 IL-1β의 발현 및 염증 반응의 진행에 영향을 주므로 TNF-α와 IL-1ß의 발현 여부에 본 발명의 조성물이 미치는 영향을 시험하였다. 구체적으로는 RAW 264.7 세포에 본 발명의 조성물을 한델린 10, 20, 40 μM의 농도로 미리 전 처리하고 LPS (1 μg/ml)로 염증반응을 유도하여 각각 4시간 배양한 후 세포의 단백질 분획을 모아 웨스턴 블럿 방법으로 TNF-α및 IL-1ß 단백질 발현 정도를 측정하였고 그 결과를 도 8a에 나타내었다.

또한 유전자 수준에서 발현이 저해되는지 알아보기 위해 한델린을 10, 20, 40 μM의 농도로 미리 전 처리하고 LPS (1μg/ml) 로 염증반응을 유도하여 4시간 배양 후 RNA 분획을 모으고, RT-PCR 방법을 이용하여 유전자 발현 정도를 표 2의 프라이머를 이용하여 측정하였고 그 결과를 도 8b에 나타내었다.

실험에 사용된 프라이머

유전자
TNF-α	센스 (sense)	5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3'
	안티센스 (antisense)	5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3'
IL-1ß	센스 (sense)	5'-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3'
	안티센스 (antisense)	5'-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3'
b-actin	센스 (sense)	5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'
	안티센스 (antisense)	5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'

도 9a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물(한델린)를 처리한 실험군은 대조군에 비해 농도 의존적으로 TNF-α와 IL-1ß 의 단백질 발현 저해 효과가 나타났다. TNF-α와 IL-1ß 유전자 발현 또한 본 발명의 조성물 (한델린)에 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 9b).

1-8. 마이크로 유전자-155( MicroRNA -155) 유전자 발현 저해 효능 평가

마이크로 유전자 (microRNA, miR)는 22 염기 이하 크기의 매우 작은 내인성 비암호 (noncoding) RNA로서 전사 (transcription) 억제 및 전달자 (messenger) RNA 분쇄 (cleavage)를 통하여 다른 유전자 발현을 조절한다고 알려져 있으며, 유핵 세포에 있어서 염기서열 특징적인 유전자 조절을 설명하는 기전으로 최근 많은 관심을 모으고 있다. miRNA는 발전(development), 분화, 증식, 세포사멸 및 신진대사(metabolism)과 같은 다양한 과정에서도 중요한 역할을 한다. 염증반응에 있어서 관련된 대표적인 마이크로 유전자가 miR-155인데, 이는 리포폴리사카리이드 (LPS)등과 같은 염증성 자극에 의해서 상향 조절된다.

한델린이 마이크로유전자-155의 발현 수준과 연관성이 있는지를 알아보기 위해서 LPS를 처리한 마우스 대식세포주에서 실시간 중합연쇄반응(real-time PCR)법으로 알아보았다.

구체적으로, RAW 264.7 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 100mm 배양 접시 당 3 ⅹ 10⁵가 되도록 희석하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 10% FBS가 포함된 배지에 한델린을 10, 20, 40 μM 농도로 본 발명의 조성물을 희석한 후, 100 mm 배양 접시에 준비된 배지를 10 ml 첨가하여 일정 시간 배양하였다. 세포 배지 내에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모아 PBS로 2회 세척한 후, TRI 시약(TRIzol, (Invitrogen, Cat#.15596-026))을 이용하여 세포를 깨서 모은 후 CHCl3를 첨가하여 RNA를 추출하고, 이소프로필알코올을 이용하여 침전시켰다. RNA 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후 공기 중에서 건조시킨 후 뉴클레아제로 오염되지 않은 물(nuclease-free water)에 현탁시켰다.총 RNA의 용출 양(amount)과 질(quality)은 Nanodrop을 이용하여 측정한 후, 용출한 전체 RNA를 ㎕ 당 50ng로 다시 희석하였다.

마이크로유전자의 역전사는 제조사의 권고에 따라 TaqMan 마이크로유전자 역전사 키트(Applied Biosystem, Cat#. 4366596)를 사용하여 수행하였다. 간단히, 마이크로유전자의 5 ng를 dNTPs, 멀티스크라이브 역전사효소(MultiScribe reverse transcriptase) 및 표적 마이크로유전자에 특이적인 프라이머와 결합하였다. 결과로 얻은 cDNA를 15배 희석하였고 PCR 반응에서 사용하였다. PCR은 제조사의 권고(Applied Biosystem)에 따라 TaqMan MicroRNA 어세이(mmu-miR-155-5p (Applied Biosystem,4427975))를 사용하여 수행하였다. 간단히, cDNA를 표적 마이크로유전자에 특이적인 TaqMan 어세이와 결합하였고 PCR 반응을 사용하여 수행하였다.

그 결과, 대조군에 비해 LPS만을 처리한 군에서 마이크로유전자-155 발현수준이 21 발현수준이 20.1배 증가해 있음을 확인하였고, 한델린을 처리하였을 때는 농도 의존적으로 발현량이 감소하였다(도 10). 특히, 한델린 최고농도인 40μM에서는 마이크로유전자-155 발현량이 대조군의 3.3배로 눈에 유의적으로 나타났다.

실험예 2. 카라기난 ( carrageenan ) 유도에 의한 족부종 동물 모델

카라기난을 기염물질로 이용하여 염증 반응을 유도시킨 동물 모델을 통해 본 발명 조성물의 항염증 효능을 다음과 같이 실험하였다.

Sprague-Dawley (SD)계 래트 (150~200g, male, n=6, 중앙동물실험)의 오른쪽 뒷발의 발목 관절 부위를 체적변동기록계(plethysmometer, U해 Basile, Cat#. 7140)를 이용하여 발 부피를 측정하여 초기 발바닥 부피로 정한 후 (basal line), 카르복시메틸 셀룰로스(Carboxylmethyl cellulose (Sigma, 419311))에 녹인 본 발명의 조성물 한델린 (실험군)과 양성 대조군 인도메타신(Indomethacin; Sigma, I7378))을 각각 랫에 경구 투여했다. 30분 후 1% 카라기난(Carrageenan; Fluka, 22049)을 멸균 증류수에 녹인 후 0.1 ml를 발바닥에 피하 주사하였다. 예비 실험 (기염물질 투여 후, 시간마다 발바닥 부피를 측정하여 실험 시간을 결정함)에서 기염물질에 의한 발바닥 부피가 약 4 시간에서 가장 높게 올라간 후 시간이 지나면서 부피가 가라앉는 것이 관찰되어, 본 실험에서는 기염물질 투여 후 6시간 동안 관찰하였으며 한 시간 간격으로 부종정도를 측정하여 초기 부피와 비교하여 부종 증가율을 수학식 2 에 의해 계산하여 기염제에 의해 유도되는 염증반응에 대한 본 발명 조성물의 항염증 활성을 평가하였고, 그 결과를 도 11a 에 나타내었다.

도 11a에 도시된 바와 같이, 실험 개시 후 6시간 경과를 살펴보면, 카라기난만을 투여한 대조군의 부종 증가율에 비해 실험군인 한델린과 양성 대조군인 인도메타신을 투여한 군의 부종 증가율이 저하되었다.

실험예 3. TPA 유도 귀부종 동물 모델

상기 실시예에서 얻은 시료의 TPA 유도 귀부종 동물의 부종에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.

파두유(croton oil) 유래 물질인 포르볼 12-미리스테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate; tetradecanoyl phorbol acetate; TPA)는 프로테인 키나제 C를 활성화시켜 발암을 유발하는 독성물질로 알려져 있으며, 본 실험에서는 TPA(Sigma, P8139)를 마우스(ICR mouse (20~25g), male, n=7, 중앙실험동물)의 귀 표면에 국소적으로 도포하여 발적 및 염증을 유도하여 이용하였다.

구체적으로는 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC)에 녹인 본 발명 조성물 (한델린)과 양성 대조군인 인도메타신을 각각 마우스에 경구 투여하고, 1 시간 후 acetone(Sigma, 270725)에 녹인 TPA (2.5 μg/20μl)를 오른쪽 귀 바깥쪽과 안쪽 표면에 각각 발라 부종을 유발시켰다. 4시간 후 왼쪽 (대조군)과 오른 쪽 귀 바깥쪽을 같은 위치에 똑같은 크기로 펀칭하여 미리 칭량해 둔 에펜트로프 튜브에 담아 미세 저울로 왼쪽 귀와의 무게 차이를 측정하였고, 그 결과를 도 12a 에 나타내었다.

도 12a에 도시된 바와 같이, 한델린과 양성 대조군인 인도메타신을 투여한 군의 부종 증가율은 20mg/kg 농도에서 50% 이상 저하되어 있었으며, 본 발명 조성물 (한델린)은 경구 투여에 의하여 농도 의존적으로 귀부종 억제 효과를 나타내었다.

하기에 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

한델린(handelin) ------------------------------------------- 200 mg

유당 ------------------------------------------------------- 100 mg

탈크 -------------------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

한델린(handelin) ------------------------------------------- 200 mg

옥수수전분 ------------------------------------------------- 100 mg

유당 ------------------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------------------ 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

한델린(handelin) ------------------------------------------- 200 mg

결정성 셀룰로오스 -------------------------------------------- 3 mg

락토오스 -------------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 -------------------------------------- 0.2 mg

통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

한델린(handelin) ------------------------------------------- 200 mg

만니톨 ----------------------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 ---------------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O ------------------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

한델린(handelin) ------------------------------------------- 200 mg

이성화당 ----------------------------------------------------- 10 g

만니톨 -------------------------------------------------------- 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

한델린(handelin) ------------------------------------------- 1000 mg

비타민 혼합물 ------------------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------------------------ 70 ㎍

비타민 E ---------------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 -------------------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 -------------------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 --------------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 -------------------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ----------------------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ------------------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ---------------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 --------------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ----------------------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ------------------------------------------------- 적량

황산제1철 -------------------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 --------------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ----------------------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 -------------------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 -------------------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 --------------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ---------------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ----------------------------------------------- 24.8 ㎎

제제예 7. 건강 음료의 제조

한델린(handelin) ------------------------------------------- 1000 mg

구연산 ----------------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 ----------------------------------------------------- 100 g

매실농축액 ----------------------------------------------------- 2 g

타우린 --------------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 ---------------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

1. 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증관련 질환의 치료 및 예방용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 염증관련 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크; 류마티스 관절염, 골관절염, 강직 척추염; 혈관염, 흉막염, 심장막염, 허혈 관련 염증, 염증성 동맥류; 신장염; 간염; 만성 폐염증 질환; 기관지 염증, 비염; 피부염; 위염; 대장염, 과민성대장증후군; 감염에 의한 열 및 근육통으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환임을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 염증관련 질환은 비염, 기관지염, 간염, 천식, 궤양성 대장염, 또는 류마티스 관절염임을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 염증관련 질환은 비염, 천식, 또는 류마티스 관절염임을 특징으로 하는 조성물.
5. 산국 추출물로부터 분리된 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 염증 관련질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 제 5항에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태인 건강기능식품.
7. 산국 추출물로부터 분리된 항염활성을 나타내는 한델린(handelin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가제.

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