KR20180108143A - 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 작두콩 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 구체적으로, 대식세포에 대한 TNF-α, IL-6등과 같은 염증성 사이토카인의 생성 감소 및 억제, iNOS, COX-2의 발현을 억제하며, 염증전사인자의 활성을 억제하여, 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물로서 바람직하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 우수한 염증 억제 효과를 나타내는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
작두콩(Canavalia gladiata, sword bean)은 장미목 콩과에 속하는 한해살이 덩굴성 식물로서, 콩의 여러 종류 중에서 크기가 가장 크고 맛도 뛰어난 것으로 알려져 있다. 작두콩에는 가수분해 효소인 우레아제(urease), 혈구응집소(hemagglutinin), 카나발린(canavalin), 리놀렌산, 사포닌, 콜린, 레시신, 식이 섬유소, 그리고 단백질 등의 다양한 생리활성물질이 함유되어 있는 것으로 알려져 있어, 기능성 식품 및 의약품 소재로서 주목 받고 있다.
작두콩은 한방에서는 도두(刀豆)라고 하며, 염증을 없애는 작용이 뛰어나고 신체의 면역력을 키워주기 때문에 각종 종기나 화농성 질병에 효과가 있으며, 뱃속을 따뜻하게 하고 천식, 가래, 관절염에 효과가 있고, 신장을 튼튼하게 하고 이수작용이 있어 관절염, 신허요통, 변비, 비만증 등을 두루 치료한다고 알려져 있다.
염증은 감염으로 인한 인체 조직손상을 막는 방어기전으로 발전, 발열, 통증과 같은 증상을 수반한다. 이러한 염증반응이 장기간 지속적으로 반복될 경우 퇴행성질환과 같은 각종 만성질환과 암 등을 발병할 수 있는 요인이 된다. 대식세포(macrophage)는 인체 내 면역반응에서 일산화질소(nitric oxide; NO), 프로스타글란딘(prostaglandin; PG)과 pro-inflammatory cytokine 등과 같은 염증 매개물질 생성에 관여하고 이를 조절한다. 이러한 염증 매개물질은 염증반응을 유도하며, 숙주의 면역반응이 적절하게 대응하지 못할 경우 염증성 질환을 유발한다. Nitric oxide synthase (NOS)에는 neuronla NOS, endothelia NOS, inducible NOS (iNOS)가 있는데, 이중 iNOS 에 의한 NO 생성이 절대적으로 많으며, 과도하게 생성될 경우 조직 손상, 유전자 변이 등을 야기한다. 그 외 cyclooxygenase (COX)는 혈소판 형성, 신장기능 유지, 위 벽 보호 등의 정상적인 생체기능에 작용하는 COX-1과 발열과 통증에 관여하며 염증반응에 발현하는 COX-2로 분류된다. 이와 같이 염증반응에서 iNOS와 COX-2에 의해 생성되는 NO와 PGE2와 같은 물질의 생성 억제를 확인하여 항염증 효과를 확인할 수 있다.
최근에는 천연소재를 이용한 여러 가지 만성질환에 대한 예방·치료 효과 및 염증반응에 관여하는 효소들을 억제하는 천연 항염증 물질에 관한 연구들이 진행되고 있으나, 아직까지 미흡한 실정이다. 또한 작두콩 관련 국내 외 연구로는 항산화 효과, 도두로 부터 분리한 항균 활성 추출물 및 그 제조방법, 작두콩과 금송혼합 추출물을 이용한 피부화장품, 도두를 이용한 항선충 제제의 개발, 작두콩 등을 이용한 면역 기능 증강 및 항산화 기능성식품의 개발, 알러지 및 염증 치료용 조성물 등이 보고된 바 있으나, 작두콩을 이용한 항염증에 관한 연구는 부족한 실정이다.
본 발명자들은 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 연구 노력하였고, 그 결과 작두콩 추출물이 활성화된 대식세포의 염증반응을 억제시키며 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 매우 유효하다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 완숙/미숙 작두콩 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 작두콩 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 작두콩 및 콩깍지 추출물인 의약 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 콩깍지 추출물인 의약 조성물.
4. 위 1에 있어서, 상기 작두콩은 완숙 작두콩인 의약 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 물 및 프레타놀 A의 혼합 용매 추출물인 의약 조성물.
6. 위 5에 있어서, 상기 혼합 용매는 물 및 프레타놀 A를 1:9 내지 3:7의 부피비로 포함하는 의약 조성물.
7. 위 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 에틸아세테이트 분획물인 의약 조성물.
8. 위 1에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환인 의약 조성물.
9. 위 1에 있어서, 상기 염증성 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인, 의약 조성물.
10. 작두콩 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
11. 위 10에 있어서, 상기 작두콩은 완숙 작두콩인 건강기능식품.
12. 위 10에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 물 및 프레타놀 A의 혼합 용매 추출물인 건강기능식품.
13. 위 10에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 에틸아세테이트 분획물인 건강기능식품.
14. 위 10에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환인 건강기능식품.
15. 위 10에 있어서, 상기 염증성 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인 건강기능식품.
본 발명에 따른 작두콩 추출물은 대식세포에 대한 TNF-α, IL-6등과 같은 염증성 사이토카인의 생성 감소 및 억제, iNOS, COX-2의 발현을 억제하며, 염증전사인자의 활성을 억제한다. 이에, 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물로서 바람직하게 사용될 수 있다.
도 1은 완숙 및 미숙 작두콩 전체 콩깍지 모습을 나타낸 도이다.
도 2는 완숙/미숙 작두콩추출물의 농도별 RAW264.7 세포(A) 및 마우스 복강대식세포(B) 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 완숙/미숙 작두콩추출물이 LPS에 의한 염증 매개 인자의 생성을 억제하는 정도를 나타낸 그래프이다. (A) NO, (B) PGE2, (C) iNOS 단백질, (D) COX-2 단백질
도 4는 완숙/미숙 작두콩추출물이 RAW264.7 세포(A,B) 및 마우스 복강대식세포에서(C,D) LPS에 의한 염증성 사이토카인의 활성 억제 정도를 나타낸 그래프이다. (A,C: IL-6, B,D: TNF-α)
도 5는 PMA 및 LPS 에 의해 유도된 전자 조절 인자(NF-κB)의 활성이 완숙/미숙 작두콩추출물에 의해 억제되는 정도를 나타낸 도이다. (A: NF-κB report assay, B: NF-κB 면역형광분석, C: 세포질 및 핵 내 IB 단백질 및 NF-κB)
도 6은 완숙/미숙 작두콩 추출물에 의해 염증 메커니즘에 관여하는 단백질 억제를 나타낸 도이다.
도 7은 DSS로 유도된 염증성 장 질환 모델에서의 각 실험 군별 완숙 작두콩추출물 투여 후 체중 및 장 길이의 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 DSS로 유도된 염증성 장 질환 모델에서의 각 실험 군별 완숙 작두콩추출물 투여 후 염증성 매개 인자 단백질을 억제하는 정도를 나타낸 도이다.
도 9는 DSS로 유도된 염증성 장 질환 모델에서의 각 실험 군별 완숙 작두콩추출물 투여 후 염증성 사이토카인 활성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 HPLC 분석 시스템을 이용하여 작두콩 추출물 내 gallic acid의 양을 탐색한 결과이다.
도 11은 작두콩 추출물 및 그 분획물의 세포독성 시험 결과이다.
도 12는 작두콩 추출물 및 그 분획물의 NO 억제 효과를 나타내는 시험 결과이다.
도 13은 작두콩 추출물 및 그 분획물의 염증성 사이토카인 분비 억제 효과를 나타내는 시험 결과이다.
도 2는 완숙/미숙 작두콩추출물의 농도별 RAW264.7 세포(A) 및 마우스 복강대식세포(B) 생존율에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 완숙/미숙 작두콩추출물이 LPS에 의한 염증 매개 인자의 생성을 억제하는 정도를 나타낸 그래프이다. (A) NO, (B) PGE2, (C) iNOS 단백질, (D) COX-2 단백질
도 4는 완숙/미숙 작두콩추출물이 RAW264.7 세포(A,B) 및 마우스 복강대식세포에서(C,D) LPS에 의한 염증성 사이토카인의 활성 억제 정도를 나타낸 그래프이다. (A,C: IL-6, B,D: TNF-α)
도 5는 PMA 및 LPS 에 의해 유도된 전자 조절 인자(NF-κB)의 활성이 완숙/미숙 작두콩추출물에 의해 억제되는 정도를 나타낸 도이다. (A: NF-κB report assay, B: NF-κB 면역형광분석, C: 세포질 및 핵 내 IB 단백질 및 NF-κB)
도 6은 완숙/미숙 작두콩 추출물에 의해 염증 메커니즘에 관여하는 단백질 억제를 나타낸 도이다.
도 7은 DSS로 유도된 염증성 장 질환 모델에서의 각 실험 군별 완숙 작두콩추출물 투여 후 체중 및 장 길이의 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 DSS로 유도된 염증성 장 질환 모델에서의 각 실험 군별 완숙 작두콩추출물 투여 후 염증성 매개 인자 단백질을 억제하는 정도를 나타낸 도이다.
도 9는 DSS로 유도된 염증성 장 질환 모델에서의 각 실험 군별 완숙 작두콩추출물 투여 후 염증성 사이토카인 활성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 HPLC 분석 시스템을 이용하여 작두콩 추출물 내 gallic acid의 양을 탐색한 결과이다.
도 11은 작두콩 추출물 및 그 분획물의 세포독성 시험 결과이다.
도 12는 작두콩 추출물 및 그 분획물의 NO 억제 효과를 나타내는 시험 결과이다.
도 13은 작두콩 추출물 및 그 분획물의 염증성 사이토카인 분비 억제 효과를 나타내는 시험 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 작두콩 추출물을 포함한다.
본 발명자들은 작두콩(Canavalia gladiata, sword bean)의 추출물이 세포의 NO 생성 억제 효과와 세포 내 염증 관련 단백질 발현 억제 효과가 우수하고, 이에 해당 추출물 투여시 염증성 질환 모델에서의 회복 효과가 우수한 것을 발견한 것에 착안하여 본 발명을 고안하였다.
본 발명의 작두콩 추출물은 작두콩의 추출물로서, 이는 작두콩만의 추출물이거나, 작두콩 콩깍지만의 추출물이거나, 작두콩과 콩깍지의 혼합 추출물일 수 있다.
본 발명의 작두콩 추출물은 미숙 작두콩 추출물, 완숙 작두콩 추출물 또는 이들의 혼합 추출물일 수 있다. 바람직하게는 완숙 작두콩 추출물일 수 있다.
본 명세서에서 미숙 작두콩은 열매 꼬투리가 맺어 녹색을 띈 시기(도 1 하단, 예를 들면 3~4월에 파종하여 6~7월에 수확), 완숙 작두콩은 열매 꼬투리가 맺힌 상태에서 갈색으로 변한 시기(도 1 상단, 예를 들면 3~4월에 파종하여 8~10월에 수확)의 작두콩을 의미한다. 상기 파종, 수확시기 등은 재배 조건에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 작두콩 추출물은 통상의 용매로 통상의 방법으로 추출된 것일 수 있다.
추출 용매는 예를 들면, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 그 외 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산, 프레타놀 A, 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있다.
구체적으로, 물과 프레타놀 A 의 혼합 용매를 사용할 수 있다. 그 혼합비는 예를 들면, 물과 프레타놀A를 1:9 내지 3:7의 부피비로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추출 온도는 20 내지 100℃, 추출 기간은 약 1시간 내지 4일, 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가로, 당 분야에 널리 알려진 조건으로 여과, 농축, 건조 등의 공정을 거칠 수도 있다.
또한, 본 발명의 작두콩 추출물은 상기 용매 추출물의 특정 용매 분획물일 수 있다. 예를 들면, 핵산(Hexane), 클로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(EA), 부탄올(n-BuOH) 등의 분획물일 수 있다. 상기 용매 중 바람직하게는 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.
본 명세서에서 염증성 질환은 염증이 매개된 모든 질환을 의미한다. 구체적으로, 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 크론병, 궤양성 대장염일 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 선천면역과 관련한 대식세포에서의 염증매개인자(NO, TNF-α, IL-6)들에 대한 생성 억제 효과가 우수하여, 다양한 염증 질환에 대한 우수한 약효를 나타낼 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 작두콩 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
작두콩 추출물, 염증성 질환에 대한 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 우수한 기능성을 갖는 작두콩 추출물을 포함하여 제조, 가공된 식품으로서, 제형을 불문하고, 모든 식품을 포함하는 의미이다.
본 발명의 건강기능식품은 작두콩 추출물을 포함한 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 액제 제형 등으로 제형화된 것일 수도 있다. 이들은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 제형화될 수 있다.
본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
상기 상술한 제형 내 기능성분으로서의 본 발명의 건강기능식품의 함량은 사용 형태 및 목적, 사용자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 50 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실시예
. 작두콩 추출물의 제조
완숙과 미숙 작두콩 전체 콩깍지(도 1) 2kg에 2L 추출용매를(증류수 400mL, 프레타놀A (주정) 1600mL)가하여 3시간 동안 70℃에서 환류시켜 각각의 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물을 여과지로 여과한 후, 여과액을 회전진공농축기로 감압 농축하였다. 그 다음, 동결 건조하여 얻은 각각의 추출물을 DPBS에 200mg/mL 농도로 녹인 후 시린지필터(0.22㎛)하였다. 이를 실험시료(작두콩추물물 완숙; RSBE, 미숙; GSBE)로 사용하였다.
실험예
세포배양
마우스 대식세포주인 RAW264.7 및 293T세포는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구했으며, 10% FBS와 100U/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin 이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 계대하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양되었다.
마우스 복강대식세포 분리 및 배양
마우스 복강에 약 10mL의 RPMI1640 배지를 주입하고 부드럽게 복강을 마사지 한 후, 복강 내 배지를 뽑아내어 복강대식세포를 모았다. 배지를 이용하여 2번 정도 세척하고 10% FBS와 100U/mL penicillin, 100μg/mL streptomycin 이 첨가된 RPMI1640 배지에 부유시켜 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 배양 후 살아있는 세포만 실험에 사용하였다.
세포독성 시험
세포독성시험은 MTS assay로 시행되었으며, RAW264.7세포 (1×104cells/well)를 하룻밤 배양하여 시료를 농도별로 24시간 처리하였고, 마우스 복강대식세포(1×105cells/well)에 시료를 농도별로 48시간 처리하였다. 배양액에 MTS시약을 20uL 첨가하여 1~4시간 후에, microplate spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., VT, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이는 도 2와 같다. 세포독성시험결과 각각의 농도별 RSBE 및 GSBE에서 세포 생육을 저해하지 않은 것으로, 즉 세포독성이 없음을 확인하였다.
NO 및
PGE
2
생성량 측정
NO 생성량 측정은 세포 배양액 내의 nitrite 농도를 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하였다. RAW264.7 세포를 48-well plate에 세포수가 1 × 105cells/well이 되게 분주하고 24시간 배양하였다. 그 후 시료 RSBE 및 GSBE를 1시간 전 처리하고, LPS (1ug/mL)로 24시간 동안 NO 생성을 유도한 뒤 배양 상등액과 Griess reagent를 1:1로 혼합하여 microplate spectrophotometer를 사용하여 570 nm에서 NO 생성량을 측정하였다. Sodium Nitrite (NaNO2)를 사용하여 standard curve를 작성한 후 NO측정에 사용하였다. 배양 상등액 내 PGE2 생성량을 ELISA kit (BD Bioscience, MN, USA)를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 실험하였다. 결과는 도 3과 같다.
항염증 효과를 NO 생성 억제 능으로 확인한 결과, LPS를 처리한 세포의 NO 생성량은 LPS를 처리하지 않은 대조구와 비교했을 때 증가하였다. RSBE 및 GSBE 시료는 LPS에 의한 NO 생성을 용량 의존적으로 억제하였다. 도 3 (A)와 같이 2mg/mL 농도에서 RSBE보다 GSBE 시료의 경우 NO 저해활성이 크게 나타났다.
다른 염증물질 PGE2 생성량을 도 3 (B)에서 나타내었다. 시료 RSBE 및 GSBE를 처리하였을 때, 농도 의존적으로 생성량이 억제되었으며, RSBE 2mg/mL 농도에서 PGE2 생성 억제가 높게 나타났다.
iNOS
및 COX-2 발현 억제 효능 평가 (Western-blotting)
세포 내 염증관련 단백질 발현 양상측정은 Western blot분석을 적용하여 실시하였다. RSBE, GSBE의 세포염증 억제효과를 알아보기 위하여 iNOS와 COX-2 단백질의 양을 측정하였다. RAW264.7 세포를 6-well plate에 세포수가 1× 106cells/well 되게 분주하고 4시간 배양한 후, 시료(RSBE, GSBE: 2mg/mL)와 대조군 약물 (celecoxib: 20uM)을 1시간 전처리 후, LPS(1ug/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 세포를 DPBS로 2회 세척한 후, lysis buffer (25mM Tris pH 7.5 with H3PO4, 2mM CDTA, 1% TritonX-100, 2mM DTT, 10% glycerol)에 phosphatase inhibitor cocktail을 첨가한 buffer를 사용하여 cell lysate를 준비하였고, 4℃ 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등 액을 총 단백질 추출액으로 사용하였다. Bradford assay (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)로 단백질을 정량하였으며, 단백질 30㎍를 100℃에서 10분간 끓인 후, 10% SDS-PAGE에서 100 V에서 전기 영동하였다. PVDF에 단백질을 부착하고, 5% skim milk로 blocking하였으며, 1차 항체로 iNOS 와 COX-2를 각각 반응시킨 후, 2차 항체로 HRP-conjugated anti-rabbit antibody로 처리하였다. 목적단백질을 동정하기 위하여 기질로 ECL (enhancedchemiluminescence, Advansta Inc., CA, USA)을 사용한 후, membrane을 C300 chemiluminescence imager (Azure Biosystems, Inc., CA, USA)를 사용하여 밴드를 현상하였다.
RSBE, GSBE의 LPS로 유도된 iNOS, COX-2 단백질의 저해활성을 확인한 결과 도 3 (C,D)과 같다. LPS에 의해 iNOS, COX-2 단백질의 발현이 증가함을 확인할 수 있다. 2mg/mL 농도의 RSBE, GSBE은 iNOS, COX-2 두 개의 단백질에 대해 동시에 저해활성을 가지는 것으로 나타났으며, RSBE의 COX-2 단백질의 대조군 약물인 celecoxib 만큼의 강한 저해활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
염증성 사이토카인 분비량 측정
염증성 사이토카인 분비 억제 효능을 알아보기 위하여, RAW264.7 세포(1×105cells/well)는 48-well plate에 24시간 동안 배양했으며 마우스 복강대식세포(4×105cells/well)는 48-well plate에 분주하여 사용하였다. 세포에 농도별로 시료를 1시간 전처리 후, 1㎍/mL의 LPS를 처리하여 24시간 재 배양하였다. 배양액 내의 IL-6 (Biolegend, CA, USA) 및 TNF-α (BD Bioscience, MN, USA) cytokine의 분비량을 ELISA kit를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 실험하였으며, microplate spectrophotometer를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 결과, 시료 RSBE 및 GSBE 농도별 각 사이토카인의 분비량이 농도 의존적인 감소를 보였다 (도 4). RAW264.7 세포와 마우스 복강대식세포 RSBE 2mg/mL 시료를 처리한 군에서는 LPS 단독 처리한 대조군 대비 IL-6 및 TNF-α 사이토카인 분비량을 크게 억제하는 효과를 보였다.
염증전사인자
NF
-B reporter assay
293T 세포 (1×104cells/well)가 들어있는 96-well plate의 각 well에 100ng의 pNF-κB- SEAP report plasmid를 HilyMax (Dojindo molecular technologies, Inc. MD, USA)와 함께 처리하여 18시간 동안 transfection 시켰다. 그 다음 시료를 1시간 전처리 하고, PMA(3ng/mL)로 24시간 자극시켰다. 이후, 세포배양액과 QUANTI-Blue (Invitrogen, MA, USA) 를 4시간 반응시킨 후, microplate spectrophotometer를 이용하여 630 nm에서 흡광도를 측정하여 NF-B 의 활성을 측정하였다.
NF-B의 활성은 PMA 자극에 의해 현저히 증가하였으며, 이는 PMA 자극에 의해 활성화된 NF-B 가 NF-b의 promotor를 가진 SEAP의 발현을 증가시켰음을 의미한다. 이에 대한 RSBE, GSBE의 억제 효과는 농도별 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. RSBE 2mg/mL의 경우 PMA 대조군에 비해 48% 이상 억제하는 결과 도 5 (A)에 나타냈다.
염증전사인자
NF
-B의
면역형광분석법에
의한 활성 분석
RAW264.7 세포를 2×104cells/well로 8-well chamber slide (Lab-Tek, MD, USA)에 분주하였다. 세포에 RSBE, GSBE을 각각 2mg/mL 및 대조군 약물 bay11-7082 30uM 농도로 1시간 전처리 후, 1 ㎍/mL의 LPS를 처리하여 2시간 자극시켰다. 세포를 4% paraformaldehyde로 15분 동안 반응시켜 고정시키고, 0.1% Triton X-100이 포함된 1% BSA/PBS에 blocking 하였다. 세포를 세척 후, NF-κB 항체를 4℃에서 O/N 반응시켰다. 그 다음, 세포를 세척 후 Alexa Fluor 488-labeled secondary antibody 반응시킨 뒤, DAPI로 핵을 염색하였다. confocal microscopy (Carl Zeiss, Jena, Germany)로 세포를 관찰하였다.
아무런 자극이 가해지지 않은 상태에서 NF-κB/p65 (녹색)은 DAPI로 염색된 핵(청색) 주변에 대부분 분포하는 것이 관찰되지만, LPS로 자극한 경우 녹색인 NF-κB/p65의 대부분은 청색인 핵과 함께 분포하는 것으로 나타났고 이는 NF-κB가 활성화되어 핵으로 이동했음을 보여주는 결과이다. 이러한 세포에 대조군 약물 (bay 11-3082) 30uM을 처리한 경우 NF-κB/p65는 다시 핵 주변의 세포질에 분포하는 것으로 관찰되었다. RSBE, GSBE 각각 2mg/mL 전 처리한 경우 대부분의 NF-κB/p65 가 핵 주변 세포질에 발현 되었으며, RSBE의 경우 GSBE에 비해 NF-κB 의 활성화가 현저하게 억제되고 있음을 보여주고 있다 (도 5 (B)).
세포질 및 핵 내
염증전사인자
NF
-B의 억제확인
NF-κB의 활성화 정도를 분석하기 위해 RSBE, GSBE 및 LPS 각각 처리한 RAW264.7 세포로부터 세포질 및 핵단백질 추출물을 각각 분리 제조하였다. 즉, 시료를 처리된 세포(1×106cells/dish)를 PBS로 세척하여 회수하고, 180uL의 hypotonic buffer [10mM Tris-HCL, 10mM NaCl, 3mM MgCl2,0.02% NaN3,0.5mM DTT, 1mM PMSF, pH7.4]를 넣고 20㎕의 5% nonidet NP-40을 첨가하여 5분 동안 반응시켰다. 이후 원심분리 (1,800g, 4℃, 5분)한 후 상층액을 세포질 추출물로 이용하였다. 침전물은 hypotonic buffer로 한번 세척하고, hypertonic buffer [20mM HEPES, 25% glycerol, 40mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA, 0.02% NaN3, 0.5mM DTT, 1mM PMSF, pH7.4]를 넣고 1시간 동안 얼음 위에 방치시킨 다음 원심분리 (13,000g, 4℃, 10분)하여 상층액을 회수하여 핵단백질을 추출물로 사용하였다. NF-κB 및 IB의 활성화 정도는 Western blot으로 분석하였다.
NF-κB의 활성화에 따른 핵으로의 이동은 이를 억제하는 단백질인 IB의 인산화에 의한 분해에 의한다. 도 5 (C)와 같이, LPS 자극에 의해 세포질의 IB 양이 감소하였고, NF-κB 양은 증가함으로써 IB인산화 증가에 의한 분해가 일어났으며 NF-κB 활성화를 나타내고 있다. RSBE, GSBE 처리에 의해 IB의 경우 그 양이 증가하였으며, 이러한 결과는 핵에서 NF-κB 의 수준이 감소하는 결과를 초래하였다.
LPS로
유도되는
MARKs
활성화에 대한 억제효과
시료에 의한 NF-B 신호경로에 어떠한 신호단백들이 관여하는지를 알기 위하여 MARKs (ERK, JNK, p38) 인산화를 Western blot으로 분석하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, LPS로 유도된 RAW264.7세포에서 RSBE, GSBE 처리에 의하여 JNK 및 ERK 인산화가 감소하였으나, p38의 인산화에는 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 IB의 인산화는 물론 NF-b와 상위 단백질의 인산화를 조절함으로써 항염증 활성을 나타낸 것을 의미한다 (도 6).
실험동물
BALB/C계 16-18g 내외의 6주량 마우스를 다물사이언스(대전, 한국)에서 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 이틀간 실험환경(온도 24±1℃, 습도 55±5%, 명암주기 12시간으로 자동 조절)에서 적응시킨 다음 실험에 착수하였다.
실험군은 그룹 당 5마리씩 3개 군으로, 즉 정상대조군(Control), 염증성 장 질환 유발군 (DSS), 염증성 장 질환을 유발시킨 다음 상기 실시예에서 제조한 RSBE을 복강투여로 4일간 제공한 군(DSS+RSBE)으로 분류한 다음, 8일간 사육하였다. 실험 기간 동안 실험동물에 대하여 체중 변화를 조사하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
DSS에 의한 염증성 장 질환 유발
덱스트란 소듐 설페이트(Dextran sodium sulfate, MW: 36,000~50,000Da, MP Biomedicals, CA, USA)를 이용한 장 질환 모델은 이와 같은 방법(Chemically induced mouse models of intestinal inflammation, Wirt ea al., Nature Protocols 2 541-546 (2007))으로 하였다.
구체적으로, 6주령 마우스에게 DSS를 3.5%로 식수에 첨가하여 자유섭취 시켰다. 4일 이후 상기 실시예에서 제조한 RSBE를 kg당 2g으로 4일간 복강투여 하였다.
실험 사육이 끝난 마우스를 경추 탈골시켜 복부를 절개한 다음 대장(Large intestine)을 적출하였다. 하기 도 7은 본 발명의 RSBE 투여에 따른 마우스 체중 및 대장의 길이를 나타낸 것이다. 본 발명의 RSBE 투여에 의한 대장 길이의 경우에는 DSS를 투여한 군에서 장의 길이가 유의적으로 낮았고, RSBE를 복강 투여시킨 군은 대장 염증으로 유도하지 않은 수준까지 대장 길이를 회복하였다. 마우스 체중의 경우에는 DSS를 투여한 군에서 약 10%정도 무게가 빠졌고, RSBE를 복강 투여 3일 이후 거의 정상군 몸무게와 비슷한 수준까지의 몸무게를 회복하였다.
염증성
매개인자
사이토카인 분비 측정 및 염증성 지표 단백질 확인
마우스 대장 조직으로부터 분리한 단백질에서 염증성 지표의 사이토카인 분비양과 염증성 지표 단백질을 확인하였다.
대장 조직을 차가운(ice-cold) 상태에서 단백질 추출 용액(Biovision, CA, USA)을 넣고 균질화 하였다. 이를 원심분리 (13,000rpm, 10min, 4℃)하여 상층 액을 실험에 사용하였다. 이를 10% SDS-PAGE에서 100 V에서 전기 영동하였다. PVDF에 단백질을 부착하고, 5% skim milk로 blocking하였으며, 1차 항체로 iNOS, COX-2, NF-κB, IκB-α를 각각 반응시킨 후, 2차 항체로 HRP-conjugated anti-rabbit antibody로 처리하였다. 목적단백질을 동정하기 위하여 기질로 ECL (enhancedchemiluminescence, Advansta Inc., CA, USA)을 사용한 후, membrane을 C300 chemiluminescence imager (Azure Biosystems, Inc., CA, USA)를 사용하여 밴드를 현상하였다.
RSBE의 LPS로 유도된 iNOS, COX-2 단백질의 저해활성을 확인한 결과 도 8과 같다. DSS에 의해 iNOS, COX-2 단백질의 발현이 증가함을 확인할 수 있다. RSBE 복강 투여군에서 iNOS, COX-2 두 개의 단백질에 대해 동시에 저해활성을 가지는 것으로 확인하였다.
조직으로부터 얻은 상층액 내의 IL-6, IFN-γ (Biolegend, CA, USA) 및 TNF-α,IL-1β (BD Bioscience, MN, USA) cytokine의 분비량을 ELISA kit를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 실험하였으며, microplate spectrophotometer를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 9 결과와 같이, DSS를 투여한 군은 모든 사이토카인 양이 증가하였으나, RSBE 복강 투여군의 사이토카인 양은 DSS를 투여한 군에 비하여 유의적으로 감소하였다.
HPLC
분석에 의한 정량
RSBE 및 GSBE에 대해 gallic acid를 정량하기 위해 HPLC 분석을 수행하였다. 분석조건 중 column은 LUNA C18 column(5 μm, 4.6 x 250 mm, CA, USA)을 사용하였으며, 이동상은 water: acetonitrile (95:5), pH 3.0 by O-phosphoric acid로 사용하였고, 분석시간은 10분으로 하였다. 시료의 주입량은 20 μL, 이동상 유속은 1.0 mL/min, UV 검출장치의 파장은 271nm로 분석하였다.
HPLC 분석 시스템을 이용하여 시료 내 gallic acid의 양을 탐색한 결과는 도 10과 같다. 도 10에서 확인되는 바와 같이 gallic acid 표준품은 6.2min 시간대에 검출되었다. RSBE와 GSBE 내gallic acid 양은 0.00147% (w/w)와 0.00019% (w/w)로 분석되었다. RSBE 내 gallic acid양이 GSBE에 비해 약 10배 높은 것으로 나타났다.
실시예
. 완숙 작두콩 추출물
분획물의
제조
상기 추출물에서 제조한 완숙 작두콩 추출물; RSBE 10g을 1L의 증류수에 현탁시키고 계통학적 분획방법에 따라 동량의 핵산(Hexane), 클로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(EA), 및 부탄올(n-BuOH)로 순차적으로 각각 2회씩 추출하여 분획하고, 회전진공농축기로 감압 농축하여 완숙 작두콩 추출물 분획물을 제조하였다. 그 다음, 동결 건조하여 얻은 각각의 분획물은 핵산 층에서 1.065g, 클로로포름 층에서 0.503g, 에틸아세테이트 층에서 0.362g, 부탄올 층에서 1.115g, 물 현탁액에서 부탄올 층 분획 후 남은 잔여 층을 말려 물 층에서 7,5g를 획득하였고, 이하 실험에서 Hex 분획, CH 분획, EA 분획, Bu 분획 및 물 분획이라 한다.
실험예
세포독성 시험
세포독성시험은 MTS assay로 시행되었으며, RAW264.7 세포 (1×104cells/well)를 하룻밤 배양하여 시료를 농도별로 24시간 처리하였다. 배양액에 MTS시약을 20uL 첨가하여 1시간 후에, microplate spectrophotometer (BioTek Instruments, Inc., VT, USA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이는 도 11과 같다. Hex 분획은 1mg/mL 농도에서 약 20% 정도의 세포 생육을 저해하였으며, CH 분획은 모든 농도에서 세포생육을 저해하여 독성을 나타내는 것으로 나타났다.
NO 생성량 측정
NO 생성량 측정은 세포 배양액 내의 nitrite 농도를 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하였다. RAW264.7 세포를 48-well plate에 세포수가 1×105cells/well이 되게 분주하고 24시간 배양하였다. 그 후 완숙 작두콩 추출물 각각 분획 및 RSBE를 1시간 전 처리하고, LPS (1ug/mL)로 24시간 동안 NO 생성을 유도한 뒤 배양 상등액과 Griess reagent를 1:1로 혼합하여 microplate spectrophotometer 를 사용하여 570 nm에서 NO 생성량을 측정하였다. Sodium Nitrite (NaNO2)를 사용하여 standard curve를 작성한 후 NO측정에 사용하였다. 결과는 도 12와 같다.
항염증 효과를 NO 생성 억제능으로 확인한 결과, LPS를 처리한 세포의 NO 생성량은 LPS를 처리하지 않은 대조구와 비교했을 때 증가하였다. RSBE 시료는 LPS에 의한 NO 생성을 크게 억제하였다. Hex 분획은 세포독성을 갖는 1mg/mL 농도에서는 NO 생성을 증가시켰으나, 0.3mg/mL 농도 이하로는 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하였다. CH 분획 또한 세포독성을 갖는 1, 0.3mg/mL 농도에서는 NO 생성을 억제하지 못하였으나 0.1mg/mL 농도에서 NO 생성을 억제하였다. EA 분획은 농도 의존적으로 NO 생성을 크게 억제하였으며, Bu 분획은 1, 0.3mg/mL 농도에서만 NO 생성 억제를 나타냈다. 데이터에서는 보여주지 않았으나 물 분획은 높은 1mg/mL의 농도에서 NO 억제를 보였으나, 아주 미미한 수준의 억제를 나타냈다.
염증성 사이토카인 분비량 측정
염증성 사이토카인 분비 억제 효능을 알아보기 위하여, RAW264.7 세포(1×105cells/well)는 48-well plate에 24시간 동안 배양하였다. 세포에 농도별로 시료를 1시간 전처리 후, 1?g/mL의 LPS를 처리하여 24시간 재 배양하였다. 배양액 내의 IL-6 (Biolegend, CA, USA) 및 TNF-α (BD Bioscience, MN, USA) cytokine의 분비량을 ELISA kit를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 실험하였으며, microplate spectrophotometer를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, LPS를 처리한 세포의 사이토카인 생성량은 LPS를 처리하지 않은 대조구와 비교했을 때 증가하였다 (도 13). CH 분획은 0.1mg/mL 농도에서 사이토카인 생성을 억제하였으며, EA 분획은 농도 의존적으로 사이토카인 생성량을 크게 억제하였다. Bu 분획은 1mg/mL 농도에서 사이토카인을 억제하였다.
Claims (15)
- 작두콩 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 작두콩 및 콩깍지 추출물인 의약 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 콩깍지 추출물인 의약 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 작두콩은 완숙 작두콩인 의약 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 물 및 프레타놀 A의 혼합 용매 추출물인 의약 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 혼합 용매는 물 및 프레타놀 A를 1:9 내지 3:7의 부피비로 포함하는 의약 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 에틸아세테이트 분획물인 의약 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환인 의약 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 염증성 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인 의약 조성물.
- 작두콩 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 청구항 10에 있어서, 상기 작두콩은 완숙 작두콩인 건강기능식품.
- 청구항 10에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 물 및 프레타놀 A의 혼합 용매 추출물인 건강기능식품.
- 청구항 10에 있어서, 상기 작두콩 추출물은 에틸아세테이트 분획물인 건강기능식품.
- 청구항 10에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환인 건강기능식품.
- 청구항 10에 있어서, 상기 염증성 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인 건강기능식품.
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