KR101331784B1 - 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 또는 고삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1 내지 8로 표시는 화합물, 또는 이들을 포함하는 고삼 추출물, 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물, 이를 포함하는 사료 첨가제, 사료용 조성물, 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 상기 조성물의 투여를 통한 면역증강 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물, 또는 이들을 포함하는 고삼 추출물, 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 인터페론 발현 유도용 조성물은 인터페론 발현 증가를 통해 예방 또는 치료될 수 있는 질환을 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다.

Description

화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 또는 고삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물{Composition for immune enhancement comprising compound in chemical formular one through eight or extract from Sophora flavescens}

본 발명은 화학식 1 내지 8로 표시는 화합물, 또는 이들을 포함하는 고삼 추출물, 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물, 이를 포함하는 사료 첨가제, 사료용 조성물, 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물 및 상기 조성물의 투여를 통한 면역증강 방법에 관한 것이다.

인터페론은 바이러스에 감염된 세포에서 생산되는 사이토카인 중에 최초로 발견된 것으로, 가장 뛰어난 항바이러스성을 갖는 사이토카인으로 알려져 있다. 인터페론은 인플루엔자 바이러스에 감염된 닭의 배아세포에서 생산되어 인플루엔자 바이러스나 다른 바이러스에 대한 저항성을 유도하는 물질로서 발견되었지만, 그 후 이 물질을 다양한 질병 치료에 사용하려는 연구가 시도되어 왔고, 다양한 바이러스 질환, 만성 B형, C형 간염 (hepatitis B, C)이나 혈액암 (blood cancer), 다발성 경화증 (multiple sclerosis) 등에 인터페론이 이용될 수 있음이 보고되었다. 특히 면역 능력이 있는 환자에서 그 효과와 안정성이 입증되었다. 최근에는 HIV 환자에 대한 인터페론의 효능이 입증되고 있다. 즉, 이와 같은 인터페론의 발현 증가는 면역증강 효과를 나타낼 수 있다.

일반적으로 바이러스는 사람, 동물, 식물, 곰팡이 세균등 다양한 숙주를 매개로 감염되는 것으로 알려져 있다 (Patton JT, Caister Academic Press, 2008). 그 중에서 대표적인 dsRNA 바이러스인 로타바이러스는 Reoviridae에 속하는 바이러스로서 전 세계적으로 어린 동물(소, 돼지, 개 및 염소 등)과 영유아에서 심한 설사를 유발하는 가장 중요한 원인체 중 하나이다. 또한, 심한 설사 외에도 뇌염, 중이염, 괴사성 대장염, 간농양, 장중첩 등의 질병을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (Ester, M. K. Fields Virology, 2001, 1747-1785).

이러한 바이러스 질병을 치료할 목적으로, 바이러스의 상피세포로의 흡착 저해, 세포로의 침입저해, 유전자의 전사 및 복제 저해, 단백질의 합성 저해, 세포로부터의 방출 억제 등과 같이 바이러스를 직접 표적으로 하는 방법들이 고려되었다. 현재까지 로타바이러스의 감염을 억제하기 위해 많은 백신들이 개발되고 있으며, 특히 사람을 대상으로 한 사람과 동물의 로타바이러스를 재조합하여 만든 동물-사람 재조합 바이러스 백신을 생산하여 판매하고 있다. 대표적인 것은 소의 로타바이러스주인 WC3를 바탕으로 인간 로타바이러스주 혈청형의 특이성을 가진 VP4에 해당하는 유전자를 끼워 넣은 백신으로서, 로타텍 (RotaTeq, Merk 사)의 경우에는 2006년 미국의 FDA 승인을 거쳐 판매하고 있다. 하지만 이러한 재조합 바이러스 백신은 장중첩 (Intrussusception)과 같은 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 이것으로는 다양한 로타바이러스 혈청형에 대한 예방을 할 수 없다는 큰 단점을 안고 있다. 이러한 백신의 단점을 극복하기 위해 로타바이러스를 억제할 수 있는 천연소재들에 관한 연구가 이루어지고 있다. 대표적으로 Takahashi 등은 스테비아의 열수추출물이 항로타바이러스 효과가 있음을 보고한 바 있다 (Takahashi, K et al., Antiviral Res. 2001, 49, 15-24). 그러나 이러한 천연소재나 백신 등을 이용한 바이러스를 직접 표적으로 하는 방법은 항바이러스제에 대한 내성과 함께 신속한 바이러스 변이가 일어난다는 문제가 있다. 따라서 이를 보완하기 위해 최근 많은 연구진들에 의해 바이러스 자체를 박멸하기보다는 감염에 의해 유도되는 숙주의 과잉 염증반응을 억제하는 방법을 병행함으로서 바이러스 감염에 의한 치명적인 염증 질환을 차단하고자 하는 연구가 진행되고 있다 (Geiler J. et al, Biochemical Pharmacology, 2010, 413-420).

수년 전부터 항바이러스 제제 및 면역증강제를 개발하기 위한 일환으로서 인터페론을 대량 생산하기 위하여 유전공학적 방법이나 생물공학적인 방법의 연구가 이루어져 왔으며 최근에는 천연물이나 합성 화합물로부터 인터페론 활성을 유도하는 화합물을 탐색하기 위한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 그러나 인간에게 높은 인터페론 유도효과를 나타내는 화합물은 아직 보고되고 있지 않다 (Alcaro S et al., Bioorg Med Chem. 2005, 13(10), 3371-3378). 또한 3M Pharmaceuticals사에 의해 lmiquimod(1)이라는 강력한 인터페론 유도제가 개발되었으나 임상시험에서 여러 부작용이 나타남으로서 개발이 중단되었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 고삼(Sophora flavescens) 추출물, 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 플라보논(flavanone)계열의 화합물들이 세포독성이 나타나지 않는 농도에서 인터페론의 발현을 증가시키는 것을 확인하였고 이에 따른 로타바이러스 증식을 억제하는 활성이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타(Interferon-β) 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼(Sophora flavescens) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물들을 포함하는 사료 첨가제, 사료용 조성물, 약학적 조성물, 의약외품 조성물 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 포함하는 로타바이러스, 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 및 간염바이러스 B형 C형 을 포함하는 감염성 질환, 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염, 및 IgE 매개성(타입) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 병성, 포도막염, 및 결막염을 포함하는 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후근 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 및 거대세포 동맥염을 포함하는 혈관질환; 및 강직성 척추염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염, 골육종, 기저세포암, 경부이형성, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 병, 유방암, 흑색종, 유두종 바이러스, 바이러스성 간염, 음부포진, 대상포진, 포진성 각막염, 단순포진, 바이러스성 뇌염, 거대세포 폐렴, 바이러스성 코감기, 만성 C형 간염, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 저스트만-스트라우슬러-쉐인커병, 중증 급성 호흡기 증후군, 스트로크, 일시적 허혈성 발작 및 만성 전립선염 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제, 사료용 조성물, 의약외품 조성물, 식품 조성물 및 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 면역 증강이 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 저하 개체의 면역 증강 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 로타바이러스에 감염된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 로타바이러스 매개 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 (Interferon-β) 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼(Sophora flavescens) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물"은 본 기술분야의 당업자라면 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물이 포함되어 있는 것으로 당업계의 공지된 식물로부터 극성 또는 비극성 용매를 사용하여 분리 정제할 수 있다. 또는, 상업적으로 시판되는 화합물을 구입할 수도 있다. 이와 같은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물을 플라바논(flavanone) 계 화합물로 공통점을 갖고 있으며, 바람직하게는 고삼으로부터 추출할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 염"이라는 용어는 표적 동물(예컨대, 포유류)이 생리학적으로 수인 가능한 본 발명의 화합물의 모든 (예컨대, 산 또는 염기와 반응하여 얻은) 염을 의미한다. 본 발명 화합물의 염은 유기 또는 무기산 및 염기로부터 유도될 수 있다. 산의 예로서는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-황산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 그 자체로는 약학적으로 허용할 수 없지만 옥살산 등의 그 밖의 산 또한 본 발명의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 첨가염을 획득하기 위한 중간체로서 유용한 염의 제조시 사용될 수 있다. 염기의 예에는 알칼리 금속(예컨대, 나트륨) 수산화물, 알칼리 토금속(예컨대, 마그네슘) 수산화물, 및 암모니아를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 염의 예에는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파레이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 플루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살렌이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 언데카노에이트 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그 밖의 염의 예에는 Na+, NH₄+, 및 NW₄+ (여기서 W는 Cl-C4의 알킬기이다), 및 이와 유사한 적절한 양이온과 화합하는 본 발명 화합물의 음이온이 포함된다. 치료용으로 사용되기 위하여, 본 발명 화합물의 염은 약학적으로 허용가능하도록 고려되었다. 그러나 약학적으로 허용 불가능한 산 및 염기의 염도 예컨대, 약학적으로 허용가능한 화합물의 제조 또는 정제에 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 고삼 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 또는 부탄올로 추출한 것을 포함한다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.

본 발명에서 고삼 추출물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 고삼 분쇄물을 건조 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 5배에 달하는 부피의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C₁) 내지 4(C₄)의 저급 알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 약 12시간 내지 4일, 바람직하게는 3일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한다. 바람직하게는 냉침추출로 1회 내지 5회 연속 추출하여 감압여과하고, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 20 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 감압 농축하여 물, 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 고삼 조추출물을 수득할 수 있다.

본 발명에서, 고삼 추출물의 용매 분획물은 고삼 추출물을 물로 현탁한 후 n-헥산 또는 클로로포름과 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다. 본 발명에서, 구체적인 일 실시예로서 용매분획물로는 물 분획물 및 클로로포름 분획물이 제공된다.

본 발명에서 고삼 추출물의 분획물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 상기에서 얻은 고삼 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 헥산, 에틸아세테이트 또는 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 비극성 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis , 3rd Ed. p6-7, 1998). 구체적으로, 상기 고삼 조추출물을 물에 현탁한 후, 등량의 n-헥산 및 클로로포름을 용매를 이용하여 연속 추출로 고삼 각 용매 가용 추출물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 고삼 조추출물을 물에 현탁한 후, 동량의 n-헥산을 혼합한 후 분획하여 n-헥산 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 수가용성 분획물에 클로로포름을 가하여 클로로포름 가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.

이와 같은 고삼 추출물 또는 이의 분획물은 상기 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물 이외에 인터페론 베타 발현을 유도할 수 있는 당업계에 공지된 1이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 스테비아(Stevia rebaudiana) 추출물 또는 스테비오사이드(stevioside)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "스테비아(Stevia rebaudiana)"는 쌍떡잎식물로 초롱꽃목 국화과의 여러해살이 풀이다. 하천이나 습지대 주변에서 자라며, 뿌리는 원뿌리의 발달이 분명하지 않고 많은 곁뿌리와 막뿌리가 있다. 생육 휴기에는 굵은 뿌리가 발달해서 저장 기능이 생긴다. 뿌리 가까이 있는 숨은눈에서 새가지가 자라 해마다 새로운 줄기를 이룬다. 줄기는 곧게 서며 월동 중 줄기의 기능이 없어진다. 줄기 마디에 잎이 달리며 잎겨드랑이에서 가지가 돋는다. 잎은 마주나고 바소꼴이며 길이 4～10cm, 나비 약 2.5cm이다. 가는 톱니와 굴곡이 있고 잎맥은 3개이다. 잎자루는 없으며 포기 전체에 잔털이 난다. 꽃은 1송이에 5～6개의 관상화가 모여서 피며, 자가불화합성의 성질이 있다. 단일식물이므로 단일조건에서 꽃이 빨리 핀다. 종자는 결실률이 낮고 매우 작다. 종자 앞 끝에 부챗살 모양의 관모가 있다. 원산지는 남아메리카의 파라과이아르헨티나브라질 등의 국경 산간지대이며, 파라과이에서는 옛날부터 스테비아잎을 감미료로 이용해 왔는데, 최근 합성감미료인 사카린의 유해성이 문제가 되자, 다시 주목을 끌게 되었다. 잎에는 무게의 6～7% 정도 감미물질인 스테비오사이드(stevioside)가 들어 있는데, 그 함유율은 개체에 따라 차이가 크다. 감미성분은 설탕의 300배로서, 차를 만들어 마시거나 껌 대용으로 하며 청량음료의 감미료로 사용한다. 한국에는 1973년에 들여왔으며 작물시험장에서 설탕 대체용 개발을 위하여 시험재배를 실시하였고 농가에서 재배하기도 하였다. 한국에서 육성한 품종으로는 수원 2호(감미성분 12.2%)와 수원 11호(23%)가 있다. 번식은 종자나 꺾꽂이로 한다. 수확은 l년에 l～2회 할 수 있으며, 9월 상순과 중순이 적기이다.

본 발명에서 용어, "스테비오사이드(stevioside)"는 스테비아의 잎에 함유된 글리코시드로, 설탕의 약 300배에 달하는 단맛을 내는 천연감미료이다. 파라과이, 브라질, 일본 등 여러 나라에서 저칼로리 감미료로 쓰인다. 음료, 간장류, 주류, 과자류 등에 사용되어 왔으나 알코올과 화학반응하여 유독성 물질인 스테비올로 변화한다는 보고가 있어 선진국에서는 주류에 첨가하지 못하게 되어 있다. 한국에서도 소주 등에 감미료로 사용되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 스테비오사이드와 동시 투여시 로타바이러스 감염에 의한 돼지 설사 증상의 개선이 좀 더 호전되는 것을 확인하였으며 (도 6a), 로타바이러스 감염에 의한 소화기 병변의 치료가 좀 더 호전되는 것을 확인하였다 (도 6b 및 6c).

본 발명에 따른 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물은 IRF-3를 활성화시켜 인터페론을 생성하는 면역증강 작용에 의해 항바이러스 작용을 나타내는데, 본 발명자들은 고삼의 메탄올 추출물, 클로로포름 분획물 및 물 분획물이 IRF-3의 인산화를 유도하고(도 1a), 인터페론 발현양을 증가시킨다는 점을 확인하였다 (도 1b). 또한 본 발명의 화학식 1 내지 8의 화합물이 IRF-3의 인산화를 유도하고(도 2a 및 도 4b), 인터페론 발현양을 증가시킨다는 점도 확인하였다(도 2c 및 도 4c).

본 발명에서 용어, "인터페론 베타(Interferon-β, INF-β)"는 동물 체내에서 바이러스와 같은 병원체나 종양세포 등과 같은 이물질의 침입에 반응해 세포가 분비하는 단백질이다. 이 단백질은 바이러스의 증식을 저지하거나, 세포증식 억제, 면역계 및 염증의 조절 등을 하는 사이토카인의 일종이다. 인터페론은 바이러스의 감염과 dsRNA등에 의해 직접 유도된다고 알려져 있다. 인터페론 알파 및 베타는 T세포 및 B 세포와 같은 림프구, 마크로파지, 섬유아세포, 혈관내피세포, 골아세포 등 여러 타입의 세포에서 생산되며, 특히 항바이러스 반응에 있어 중요한 요소이기도 한다. 인터페론 알파 및 베타는 마크로파지와 NK(natural killer) 세포를 모두 자극해, 종양세포에 대해서도 직접적으로 증식 억제 작용을 보인다. 또한, 인터페론 베타는 C형 간염, 간경변 및 다발성 경화증의 억제와 재발방지에도 사용된다.

화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물에는 인터페론 베타의 발현을 유도하는 효과가 있으므로 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환들에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 "인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환"에는 예를 들어, 로타바이러스, 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 및 간염바이러스 B형 C형 을 포함하는 감염성 질환, 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염, 및 IgE 매개성(타입) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 병성, 포도막염, 및 결막염을 포함하는 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후근 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 및 거대세포 동맥염을 포함하는 혈관질환; 및 강직성 척추염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염, 골육종, 기저세포암, 경부이형성, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 병, 유방암, 흑색종, 유두종 바이러스, 바이러스성 간염, 음부포진, 대상포진, 포진성 각막염, 단순포진, 바이러스성 뇌염, 거대세포 폐렴, 바이러스성 코감기, 만성 C형 간염, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 저스트만-스트라우슬러-쉐인커병, 중증 급성 호흡기 증후군, 스트로크, 일시적 허혈성 발작 및 만성 전립선염 질환이 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 다발성 경화증은 뇌, 척수, 그리고 시신경을 포함하는 중추신경계에 발생하는 만성신경면역계질환 (chronic neuroimmunologic disorder)이다. 이 질환의 발병 기전은 아직 정확하게 밝혀지지는 않았지만, 대부분의 연구에 의하면 자가 면역체계 이상 반응에 의한 시경수초의 파괴가 주원인으로 알려져 있다. 이 다발성 경화증을 완치시켜주는 약물은 없지만, 질병의 과정을 변화시켜줄 수 있는 치료제는 나와 있는데, 그 대표적인 치료제가 베타 인터페론이다. 1993년 최초로 인터페론-베타 1b (Beta-Interferon 1b)가 다발성경화증 치료제로 미국 FDA 인증을 받은 이후, 두 가지 다른 인터페론-베타 1a가 연이어 개발되어 치료에 이용되기 시작했다. 이들 베타 인터페론 제제는 위에 언급한 치료 효과와 더불어 좋은 관용성(tolerability)과 장기적인 안정성을 보여 다발성경화증의 주요 치료제로 사용되고 있다. 최근에는 환자에게 최대한의 치료 효과를 얻기 위해 조기 진단 및 조기 치료가 강조되면서, 다발성경화증으로 진행가능성이 높은 임상적 독립증후군(Clinically isolated syndrome) 환자를 대상으로 한 조기 베타 인터페론 치료에 대한 건강보험적용이 금년부터 시행되기 시작했다.

상기 만성 B형 간염은 세계인구의 약 5%, 우리나라의 경우 약 8-12%에서 감염되어 있으며, 바이러스의 지속적인 증식에 의해 간경변과 원발성 간암을 유발시켜 세계적으로 9번째로 높은 사망원인이 된다. 따라서 만성 바이러스성 간염을 치료할 목적으로 Adenine arabinoside, Acyclovir 등의 항바이러스 제재와 Azathioprine 및 부신피질 호르몬 등의 면역억제제를 단독 혹은 복합하여 사용하고 있으나 항바이러스 작용이 약하고, 장기 투여시의 부작용으로 아직 임상적인 이용에 논란이 많다. 그에 비해 인터페론은 1975년 처음 B형 간염의 치료에 사용되면서 인터페론의 항바이러스 효과와 항증식 효과 및 면역조절 효과가 있는 것으로 밝혀지게 되었으며, 1992년 인터페론 a_2b가 FDA의 공인을 받으면서 인터페론은 만성 바이러스성 간염에 널리 사용되고 있다.

다른 양태로, 본 발명에 따른 상기 면역 증강용 조성물은 사료 첨가제로 사용될 수 있는바, 본 발명은 상기 면역 증강용 조성물을 포함하는 사료 첨가제 또는 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "사료첨가제"란 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 말한다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨(중조), 벤토나이트 (bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 면역 증강용 조성물을 포함하는 사료용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 사료제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물을 첨가하여 제조 가능하다.

본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 상기 면역 증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 바람직하게는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.

농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물(液狀物)을 농축시킨 것인 피시솔루블(fish soluble), 육분(肉粉), 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.

조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實) 등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎 등이 있다. 특수사료에는 굴껍테기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물, 식이보조제 등이 있다.

상기 "식이 보조제"는 예를 들어 치료제 또는 소화제를 동물에 제공하는 제제 함유 조성물로, 통상 생체의 열량 섭취 공급원, 즉 에너지 공급원은 아니지만, 통상의 동물 사료에 추가하여 섭취되는 조성물을 의미한다.

또한, 상기, "식품첨가물"은 외관, 향미, 조직 또는 저장성을 향상시키기 위한 목적으로 보통 적은 양이 식품에 의도적으로 첨가되는 것을 가리키며, 식품의 품질을 개량하여, 보존성 또는 기호성을 향상시킬 뿐 아니라 영양가 및 식품의 실질적인 가치를 증진시킬 목적으로 사용하는 것을 의미한다. 이는, 식품위생법 제2조 제2호에서 정의하고 있는 바와 같이, 식품을 제조가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가, 혼합, 침윤, 기타의 방법으로 사용되는 물질일 수 있다.

본 발명에 따른 사료용 조성물은 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물 조류 및 어류 등 어느 개체에도 적용이 가능하다.

본 발명자들은 본 발명의 고삼 추출물이 로타바이러스 감염에 따른 돼지 설사, 소화기 병변의 치료 효과를 확인함으로 인하여(도 5 내지 6), 본 발명의 화합물 또는 고삼 추출물, 이의 분획물이 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강을 시킬 수 있음을 확인하였다.

또 다른 하나의 양태로, 본 발명은 면역 증강용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린 산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기에서 설명한 바와 같이 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있으며, 개체의 투여량, 유효한 투여농도, 및 투여방법은 상기에서 설명한 바와 같이 당업계에 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서의 용어 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 가려움증을 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 인터페론 베타 발현의 유도를 통한 면역증강을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 면역 증강용 조성물을 포함하는 의약외품 조성물에 관한 것이다.

그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들어, 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크-업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔 또는 세정 겔로 사용할 수 있다. 등으로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물 외에 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 의약외품 조성물은 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역증강을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등 어느 것이나 적용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로, 본 발명은 상기 면역 증강용 조성물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 추출물을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 인터페론 발현의 유도를 통한 면역 증강을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소, 인간 등과 같은 포유동물이 있다.

본 발명에 따른 면역 증강용 조성물은 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환들을 대상으로 유용하게 사용될 수 있다.

인터페론 베타는 항바이러스 활성이 있으므로 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환에는 바이러스 질환이 포함되고, 특히 본 발명자들은 화학식 1의 화합물 내지 8의 로타바이러스 증식 억제 효과를 시험한 결과, 그 효과가 우수함을 알 수 있었다(도 3 및 도 4a).

따라서, 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물은 바이러스 질환을 포함하는 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제, 및 이를 포함하는 사료용 조성물, 식품 조성물, 및 의약외품 조성물로 사용될 수 있고, 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역 증강용 조성물을 상기 질환이 의심되거나 상기 질환에 감염된 개체에게 투여하여 상기 질환을 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다.

독성이 없으면서 바이러스의 증식을 억제하는 물질과 함께 인터페론 베타의 발현을 유도하는 활성을 가진 물질을 적절하게 조합한다면, 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있고, 예를 들어 바이러스 증식을 억제시킴과 동시에 바이러스 감염에 의해 진행되는 과도한 염증반응을 억제함으로서 바이러스 감염성 질환의 진행을 차단하는 시너지 효과를 낼 수 있다. 예를 들어, 스테비아(Stevia rebaudiana) 추출물 또는 스테비오사이드(stevioside)를 첨가하는 경우, 항바이러스 활성이 더욱 증강되는 효과가 있어, 상기 감염성 바이러스 질환의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 다른 하나의 양태로, 본 발명은 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스, 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 및 간염바이러스 B형 C형 을 포함하는 감염성 질환, 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염, 및 IgE 매개성(타입) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 병성, 포도막염, 및 결막염을 포함하는 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후근 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 및 거대세포 동맥염을 포함하는 혈관질환; 및 강직성 척추염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염, 골육종, 기저세포암, 경부이형성, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 병, 유방암, 흑색종, 유두종 바이러스, 바이러스성 간염, 음부포진, 대상포진, 포진성 각막염, 단순포진, 바이러스성 뇌염, 거대세포 폐렴, 바이러스성 코감기, 만성 C형 간염, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 저스트만-스트라우슬러-쉐인커병, 중증 급성 호흡기 증후군, 스트로크, 일시적 허혈성 발작 및 만성 전립선염 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제, 및 이를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.

또한, 다른 하나의 양태로, 본 발명은 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스, 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 및 간염바이러스 B형 C형 을 포함하는 감염성 질환, 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염, 및 IgE 매개성(타입) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 병성, 포도막염, 및 결막염을 포함하는 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후근 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 및 거대세포 동맥염을 포함하는 혈관질환; 및 강직성 척추염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염, 골육종, 기저세포암, 경부이형성, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 병, 유방암, 흑색종, 유두종 바이러스, 바이러스성 간염, 음부포진, 대상포진, 포진성 각막염, 단순포진, 바이러스성 뇌염, 거대세포 폐렴, 바이러스성 코감기, 만성 C형 간염, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 저스트만-스트라우슬러-쉐인커병, 중증 급성 호흡기 증후군, 스트로크, 일시적 허혈성 발작 및 만성 전립선염 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제, 및 이를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

다른 하나의 양태로, 본 발명은 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스, 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 및 간염바이러스 B형 C형 을 포함하는 감염성 질환, 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염, 및 IgE 매개성(타입) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 병성, 포도막염, 및 결막염을 포함하는 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후근 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 및 거대세포 동맥염을 포함하는 혈관질환; 및 강직성 척추염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염, 골육종, 기저세포암, 경부이형성, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 병, 유방암, 흑색종, 유두종 바이러스, 바이러스성 간염, 음부포진, 대상포진, 포진성 각막염, 단순포진, 바이러스성 뇌염, 거대세포 폐렴, 바이러스성 코감기, 만성 C형 간염, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 저스트만-스트라우슬러-쉐인커병, 중증 급성 호흡기 증후군, 스트로크, 일시적 허혈성 발작 및 만성 전립선염 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제, 및 이를 포함하는 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "예방"은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 인터페론 베타의 발현을 유도하여 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "개선"은 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제, 사료용 조성물, 식품 조성물, 또는 의약외품 조성물을 이용하여 인터페론 베타의 발현을 유도하여 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

다른 하나의 양태로, 본 발명은 인터페론 베타 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물을 유효성분으로 포함하는 로타바이러스, 콜로라도참진드기열바이러스, 레오바이러스, 인간면역 결핍 바이러스, 및 간염바이러스 B형 C형 을 포함하는 감염성 질환, 아토피성 피부염, 건선, 아나필랙시스 및 피부염, 및 IgE 매개성(타입) 과민증을 포함하는 염증; 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 병성, 포도막염, 및 결막염을 포함하는 안 질환; 뇌졸증, 관상동맥질환, 심근경색, 불안정 협심증, 맥관염, 동맥경화증, 혈관협착, 베그너스(Wegener's) 육아종증, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후근 맥관염, 헤노크-숀레인(Henoch-Schonlein) 자반병, 가와사키병, 및 거대세포 동맥염을 포함하는 혈관질환; 및 강직성 척추염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 급성 소아당뇨병, 애디슨씨병, 굿파스튜어 증후군, IgA 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 만성폐쇄성 폐질환, 급성 백혈병 매개 폐손상, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 종양전이, 이식 거부, 중풍, 뇌염, 수막염, 에이즈 치매, 섬유증, 유착형성, 만성 간염, 골육종, 기저세포암, 경부이형성, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 병, 유방암, 흑색종, 유두종 바이러스, 바이러스성 간염, 음부포진, 대상포진, 포진성 각막염, 단순포진, 바이러스성 뇌염, 거대세포 폐렴, 바이러스성 코감기, 만성 C형 간염, 알츠하이머병, 크로이츠펠트-야콥병, 저스트만-스트라우슬러-쉐인커병, 중증 급성 호흡기 증후군, 스트로크, 일시적 허혈성 발작 및 만성 전립선염 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 상기 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼 추출물, 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이용하여 인터페론 베타의 발현을 유도하여 인터페론 베타의 발현 증가에 의해 예방 또는 치료되는 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 면역 증강용 조성물을 면역 증강이 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 저하 개체의 면역 증강 방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 면역 증강용 조성물을 로타바이러스에 감염된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 로타바이러스 매개 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 로타바이러스 매개 질환은 어린 동물(소, 돼지, 개 및 염소 등)과 영유아에서 일어나는 설사 등을 포함한다.

본 발명에 따른 플라보논계 화합물, 이를 포함하는 고삼 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 인터페론 발현 유도를 통한 면역 증강용 조성물은 사료첨가제, 사료용 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 및 약학적 조성물 형태로 다양하게 사용될 수 있으며 인터페론 발현 증가를 통해 예방 또는 치료될 질환을 예방, 개선, 또는 치료할 수 있다.

도 1a는 고삼 추출물 및 분획물들의 THP-1세포에서 IRF3 인산화 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 1b는 고삼 추출물 및 분획물들의 THP-1세포에서 인터페론-β (IFN-β) mRNA 발현 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 2a는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 활성화되어 인산화되는 IRF3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2b는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 IRF3 인산화 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 2c는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 IFN-β mRNA 발현 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 화학식 1의 화합물의 bovine 로타바이러스 KJ56-1 또는 porcine 로타바이러스 205-1에 의해 감염된 TF-104 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4a는 화학식 2 내지 8의 화합물들의 TF-104 세포에 감염된 로타바이러스 KJ56-1 증식 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 4b는 화학식 2 내지 8의 화합물들의 THP-1세포에서 IRF3 인산화 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 4c는 화학식 2 내지 8의 화합물들의 THP-1세포에서 IFN-β mRNA 발현 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 5a는 고삼 추출물의 로타바이러스에 의한 돼지설사 증상개선 효과에 대한 평가표를 나타낸 도이다.
도 5b는 고삼 추출물의 로타바이러스 감염에 의한 소화기 병변의 치료효과에 대한 조직학적 변화에 대한 비교를 나타낸 도이다.
도 5c는 고삼 추출물의 로타바이러스 감염에 의한 소화기 병변의 치료효과에 대한 조직학적 변화의 융모/융와의 비율과 상피세포탈락의 정도에 대한 평균 지수를 비교하여 나타낸 도이다.
도 6a는 고삼 추출물과 스테비오사이드의 동시 투여를 통한 로타바이러스 감염에 대한 돼지설사 증상개선 효과에 대한 평가표를 나타낸 도이다.
도 6b는 고삼 추출물과 스테비오사이드의 동시 투여를 통한 로타바이러스 감염에 의한 소화기 병변의 치료효과에 대한 조직학적 변화에 대한 비교를 나타낸 도이다.
도 6c는 고삼 추출물과 스테비오사이드의 로타바이러스 감염에 의한 소화기 병변의 치료효과에 대한 조직학적 변화의 융모/융와의 비율과 상피세포탈락의 정도에 대한 평균 지수를 비교하여 나타낸 도이다.
도 7a와 도 7b는 화학식 1의 화합물의 TF-104 세포에서 로타바이러스 감염에 의해 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 화학식 1의 화합물의 TRIF-CFP DNA를 transient하게 형질 감염시킨 THP-1 세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 유도된 TRIF-CFP의 사이토졸(cytosol) 내에서의 recruit를 억제하는 효과를 형광현미경으로 나타낸 도이다.
도 9a는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 활성화되어 핵으로 이동하는 NFκB P65의 활성을 억제하는 효과를 나타낸 도이다.
도 9b는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 활성화 되어 핵으로 이동하는 AP-1의 C-fos 활성을 억제하는 효과를 나타낸 도이다.
도 9c는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 인산화되는 IKK α/β 및 IKKγ의 인산화 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 9d는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 인산화되는 IκB의 인산화 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 9e는 화학식 1의 화합물의 THP-1세포에서 poly(I:C) 처리에 의해 인산화되는 p38, JNK 및 ERK1/2의 인산화 억제 효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 고삼으로부터 화학식 1 부터 8로 표시되는 플라바논(flavanone)계 화합물들의 추출, 분리 및 정제

<1-1> 고삼 추출물 제조

고삼은 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조한 후, 와링 브랜드로 분말화시켰다. 분말화된 고삼 5.5 ㎏을 에탄올 20 ℓ에 넣고 실온에서 3일간 냉침 추출한 후, 여지(와트만사, 미국)로 감압 여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 실온에서 에탄올 용매를 제거한 후 추출된 잔사로서 고삼 조추출물 450g을 수득하였다.

상기 조추출물에서 활성물질을 분리, 정제하기 위하여, 고삼 조추출물은 물 1 ℓ에 현탁시킨 후, 동량의 클로로포름을 가하여 혼합하여 분획하고, 이 과정을 4회 반복하여 수가용성 분획물 1 ℓ 및 클로로포름 가용성 분획물 4 ℓ를 얻은 후, 이 클로로포름 가용성 분획물을 감압 농축하여 클로로포름 가용 추출물 50 g 을 수득하였다.

<1-2> 클로로포름 층의 분리 및 정제

상기 <1-1>에서 얻은 클로로포름 가용 추출물 50 g 을 헥산:에틸아세테이트 = (100/0 ~ 0/100, v/v)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔의 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 활성분획을 분리하였다.

상기 활성분획 중 저해활성이 가장 높은 8번 분획 (1.6 g)을 헥산:아세톤 혼합용매에서 아세톤의 비율을 순차적으로 높여가면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 분획 중 저해활성이 가장 높은 분획을 모아서 헥산:아세톤 혼합용매를 이용하여 반복적인 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 노란색의 분말물질인 화합물 1 (100 mg)을 얻었다. 3번 분획 (3 g)은 헥산:에틸아세테이트 및 헥산:아세톤 혼합용매에서 에틸아세테이트 및 아세톤의 비율을 순차적으로 높여가면서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 노란색의 분말물질인 화합물 2 (500 mg) 와 6 (250 mg)을 각각 얻었다. 4번 분획 (1.4 g)은 헥산:아세톤 혼합용매에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 흰색의 분말물질인 화합물 5 (570 mg)을 얻었다. 5번 분획 (5 g)은 헥산:에틸아세테이트 및 헥산:아세톤 혼합용매에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 노란색 분말의 화합물 3 (530 mg) 와 흰색 분말의 화합물 7 (100 mg)을 얻었다. 6번 분획 (2.3 g)은 헥산:아세톤 혼합용매에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 반복적으로 수행하여 흰색 분말의 화합물 4 (40 mg) 와 노란색 분말의 화합물 8 (200 mg)을 얻었다.

실시예 2 : 화학식 1-8 화합물의 이화학적 특성 분석

화학식 1의 화합물은 노란색 분말상의 물질로, ¹³C-NMR의 DEPT 스펙트럼에서 1개의 sp²메틸렌 4개의 sp³메틸렌, 3개의 메틸, 6개의 메틴 및 10개의 4차 탄소가 관찰되었으며, ¹H-NMR에서 25개의 양성자가 관찰되었다. 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 442로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화학식 1의 화합물의 분자식이 C₂₅H₃₀O₇으로 추론할 수 있다. 분자식으로부터 이 화합물의 불포화도는 11임을 알 수 있었다. 또한 이 화합물은 5개의 수산기를 가짐을 알 수 있었다. ¹H-NMR data를 통해 화합물 1은 H-3a (δ_H 3.08 ppm), H-3b (δ_H 3.13 ppm), 그리고 H-2 (δ_H 5.68 ppm)의 ABX system의 3개의 이중 피이크의 존재로 전형적인 플라바논의 골격을 가짐을 확인하였다. ¹H-¹H COSY스펙트럼에서 H-1" (δ_H 2.77 ppm)에서 H-10" (δ_H 4.61 ppm)까지의 상관 피이크와 H-4"에서 H-7"/H-6"의 상관 피이크가 관찰되었다. 또한 ¹H-NMR에서 allylic coupling (H-2"→H-10")이 관찰되었다. 위의 결과로 lavandulyl기의 존재를 확인할 수 있었다. HMBC 스펙트럼에서 나타난 C-8 (δ_c 108.3 ppm)과 H-1" (δ_H 2.77 ppm)의 상관 피이크는 lavandulyl기가 C-8에 위치함을 알 수 있었다. 따라서 이상의 결과를 종합해 볼 때 화학식 1의 화합물은 5,7,2',4'-trihydroxy-8-(5-hydroxy-2-isoprenyl-5-methyl-hexyl-)flavanone, 즉, norkurarinol로 구조 동정하였다.

화합물 2는 노란색 분말상의 물질로, ¹³C-NMR의 DEPT 스펙트럼에서 1개의 sp²메틸렌 3개의 sp³메틸렌, 3개의 메틸, 7개의 메틴 및 10개의 4차 탄소가 관찰되었으며, ¹H-NMR에서 25개의 양성자가 관찰되었다. 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 424로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화합물 2의 분자식이 C₂₅H₂₈O₆으로 추론할 수 있다. 또한 이 화합물은 4개의 수산기를 가짐을 알 수 있었다. ¹H-NMR data를 통해 화합물 2는 H-3a (δ_H 2.73 ppm), H-3b (δ_H 2.97 ppm) 그리고 H-2 (δ_H 5.56 ppm)의 ABX system의 3개의 이중 피이크의 존재로 전형적인 플라바논의 골격을 가짐을 확인하였다. ¹H-¹H COSY스펙트럼에서 H-1" (δ_H 2.85 ppm)에서 H-10" (δ_H 4.55 ppm)까지의 상관 피이크와 H-4"에서 H-7"/H-6"의 상관 피이크가 관찰되었다. 또한 ¹H-NMR에서 allylic coupling (H-4"→H-7") 및 (H-2"→H-10")이 관찰되었다. 위의 결과로 lavandulyl기의 존재를 확인할 수 있었다. HMBC 스펙트럼에서 나타난 C-8 (δ_c 109.1 ppm)과 H-1" (δ_H 2.85 ppm)의 상관 피이크는 lavandulyl기가 C-8에 위치함을 알 수 있었다. 따라서 이상의 결과를 종합해 볼 때 화합물 2는 5,7,2',4'-tetrahydroxy-8-lavandulylflavanone, 즉, sophoraflavanone G로 구조동정 하였다.

화합물 3은 노란색 분말상의 물질로, 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 438로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화합물 3의 분자식이 C₂₆H₃₀O₆으로 추론할 수 있으며, 화합물 2와 같이 lavandulyl기가 C-8에 위치하는 유사한 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 화합물 3은 C-5 위치에 수산기 대신에 메톡시기가 존재하는 화합물로 5-methoxy-7,2',4'-trihydroxy-8-lavandulylflavanone, 즉, kurarinone으로 구조동정 하였다.

화합물 4는 흰색 분말상의 물질로, 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 354로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화합물 4의 분자식이 C₂₁H₂₂O₅로 추론할 수 있으며, 화합물 3과 같이 C-5 위치에 수산기 대신에 메톡시기가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 화합물 4는 C-8 위치에 lavandulyl기 대신에 prenyl기가 존재하는 화합물로 5-methoxy-7,4'-dihydroxy-8-prenylflavanone, 즉, isoxanthohumol로 구조동정 하였다.

화합물 5는 노란색 분말상의 물질로, 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 438로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화합물 5의 분자식이 C₂₆H₃₀O₆으로 추론할 수 있으며, 화합물 2와 같이 lavandulyl기가 C-8에 위치하는 유사한 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 화합물 5는 C-2 위치에 수산기 대신에 메톡시기가 존재하는 화합물로 2'-methoxy-5,7,4'-trihydroxy-8-lavandulylflavanone, 즉, leachianone A로 구조동정 하였다.

화합물 6은 노란색 분말상의 물질로, 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 438로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화합물 3의 분자식이 C₂₅H₂₈O₅으로 추론할 수 있으며, 화합물 2와 같이 lavandulyl기가 C-8에 위치하는 유사한 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 화합물 6은 화합물 2와는 다르게 C-4' 위치에 수산기가 존재하지않는 화합물로 5,7,2'-trihydroxy-8-lavandulylflavanone, 즉, kushenol A로 구조동정 하였다.

화합물 7은 노란색 분말상의 물질로, 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 426로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화합물 7의 분자식이 C₂₅H₃₀O₆으로 추론할 수 있으며, 화합물 6과 유사한 구조의 화합물임을 알 수 있었다. 그러나, C-4" 과 C-5" 사이에 이중결합이 존재하지 않으며, C-5" 위치에 수산기가 하나 더 존재하는 화합물로 5,7,2'-trihydroxy-8-(5-hydroxy-2-isoprenyl-5-methyl-hexyl)-flava-none, 즉, kushenol T로 구조동정 하였다.

화합물 8은 노란색 분말상의 물질로, 질량스펙트럼에서 분자이온 (M+)가 m/z = 452로 나타났다. ¹H-및 ¹³C-NMR 및 질량스펙트럼 자료를 이용하여 화합물 8의 분자식이 C₂₇H₃₂O₆으로 추론할 수 있으며, 화합물 2와 같이 lavandulyl기가 C-8에 위치하는 유사한 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 화합물 8은 C-5와 C-2 위치에 수산기 대신에 메톡시기가 존재하는 화합물로 5,2'-methoxy-7,4'-dihydroxy-8-lavandulylflavanone, 즉, 2'-methoxykurarinonedm로 구조동정 하였다.

화학식 1-8의 이화학적 특성은 다음과 같다.

[화학식 1]

(1) 물질의 성상: 노란색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₅H₃₀O₇, 442

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, acetone-d₆, d(ppm)]: 7.39 (1H, d, J = 8.31 Hz, H-6'), 6.49 (1H, m, H-3'), 6.46 (1H, m, H-5'), 6.02 (1H, s, H-6), 5.68 (1H, dd, J = 13.2, 2.8 Hz, H-2), 4.61 (2H, m, H-10"), 3.13 (1H, m, H-3a), 3.08 (1H, m, H-3b), 2.77 (2H, dd, J = 17.1, 2.9 Hz, H-1"), 2.46 (1H, m, H-2"), 1.66 (3H, s, H-9"), 1.39 (2H, m, H-3"), 1.26 (2H, m, H-4"), 1.11 (3H, s, H-6"), 1.10 (3H, s, H-7")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼[125 MHz, acetone-d₆, d(ppm)]: 198.6 (C-4), 165.8 (C-7), 163.4 (C-5), 162.5 (C-9), 159.8 (C-4'), 156.7 (C-2'), 149.6 (C-8"), 129.1 (C-6'), 118.3 (C-10), 111.8 (C-10"), 108.4 (C-1'), 108.3 (C-8), 104.0 (C-3'), 103.7 (C-5'), 96.7 (C-6), 75.8 (C-2), 70.9 (C-5"), 48.6 (C-2"), 43.0 (C-3), 43.0 (C-1"), 30.1 (C-6"), 29.9 (C-7"), 28.6 (C-3"), 28.1 (C-4"), 19.1 (C-9")

[화학식 2]

(1) 물질의 성상: 노란색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₅H₂₈O₆, 424

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 7.30 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'), 6.37 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-3'), 6.35(1H, m, H-5'), 5.92 (1H, s, H-6), 5.56 (1H, dd, J = 13.2, 2.7 Hz, H-2), 4.90 (1H, m, H-4"), 4.55 (2H, m, H-10"), 2.97 (1H, dd, J = 17.1, 13.2 Hz, H-3), 2.85 (2H, m, H-1"), 2.73 (1H, dd, J = 17.1, 2.8 Hz, H-3), 2.47 (1H, m, H-2"), 2.00 (2H, m, H-3"), 1.63 (3H, s, H-7"), 1.56 (3H, s, H-9"), 1.48 (3H, s, H-6")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼 [125 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 199.4 (C-4), 166.9 (C-7), 163.6 (C-5), 163.0 (C-9), 159.9 (C-4'), 157.1 (C-2'), 150.1 (C-8"), 132.5 (C-5"), 129.1 (C-6'), 125.2 (C-4"), 118.8 (C-1'), 111.6 (C-10"), 109.1 (C-8), 103.8 (C-5'), 96.7 (C-6), 76.2 (C-2), 48.7 (C-2"), 43.7 (C-3), 32.8 (C-3"), 28.4 (C-1"), 26.3 (C-7"), 19.6 (C-9"), 18.3 (C-6")

[화학식 3]

(1) 물질의 성상: 노란색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₆H₃₀O₆, 438

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 7.30 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'), 6.36 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-3'), 6.34 (1H, m, H-5'), 6.10 (1H, s, H-8), 5.54 (1H, dd, J = 13.2, 2.8 Hz, H-2), 4.96 (1H, m, H-4"), 4.57 (2H, m, H-10"), 3.80 (3H, s, H-11"), 2.87 (1H, dd, J = 16.7, 2.8 Hz, H-3), 2.70 (1H, dd, J = 16.7, 13.2 Hz, H-3), 2.62 (2H, m, H-1"), 2.49 (1H, m, H-2"), 2.00 (2H, m, H-3"), 1.63 (3H, s, H-9"), 1.56 (3H, s, H-7"), 1.45 (3H, s, H-6")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼 [125 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 194.3 (C-4), 165.3 (C-7), 165.1 (C-9), 162.3 (C-5), 159.9 (C-4'), 157.1 (C-2'), 150.2 (C-8"), 132.4 (C-5"), 128.9 (C-6'), 125.2 (C-4"), 118.9 (C-1'), 111.6 (C-10"), 110.0 (C-8), 108.1 (C-3'), 106.2 (C-10), 103.8 (C-5'), 93.7 (C-6), 75.9 (C-2), 56.3 (C-11"), 48.6 (C-2"), 46.0 (C-3), 32.8 (C-3"), 28.6 (C-1"), 26.3 (C-7"), 19.6 (C-9"), 18.2 (C-6")

[화학식 4]

(1) 물질의 성상: 흰색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₁H₂₂O₅, 354

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 7.30 (1H, dd, J = 6.7, 1.7 Hz, H-2', H-6'), 6.81 (1H, dd, J = 6.7, 2.0 Hz, H-3', H-5'), 6.11 (1H, s, H-6), 5.26 (1H, dd, J = 12.8, 3.1 Hz, H-2), 5.13 (1H, m, H-2"), 3.79 (3H, s, H-6"), 3.20 (2H, m, H-1"), 2.96 (1H, dd, J = 16.6, 12.8 Hz, H-3), 2.65 (1H, dd, J = 16.6, 3.1 Hz, H-3), 1.61 (3H, s, H-5"), 1.56 (3H, s, H-4")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼 [125 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 193.3 (C-4), 164.7 (C-7), 164.2 (C-9), 162.2 (C-5), 159.2 (C-4'), 132.1 (C-1'), 132.0 (C-3"), 129.3 (C-6'), 129.1 (C-2'), 124.3 (C-2"), 116.7 (C-3'), 116.5 (C-5'), 110.4 (C-8), 106.3 (C-10), 93.9 (C-6), 80.4 (C-2), 56.4 (C-6"), 46.6 (C-3), 26.4 (C-5"), 23.1 (C-1"), 18.3 (C-4")

[화학식 5]

(1) 물질의 성상: 노란색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₆H₃₀O₆, 438

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, acetone-d₆, d(ppm)]: 7.30 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6'), 6.42 (1H, d, J = 2.7 Hz, H-3'), 6.39 (1H, m, H-5'), 5.88 (1H, s, H-6), 5.51 (1H, dd, J = 13.3, 2.7 Hz, H-2), 4.85 (1H, m, H-4"), 4.45 (2H, m, H-10"), 3.69 (3H, s, H-11"), 2.93 (1H, dd, J = 13.3, 1.1 Hz, H-3), 2.90 (1H, dd, J = 13.3, 1.1 Hz, H-3), 2.58 (2H, m, H-1"), 2.49 (1H, m, H-2"), 1.90 (2H, m, H-3"), 1.43 (3H, s, H-9"), 1.42 (3H, s, H-7"), 1.35 (3H, s, H-6")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼 [125 MHz, acetone-d₆, d(ppm)]: 198.5 (C-4), 165.6 (C-7), 165.6 (C-9), 163.4 (C-5), 160.2 (C-4'), 159.0 (C-2'), 149.5 (C-8"), 132.0 (C-5"), 129.1 (C-6'), 124.8 (C-4"), 119.6 (C-1'), 111.5 (C-10"), 103.6 (C-8), 103.5 (C-5'), 100.2 (C-10), 96.9 (C-3'), 93.7 (C-6), 75.4 (C-2), 56.2 (C-11"), 48.1 (C-2"), 43.2 (C-3), 32.3 (C-3"), 28.1 (C-1") 23.7 (C-7"), 19.5 (C-9"), 18.2 (C-6")

[화학식 6]

(1) 물질의 성상: 흰색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₅H₂₈O₅, 408

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 7.54 (1H, dd, J = 7.6, 1.4 Hz, H-6'), 7.17 (1H, ddd, J = 15.0, 7.6, 0.9 Hz, H-4'), 6.90 (1H, ddd, J = 15.0, 7.6, 0.9 Hz, H-5'), 6.83 (1H, dd, J = 8.1, 0.9 Hz, H-3'), 5.93 (1H, s, H-6), 5.63 (1H, dd, J = 7.6, 1.4 Hz, H-2), 4.96 (1H, m, H-4"), 4.59 (2H, m, H-10"), 2.87 (2H, m, H-3), 2.61 (2H, m, H-1"), 2.48 (1H, m, H-2"), 2.00 (2H, m, H-3"), 1.64 (3H, s, H-9"), 1.55 (3H, s, H-7"), 1.46 (3H, s, H-6")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼[125 MHz, CD₃OD, d(ppm)]: 199.0 (C-4), 167.0 (C-7), 163.8 (C-9), 163.7 (C-5), 155.6 (C-2'), 150.1 (C-8"), 132.5 (C-5"), 130.6 (C-4'), 127.6 (C-1'), 127.6 (C-6'), 125.1 (C-4"), 121.0 (C-5'), 116.7 (C-3'), 111.6 (C-10"), 109.1 (C-8), 103.7 (C-10), 96.9 (C-6), 76.3 (C-2), 48.7 (C-2"), 43.6 (C-3), 32.7 (C-3"), 28.4 (C-1"), 26.2 (C-7"), 19.7 (C-9"), 18.2 (C-6")

[화학식 7]

(1) 물질의 성상: 노란색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₅H₃₀O₆, 426

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, CDCl₃, d(ppm)]: 7.36 (1H, dd, J = 7.6, 1.3 Hz, H-6'), 7.18 (1H, m, H-4'), 6.92 (1H, m, H-5'), 6.80 (1H, d, J = 8.01 Hz, H-3'), 5.94 (1H, s, H-6), 5.61 (1H, dd, J = 13.3, 2.7 Hz, H-2), 4.62 (2H, m, H-10"),2.97 (1H, dd, J = 17.2, 2.8 Hz, H-3), 2.83 (1H, dd, J = 17.2, 13.4 Hz, H-3), 2.53 (2H, m, H-1"), 2.15 (2H, m, H-2"), 1.55 (3H, s, H-9"), 1.30 (2H, m, H-4"), 1.27 (2H, m, H-3"), 1.09 (3H, s, H-7"), 1.03 (3H, s, H-6")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼[125 MHz, CDCl₃, d(ppm)]: 197.6 (C-4), 164.5 (C-9), 162.2 (C-7), 160.9 (C-5), 153.6 (C-2'), 148.8 (C-8"),130.1 (C-4'), 127.2 (C-6'), 125.6 (C-1'), 121.2 (C-5'), 117.1 (C-3'), 111.5 (C-10"), 108.2 (C-8), 103.3 (C-10), 96.9 (C-6), 76.1 (C-2), 72.8 (C-5"), 47.7 (C-2"), 42.1 (C-3), 41.2 (C-4"), 29.9 (C-7"), 28.8 (C-6"), 27.9 (C-1"), 19.5 (C-9")

[화학식 8]

(1) 물질의 성상: 노란색 분말상

(2) 물질의 분자식과 분자량: C₂₇H₃₂O₆, 452

(3) 수소 핵자기 공명스펙트럼 [500 MHz, acetone-d₆, d(ppm)]: 7.30 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6'), 6.49 (1H, m, H-3'), 6.36 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-3'), 6.34 (1H, m, H-5'), 6.10 (1H, s, H-6), 5.54 (1H, dd, J = 13.2, 2.7 Hz, H-2), 4.96 (1H, m, H-4"), 4.57 (2H, m, H-10"), 3.80 (3H, s, H-12"), 3.79 (3H, s, H-11"), 2.87 (1H, dd, J = 16.7, 3.2 Hz, H-3), 2.62 (2H, m, H-1"), 2.59 (1H, dd, J = 6.7, 2.9 Hz, H-3), 2.49 (1H, m, H-2"), 2.00 (2H, m, H-3"), 1.63 (3H, s, H-9"), 1.56 (3H, s, H-7"), 1.45 (3H, s, H-6")

(4) 탄소 핵자기 공명스펙트럼[125 MHz, acetone-d₆, d(ppm)]: 194.3 (C-4), 165.3 (C-7), 165.1 (C-9), 162.3 (C-5), 159.9 (C-4'), 157.1 (C-2'), 150.2 (C-8"), 132.4 (C-5"), 128.9 (C-6'), 125.2 (C-4''), 118.9 (C-1'), 111.6 (C-10"), 110.0 (C-8), 108.1 (C-3'), 106.2 (C-10), 103.8 (C-5'), 93.7 (C-6), 75.9 (C-2), 56.3 (C-11"), 56.2 (C-12"), 48.6 (C-2"), 46.0 (C-3), 32.8 (C-3"), 28.6 (C-1"), 26.3 (C-7"), 19.6 (C-9"), 18.2 (C-6")

실시예 3 : 고삼 추출물 및 그 분획물들에 의해 유도되는 IRF3 및 인터페론β ( IFN β) 발현 유도 효과

전사 인자인 IRF3(Interferon regulatory factor 3)가 인산화됨으로써 발현이 증가되는 IFNβ(Interferonβ)는 바이러스 복제를 억제함으로써 항바이러스 작용을 나타내며, 최근 면역치료(immunotherapy)제로서의 사용이 증가하고 있다. 따라서, 본 발명의 추출물이 IRF3와 IFNβ의 발현 유도에 미치는 영향을 다음과 같은 조건으로 측정하였다.

먼저, IRF3의 활성화에 미치는 영향을 측정하기 위해 THP-1 세포를 1.5×10⁶ cells/well로 분주하여, 고삼 추출물과 물 분획물을 30, 60 ㎍/㎖, 클로로포름 분획물을 30 ㎍/㎖ 의 농도로 2시간 처리하였다. 2시간 후, 세포를 튜브에 옮겨 원심분리를 통해 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 다음, 세포 용해 버퍼를 사용해 전체 단백질을 수득하여, 웨스턴 블롯을 수행하여, IRF3를 측정하였다.

그 결과, 대조군에 비해 고삼 추출물과 물 분획물을 처리한 군에서 IRF3의 활성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 클로로포름 분획물 30 ㎍/㎖의 농도에서 IRF3의 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1a).

IRF3의 활성화로 인해 나타나는 IFNβ의 발현 유도에 고삼 추출물 및 그 분획물이 미치는 영향을 측정하기 위해, 고삼 메탄올 추출물과 물 분획물은 60 ㎍/㎖의 농도로, 클로로포름 분획물은 30 ㎍/㎖의 농도로 6시간 동안 처리하였다. 6시간 후, 세포를 튜브에 모아 원심분리 하여 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 후, RNeasy Mini Elute Cleanup kit를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA의 농도와 순도는 2100 Bioanalyzer system (Agilent Technologies)로 측정하였고, Taqman reverse transcription reagents kit (Applied Biosystems)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. IFNβ의 발현 정도는 SYBR Green PCR master mix kit (Applied Biosystem)를 사용해 Real-time PCR을 통해 측정하였다.

그 결과, 대조군에 비해 고삼 메탄올 추출물과 클로로포름 및 물 분획물에서 IFNβ의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 1b).

이와 같은 결과는 본 발명의 고삼 추출물 및 이의 분획물이 인터페론 베타의 발현을 유도할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 4: 화학식 1 내지 8로 개시된 화합물들에 의해 유도되는 IRF3 및 IFN β발현 유도 효과

TLR-3에 의한 신호전달경로는 NFkB, AP-1뿐만 아니라, IRF3도 활성화시켜 IFNβ 생성함으로써 항바이러스 작용을 나타내는데, 본 발명의 화합물이 IRF3와 IFNβ 발현 유도에 미치는 영향을 다음과 같은 조건으로 측정하였다.

먼저, IRF3의 활성화에 미치는 영향을 측정하기 위해 THP-1 세포를 1.5X10⁶ cells/well로 분주하여, 화학식 1의 화합물을 30 μM, 60 μM의 농도로 1시간 전 처리 한 다음, poly (I:C) 50 ㎍/㎖을 3시간 처리하였다. 3시간 후, 세포를 튜브에 옮겨 원심분리를 통해 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 다음, NE-PER Nuclear extraction reagent(Thermo scientific)과 세포 용해 버퍼를 사용해 핵 추출과 전체 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯을 수행하였다.

그 결과, 대조군에 비해 poly (I:C)를 처리한 그룹에서 IRF3가 활성화되는 것을 확인할 수 있었는데, 흥미롭게도 화학식 1의 화합물을 전처리한 군에서는 IRF3의 활성화를 더욱 촉진시킴으로서 poly (I:C)만을 처리한 군보다 발현 정도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2a). 따라서, 화학식 1의 화합물만을 처리하였을 때도 IRF3의 활성이 증가하는지 동일한 실험 방법을 통해 확인해 본 결과, 농도 의존적으로 그 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2b). 또한 화합물 2-8을 10 μM 전처리한 군에서도 마찬가지로 IRF3의 인산화가 증가되는 것을 확인하였다 (도 4b).

IRF3의 활성화로 인해 증가되는 IFNβ 발현에 화학식 1 화합물이 미치는 영향을 측정하기 위해, 화학식 1의 화합물을 10 μM, 30 μM, 60 μM의 농도로 6시간 동안 처리하여 IFNβ 발현을 측정하였다.

그 결과, 화학식 1 화합물이 농도 의존적으로 IFNβ 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며(도 2c), 화학식 2-8 화합물을 10 μM 전 처리함으로써 IFNβ 발현이 증가 되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4c).

이와 같은 결과들은 본 발명의 고삼 추출물 및 분획물 뿐만 아니라, 이로부터 분리된 화학식 1 내지 8의 화합물 역시 인터페론 베타의 발현을 효과적으로 유도할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 5: 화학식 1의 화합물 내지 8의 로타바이러스 증식 억제 효과

상기에 개시된 화학식 1 내지 8의 화합물들의 로타바이러스에 대한 증식 억제 효과를 측정하기 위해, Fetal rhesus monkey kiney cell line 인 TF-104를 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 0.01 MOI (multiplicity of infection)의 로타바이러스 KJ56-1(bovine 로타바이러스, G8P[7])를 TF-104 세포(1X10⁵ cells/well)에 접종시켜 1시간 동안 반응시킨 후, 상층액은 제거하고 1 ㎍/㎖ 의 트립신과 화학식 1 내지 8의 화합물이 포함된 EMEM 배지를 넣어 37 ℃에서 3일 동안 배양하였다.

그 결과, 화학식 1의 화합물 30 μM 처리에 의해 로타바이러스 KJ56-1 및 로타바이러스 205-1의 증식이 유의적으로 저해됨을 확인하였다 (도 3). 뿐만 아니라 화학식 2부터 8의 화합물을 10 μM 전 처리함으로써 로타바이러스 KJ56-1의 증식이 유의적으로 저해됨을 확인하였다 (도 4a).

이와 같은 결과는 본 발명의 화합물이 로타바이러스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 6: 화학식 1의 화합물의 poly (I:C)와 로타바이러스 감염에 의해 유도되는 염증성 인자 발현 억제 효과

화학식 1의 화합물의 poly (I:C)와 로타바이러스 감염에 의해 유도되는 염증성 인자 발현 억제효과를 측정하기 위해, Human peripheral blood monocytic cell line인 THP-1과 TF-104를 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

화학식 1의 화합물의 로타바이러스 감염에 의한 염증성 인자 유도의 억제효과를 측정하기 위해 TF -104 세포를 12 well-plate에 5X10⁵ cells/well 로 분주하고, 화학식 1의 화합물의 최종농도를 10 μM이 되게 하여 1시간 전 처리하였다. 그 후, 0.01 MOI (multiplicity of infection)의 로타바이러스를 세포에 접종하고 1시간 동안 감염시켰다. 1시간 후, 상층액을 제거함으로써 감염되지 않은 로타바이러스는 제거하고, 1 ㎍/㎖의 트립신이 첨가된 EMEM 배지를 넣고 37 ℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 후 스크래퍼(scraper)로 긁어 튜브에 모아 RNeasy Mini Elute Cleanup kit를 사용하여 RNA를 추출하였다. 이후, 위와 동일한 방법으로 화학식 1의 화합물이 나타내는 염증성 인자유도 억제 효과를 측정하였다.

그 결과, 로타바이러스를 접종하지 않은 대조군에 비해 로타바이러스를 접종한 군에서 염증성 사이토카인인 TNF-a와 IL-6의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 화학식 1 화합물 (10 μM)을 전 처리한 군에서는 대조군과 유사한 경향을 보여, 로타바이러스 감염에 의해 유도되는 염증성 인자들의 발현을 유의적으로 억제시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 7).

실시예 7: 화학식 1의 화합물에 의한 세포내 TRIF - CFP 분포도 변화

화학식 1의 화합물에 의한 세포내 TRIF-CFP의 분포도 변화를 확인하기 위해, THP-1 세포(1X10⁶ cells/well)에 0.5 ㎍의 pcDNA3-TRIF-CFP plasmid를 Nucleofector kit V (Lonza, Switzerland)를 사용하여 형질감염시키고, 37 ℃에서 2일 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 Poly-L-Lysine이 코팅된 8 챔버 슬라이드에 옮겨 화학식 1 의 화합물을 30 μM로 처리하고, 50 ㎍/㎖의 Poly (I:C)를 1시간 동안 처리하였다. 상층액은 제거하고, PBS로 3회 세척한 뒤 200 ㎕의 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 처리하여 세포를 고정시키고, slowfade gold antifade reagent를 사용해 슬라이드에 고정하여 carl zeiss LSM 510 META confocal microscope를 통해 TRIF-CFP의 분포도 변화를 관찰하였다.

그 결과, Poly (I:C)를 처리하지 않은 대조군의 경우 TRIF-CFP가 세포질에 고루 분포되어 있는 반면 (도 8(a)), Poly (I:C)를 처리한 그룹에서는 TRIF-CFP의 집중적인 분포현상이 나타났으며 (도 8(b)), 화학식 1의 화합물을 전 처리한 그룹에서는 대조군과 유사하게 세포질에 고루 분포됨으로써 Poly (I:C)에 의해 나타나는 집중분포 현상을 억제시키는 것을 확인하였다 (도 8(c)).

실시예 8: 화학식 1의 화합물에 의해 조절되는 TLR -3 신호전달 경로

TLR-3(Toll-like receptor 3)에 dsRNA가 결합하면, TRIF가 TLR-3로 결합함으로써 신호전달이 개시되어, NFkB와 MAPK/AP-1, IRF-3 경로를 활성화시켜 염증성 사이토카인을 생성한다. 따라서, 본 발명의 화학식 1의 화합물이 TLR-3의 신호전달 경로에 미치는 영향을 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.

먼저, THP-1 세포를 1.5X10⁶ cells/well로 분주하여 FBS를 첨가하지 않은 RPMI 1640 배지에 12시간 배양하였다. 그 후, 화학식 1의 화합물을 30 μM, 60 μM, 100 μM의 농도로 1시간 전 처리 한 다음, 50 ㎍/㎖의 poly (I:C)를 3시간 처리하였다. 3시간 후, 세포를 튜브에 옮겨 원심분리를 통해 배지를 제거하고, PBS로 1회 세척한 다음, NE-PER Nuclear extraction reaents(Thermo scientific)과 세포 용해 버퍼를 사용해 핵추출과 전체 단백질을 뽑고 웨스턴 블롯을 수행하였다. 핵 추출은 NFkB와 c-Fos를 확인하였으며, 전체 단백질은 MAPKs, IKK isoforms, IRF3를 측정하였다. 그 결과, 화학식 1 화합물이 NFkB p65와 c-Fos의 핵내 이동을 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고(도 9a 및 9b), 또한 NFkB의 상위 단계인 IKK, IkB의 인산화도 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 9c 및 9d). 뿐만 아니라, AP-1 활성화의 상위 단계인 MAPKs, 즉 ERK, JNK, p-38의 인산화 또한, 화학식 1의 화합물에 의해서 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 9e).

실시예 9: 고삼 추출물의 로타바이러스에 의한 돼지설사 증상개선 효과

실험동물모델에 사용되는 무균 자돈의 경우 인증된 국내 농협중앙회 종돈 사업소 농장에서 임신 후기 모돈을 구입하여 생산하였으며 제왕절개 혹은 자궁 적출술을 통해 무균 자돈을 생산하였다.

사용된 바이러스는 국내 분리주인 G5P 돼지 혈청형 A 로타바이러스 K85-A strain을 사용하였다. 먼저 접종할 로타바이러스를 특정농도의 crystral trypsin과 1:9 (로타바이러스: crystal trypsin)로 섞은 후 37℃ incubator에 30분간 정치시킨 30분 후, crystral trypsin과 섞인 로타바이러스를 MA-104 세포에 접종한 후 다시 1시간 동안 37℃에서 배양한 후, crystral trypsin과 로타바이러스 혼합액을 제거하고 유지 배지로 교체하였다. 바이러스 증식에 의해 80% 이상의 세포가 세포변성효과 (Cytopathic effect)를 나타내면, 3번의 freezing-thawing을 한 후, 원심분리기를 이용하여 상층액만 수거하여 5x10⁵ FFU(fluorescence focus unit)/㎖의 농도로 접종실험에 사용하였다.

무균적으로 생산한 자돈을 크게 3개의 실험군으로 나누었다. 즉, 1) 바이러스 무접종 음성 대조군, 2) 바이러스 단독 접종 및 비투약 대조군, 3) 바이러스 접종 및 투약군으로 설정하였다.

활성평가용 시료인 고삼 메탄올 추출물은 각각의 농도별로 100% 에탄올을 이용하여 녹인 후 0.9% 생리식염수로 희석한 다음, 설사가 발생한 개체에 용량별로 경구로 투여하여 바이러스 무접종 음성대조군과 바이러스 단독접종 및 비투약 대조군에 있는 자돈과 비교하여 설사 증상의 발현을 조사하였다. 또한 고삼 메탄올 추출물과 스테비오사이드(steviocide)를 혼합한 후 용량별로 투여하여 바이러스 무접종 음성대조군과 바이러스 단독접종 및 비투약 대조군에 있는 자돈과 비교하여 설사 발현을 조사하였다.

그 결과, 바이러스 무접종 음성대조군에서는 설사를 포함하여 어떠한 임상증상도 관찰되지 않았지만, 바이러스 단독접종 및 비투약 대조군에서는 바이러스 접종 후 2일령부터 지속적으로 점액성 분변을 배설하는 심한 설사가 발생함을 확인하였다. 한편, 바이러스 접종 및 투약군은 고삼 추출물을 100 mg/㎖와 200 mg/㎖ 농도로 1 ㎖씩 하루 4회 투여한 결과 각각의 자돈군 모두에서 바이러스 단독접종 및 비투약 대조군에 비해 점액성에서 반죽형태의 분변으로 설사가 개선되는 효과를 확인할 수 있었다 (도 5a).

실시예 10: 고삼 추출물의 로타바이러스 감염에 의한 소화기 병변의 치료효과

상기 실시예 9의 바이러스 무접종 음성 대조군, 바이러스 단독 접종 및 비투약 대조군, 바이러스 접종 및 투약군의 자돈들을 부검하여 채취한 소장 조직을 파라핀 포매 후 절편을 제작하여, H&E 염색을 수행한 후, 광학현미경으로 소장 점막의 형태학적 변화를 비교 검사하였다.

그 결과, 로타바이러스를 접종하지 않은 무균 자돈에서 채취한 십이지장(도 5b-A), 공장(도 5b-B), 회장(도 5b-C)의 각부위를 조직학적으로 검사한 결과 어떠한 조직학적 변화도 관찰되지 않았다. 그리고 로타바이러스에 의해 설사가 발생한 바이러스 단독접종 및 비투약 대조군에서 채취한 소장 각 부위를 조직학적으로 검사한 결과 십이지장 (도 5b-D), 공장(도 5b-E), 회장(도 5b-F) 각 부위의 융모상피세포는 심하게 탈락되었고, 이로 인해 융모의 위축과 융합 그리고 음와의 심한 증식이 관찰됨을 확인하였다. 한편, 바이러스 접종 및 투약군은 고삼 추출물을 100 mg/㎖ 농도로 1 ㎖씩 하루 4회 투여하여 소장 각 부위를 조직학적으로 검사한 결과 십이지장 (도 5b-G), 공장(도 5b-H), 회장(도 5b-I) 각 부위는 융모 상피세포 탈락, 융모의 위축 및 융합, 음와의 증식은 바이러스 단독 접종한 자돈에 비해서 개선 효과를 확인할 수 있었다. 또한 바이러스 접종 및 투약군의 고삼 추출물을 200 mg/㎖ 농도로 1 ㎖씩 하루 4회 투여한 실험군의 소장 각 부위를 조직학적으로 검사한 결과 고삼 추출물을 100 mg/㎖ 농도로 1 ㎖ 씩 하루 4회 투여한 실험군과 유사하게 십이지장 (도 5b-J), 공장(도 5b-K), 회장(도 5b-L) 각 부위는 융모 상피세포 탈락, 융모의 위축 및 융합, 음와의 증식은 바이러스 단독 접종한 자돈에 비해서 개선 효과를 확인할 수 있었다. 그리고 각각의 실험군에 대한 소장의 변화를 융모/융와의 비율과 상피세포탈락의 정도에 대한 평균으로 지수를 표시하였다 (도 5c).

실시예 11: 고삼 추출물과 스테비오사이드의 동시 투여를 통한 로타바이러스 감염에 의한 돼지설사 증상개선 효과

상기 실시예 9와 동일하게 3개의 실험군으로 나누었다. 즉, 1) 바이러스 무접종 음성 대조군, 2) 바이러스 단독 접종 및 비투약 대조군, 3) 바이러스 접종 및 투약군으로 설정하였다.

본 실시예 11에서는 실시예 9와는 달리 고삼 메탄올 추출물 100 mg/㎖, 200 mg/㎖의 각각의 농도와 스테비오사이드 3 g/㎖ (1 ㎖의 0.9% 생리식염수에 3 g의 스테비오사이드를 녹였음)을 섞은 후 접종함으로써, 이 약물 합제의 효능을 검사하기 위해 실험을 수행하였다.

그 결과, 로타바이러스 접종 및 투약군에 합제된 항로타바이러스 후보 생물소재를 투여한 경우, 바이러스 단독 접종한 자돈에 비해 뚜렷한 설사 개선 효과를 확인할 수 있었다 (도 6a). 즉 100 mg/㎖ 고삼 추출물과 3 g/㎖ 스테비오사이드를 투여한 군에서는 투여 후 4-5일 이후부터 설사의 발생이 어느 정도 개선됨을 확인할 수 있었으며, 200 mg/㎖ 농도의 고삼 추출물에 대해서 3 g/㎖의 스테비오사이드를 투여한 군에서는 빠르게는 투여 후 1일 이후부터 설사의 발생이 개선됨을 확인할 수 있었다,

실시예 12: 고삼 추출물과 스테비오사이드의 동시 투여를 통한 로타바이러스 감염에 의한 소화기 병변의 치료효과

상기 실시예 11의 바이러스 무접종 음성 대조군, 바이러스 단독 접종 및 비투약 대조군, 바이러스 접종 및 투약군의 자돈들을 부검하여 채취한 소장 조직을 파라핀 포매 후 절편을 제작하여, H&E 염색을 수행한 후, 광학현미경으로 소장 점막의 형태학적 변화를 실시예 10과 동일한 방법으로 비교 검사하였다.

그 결과, 로타바이러스를 접종하지 않은 무균 자돈에서 채취한 십이지장(도 6b-A), 공장(도 6b-B), 회장(도 6b-C)의 각부위를 조직학적으로 검사한 결과 어떠한 조직학적 변화도 관찰되지 않았다. 그리고 로타바이러스에 의해 설사가 발생한 바이러스 단독접종 및 비투약 대조군에서 채취한 소장 각 부위를 조직학적으로 검사한 결과 십이지장 (도 6b-D), 공장(도 6b-E), 회장(도 6b-F) 각 부위의 융모상피세포는 심하게 탈락되었고, 이로 인해 융모의 위축과 융합 그리고 음와의 심한 증식이 관찰됨을 확인하였다. 한편, 바이러스 접종 및 투약군은 고삼 추출물 100 mg/㎖ 농도와 스테비오사이드 3 g/㎖씩 하루 4회 투여하여 소장 각 부위를 조직학적으로 검사한 결과 십이지장 (도 6b-G), 공장(도 6b-H), 회장(도 6b-I) 각 부위는 융모 상피세포 탈락, 융모의 위축 및 융합, 음와의 증식은 바이러스 단독 접종한 자돈에 비해서 개선 효과를 확인할 수 있었다. 또한 바이러스 접종 및 투약군의 고삼 추출물 200 mg/㎖ 농도와 스테비오사이드 3 g/㎖씩 하루 4회 투여한 실험군의 소장 각 부위를 조직학적으로 검사한 결과 십이지장 (도 6b-J), 공장(도 6b-K), 회장(도 6b-L) 각 부위는 융모 상피세포 탈락, 융모의 위축 및 융합, 음와의 증식은 바이러스 단독 접종한 자돈에 비해서 뚜렷한 개선 효과를 확인할 수 있었다. 그리고 각각의 실험군에 대한 소장의 변화를 융모/융와의 비율과 상피세포탈락의 정도에 대한 평균으로 지수를 표시하였다 (도 6c).

상기와 같은 결과들은 본 발명의 고삼 추출물, 이의 분획물, 이로부터 분리된 화학식 1 내지 8의 화합물이 인터페론 베타의 발현 증가에 의한 면역증강 효과에 의하여 가축의 설사 및 소화기 병변의 치료 효과가 있음을 뒷받침하는 것이다.

실시예 13: 안전성 검사

각각의 실험군 즉 1) 바이러스 무접종 음성 대조군, 2) 바이러스 단독 접종 및 비투약 대조군, 3) 바이러스 접종 및 투약군의 실험동물에서 부검을 통하여 채취한 각각의 장기 및 조직을 상술한 바와 같이 포르말린 고정 후, 파라핀 포매와 3 mm 절편을 제작하여, H&E 염색 한 다음, 광학현미경으로 각각의 장기 및 조직에서의 형태학적 변화를 검사하여, 투여약물의 안전성을 검사하였다.

제제예 1: 산제의 제조

고삼 추출물, 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 flavanone계열의 화합물 을 유효 성분으로 하는 조성물 0.1 g

유당 1.5 g

탈크 0.5 g

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2: 정제의 제조

고삼 추출물, 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 flavanone계열의 화합물 을 유효 성분으로 하는 조성물 0.1 g

락토스 7.9 g

결정성 셀룰로오스 1.5 g

마그네슘 스테아레이트 0.5 g

총량 10 g

상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조한다. 각 정제의 총량은 500 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 50 ㎎이다.

제제예 3: 분말제의 제조

고삼 추출물, 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 flavanone계열의 화합물 을 유효 성분으로 하는 조성물 0.1 g

옥수수전분 5 g

카르복시 셀룰로오스 4.9 g

총량 10 g

상기에 나열된 성분들을 잘 혼합하여 분말을 제조한다. 경질 캡슐에 분말 500 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조한다.

제제예 4: 주사제의 제조

고삼 추출물, 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 flavanone계열의 화합물 을 유효 성분으로 하는 조성물 0.1 g

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5: 액제의 제조

고삼 추출물, 이의 분획물, 또는 이들로부터 유래된 flavanone계열의 화합물 을 유효 성분으로 하는 조성물 0.1 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬행을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (17)

1. 하기 화학식 1 및 4 내지 7로 표시되는 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항로타바이러스 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
   [화학식 4]
   

   

   
   [화학식 5]
   

   

   
   [화학식 6]
   

   

   
   [화학식 7]
   

   

   
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 스테비아(Stevia rebaudiana) 추출물 또는 스테비오사이드(stevioside)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항의 화합물 중 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 고삼(Sophora flavescens) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항로타바이러스 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 스테비아(Stevia rebaudiana) 추출물 또는 스테비오사이드(stevioside)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 돼지설사병 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제1항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 의약외품 조성물.
   
10. 제1항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 식품 조성물.
    
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제

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