KR20090001181A - 식물추출물을 함유하는 돼지설사병 예방용 사료첨가제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물추출물을 함유하는 돼지 설사병 예방용 사료첨가제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 백화사설초, 어성초, 고삼, 영지 및 백굴채로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 식물체의 추출물을 함유하는 돼지설사병 예방용 사료첨가제에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 재배가 용이하면서도 저렴한 식물의 추출물을 사료첨가제로 사용함으로써, 경제적이면서도 친환경적인 방법으로 돼지의 설사병을 예방할 수 있다.

돼지 설사병, 사료첨가제, 백화사설초, 어성초

Description

식물추출물을 함유하는 돼지설사병 예방용 사료첨가제{Feed Additive Comprising Extract Plant for Preventing Porcine Diarrhea}

가축의 설사는 사료의 급변, 스트레스, 온도 변화 등 외부환경에 의해 발생하여, 대장균, 살모넬라 등 세균성과 TGE, PED 등 바이러스성으로 크게 구분되어진다. 심한 설사가 계속되어 섭취한 영양소의 흡수 장애가 일어나면서 체조직의 수분과 전해질이 상실되어 탈수증 및 전해질의 불균형이 뒤따르게 된다. 설사병 발생시 동물 폐사의 원인은 설사병 자체보다 2차적으로 발생하는 탈수증에 기인하는 경우가 많다. 그러므로 치료시 병인체를 제거하기 위한 항균제 요법과 동시에 상실된 수분과 전해질을 보충해주어야 한다. 설사는 일반적으로 저항력이 약한 자돈에 발생이 많은데 전염성 설사는 특히 이유전 포유자돈에 다발하며, 거의 다수가 폐사하고 치유가 되더라도 성장장애로 막대한 손실을 초래하는 경우가 많다. 그러므로 설사병을 합리적으로 예방하고 치료한다는 것은 양돈업의 성패를 가름하는 중요한 일이다.

설사병의 예방과 치료에는 백신요법과 항생제 투여가 주로 병행되고 있는 실 정이다. 특히　바이러스성　설사병의　 경우　빠른　전파로　말미암아　자돈의　대량　폐사를　야기하고　무엇보다　치료물질의　개발이　부진한　실정이다．우리나라의 경우　돼지의　바이러스성　설사병인　티지이，로타，피이디등이　만연하여　지속적으로　큰　피해를　주고　있다．세균성　질병의　대책으로　사용되는　합성　항생제의　사용도　 규제 움직임이 확산되고 있다. FDA는 향후 동물용 의약품의 허가를 신청할 경우 해당 약물이 인체내에서 약물 내성 증가에 관여하거나 질병을 유발하는 세균들의 증식을 촉진시킬 가능성 등을 평가한 서류를 반드시 첨부토록 요구하기로 결정했다고 한다. 세계보건기구(WHO)가 가축사료용 항생제 사용의 위험을 경고하고, 유럽연합(EU)도 치료목적 외에는 항생제를 투여하지 못하도록 규제하고 있다. 우리 농림부도 2005년 5월부터 축산물의 안전성 제고를 위해 사료에 혼합할 수 있는 항생제 등 동물용 의약품의 종류를 현행 53종에서 25종으로 감축하는 등 국제적인 항생제 사용규제의 움직임에 동참하고 있다. 또한 육류 소비자들의 건강에 대한 관심이 커지면서 안전한 축산물을 선호하는 경향이 높아지고 있는 실정이다. 이렇게 국내외를 막론하고 다양한 관점에서 무분별한 항생제 사용에 대한 우려의 목소리가 높아지고 있다는 것을 실감할 수 있다.

이에 본 발명자들은, 돼지 설사병에 유용한 물질을 천연 식물에서 추출하기 위하여, 예의 노력한 결과, 백화사설초, 어성초의 추출물을 돼지사료에 첨가하여 급여하면, 바이러스나 세균에 의해 발생하는 돼지 설사병을 친환경적으로　예방 및 치료할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 식물체 추출물을 함유하는 돼지 설사병 예방용 사료첨가제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백화사설초, 어성초, 고삼, 영지 및 백굴채로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 식물체의 추출물을 함유하는 돼지설사병 예방용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 20~100% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 백화사설초 추출물 및 어성초 추출물을 함유하는 돼지설사병 예방용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 백화사설초 추출물 및 어성초 추출물은 20~100% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 백화사설초 추출물을 10~50% 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 어성초 추출물을 10~50% 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 주변에서 구하기 쉽고 재배가 용이하며, 저렴한 식물을 대상으로 항균력이 높을 것으로 예상되는 식물체에서 항균물질을 추출하여, 자돈 설사병을 일으키는 세균과 바이러스에 대한 항균성을 확인하였다.

본 발명에서는 돼지 설사병을 유발하는 세균 E. coli, E. coli 0157, S. typhimurium 및 S. enteritidis Salmnella dublin, Salmonella cholerasuis에 대한 식물추출물의 항균활성을 측정하여 항균활성이 높은 물질을 선별하였다.

또한, 본 발명에서는 돼지 설사병을 유발하는 바이러스인 TGEV (Transmissible gastroenteritis virus), PEDV(Porcine epidemic diarrhea), PRTV(Porcine Rotavirus) 및 PRRS(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)에 대한 식물추출물의 항바이러스 효능을 측정하여, 상기 바이러스에 대한 항바이러스활성이 높은 물질을 선별하였다.

상기 TGEV는 Coronaviridae의 Coronavirus속에 속하는 RNA바이러스로 돼지의 전염성 소화기병을 일으키며. 구토, 수양성 설사, 탈수 등을 특징으로 하며, 연령과 관계없이 이환율이 높으며, 치사율은 어린 연령일수록 높다.

PEDV는 일령에 관계없이 발생되는 돼지의 전염병으로 구토와 수양성 설사, 탈수 등 전염성위장염(TGE)과 매우 유사한 증상을 일으키나 2주령 미만의 포유자돈에서의 폐사율이 TGE보다 낮고, 비육돈 및 성돈에서의 발병율은 높게 나타난다.

PRTV는 Rotaviridae의 Rotavirus속에 속하는 RNA바이러스로 야외저항성이 매우 강하며 주로 2주령 정도의 어린 자돈에 많이 발생하는 설사병의 원인체로 폐사율은 낮으나 전파력이 강한 편이다.

돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome: PRRS)은 예전에는 Blue-ear disease(청이병)라고도 했으며 모돈의 번식장애와 유ㅇ사산, 미이라화를 일으키고 자돈에서 위축 호흡기질환을 보이는 질병으 로 제 2종 법정전염병이다. 원인체로는 Arterivirus, Arteriviridae (ssRNA, envelope 지님)이며 세균, 바이러스의 2차 감염에 의해 호흡기 증상이 악화된다. 오염된 점액, 배설물(분뇨), 정액(인공수정 및 자연종부)을 매개로 개체간의 직접 접촉 감염된다. 축사내 기구, 차량을 통한 간접 접촉으로도 감염이 된다. 증상으로는 모돈의 경우 임신후기의 유사산, 기형태아, 미이라, 흑자를 일으키며 자돈의 경우 이유 전후의 폐사를 일으킨다. 호흡기 증후군은 식욕부진, 발열, 기침, 설사, 결막염, 드물게 뇌막염(신경증상), 복식ㅇ흉식호흡, 폐렴, 폐사율의 급증, 성장률 저하와 귀, 복부, 외음부에 청색반점(청색증-청이병)을 일으킨다.

본 발명에서 식물의 추출에 사용되는 용매는 95%~30% 에탄올 및 물을 사용하였으며, 추출에 사용된 에탄올의 농도가 높을수록 항균 및 항바이러스 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 위축 및 폐사돈에서 폐사 원인 분석

1일령에서 100일령까지의 돼지 총 15건 23두에 대한 병리학적 검사를 실시하였다. 부검 전 개체의 외관 검사를 면밀히 실시하고 설사 발생 유무를 확인하였다. 필요 시 혈액검사 및 혈청 검사를 수행하기 위하여 경정맥 또는 심장으로부터 직접 채혈을 실시하였으며, 열 반응이 감지되는 개체에 대하여 개체의 체온을 측정하였다.

설사의 원인을 규명하기 위해서 맹결장에 들어 있는 분변을 무균적으로 채취하여 세균 검사 및 병원체 유전자 검사 (polymerase chain reaction: PCR)를 실시하였다. 흉강 및 복강을 개복하여 내부 실질장기의 주요 병변을 확인하였다. 육안병변의 유무에 상관없이 모든 주요 실질 장기는 10% 중성 포르말린에 충분히 고정시켰다. 고정된 조직은 통상적인 방법으로 조직처리 (Tissue processor, Shandon사)를 실시하고 파라핀에 포매하였다. 파라핀 포매조직은 tissue microtome (Leica사)을 이용하여 약 3~4㎛의 두께로 박절한 후, Hematoxylin & Eosin (H&E)으로 염색하여, 광학현미경적으로 병변의 유무를 확인하였다.

장 조직 내에 분포하는 세균을 검출하기 위하여 그람염색 (Gram staining) 또는 은염색 (Silver staining)을 실시하였다. 바이러스 및 세균의 분리 및 동정에 필요한 각각의 시료들을 무균적으로 채취한 다음 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

그 결과, Salmonella typhimurium 감염에 의하여 발생하는 맹.결장 또는 소장의 섬유소성 괴사성 장염인 살모넬라병 (Salmonellosis)이 9건 (15두)으로 가장 많이 검출되었다.

10일령 전후의 포유자돈에서 황색의 수양성 또는 연변을 나타내는 병원성 대장균 (Escherichia coli) 감염에 의한 대장균증(Colibacillosis)이 2건 (3두)에서 검출되었다. 원충성 기생충성 질병으로 Isospora suis 감염에 의한 콕시듐증이 2건 (3두)에서 검색되었으며, 그 중 1두는 살모넬라병과 혼합감염되어 있었다.

특히 육성 비육기에서 심한 혈변 또는 흑변을 나타내며 소장 및 대장 점막의 현저한 비후를 특징으로 하는 Lawsonia intracellμlaris 감염에 의한 급성출혈성 장병증 (Acute proliferative hemorrhagic enteropathy: PHE)이 약 100일령의 육성돈에서 확인되었으며, 나선균인 Brachyspira pilosicoli 감염에 의한 맹결장 나선균증도 1두에서 확인되었다.

돼지 질병별 검색 현황 (N=23)

질병명	검색 현황
	건 수 (%)	두 수 (%)
Salmonellosis	9 (60)	15 (65.2)
Colibacillosis	2 (13)	3 (13.0)
Coccidiosis	1 (6.6)	2 (8.7)
Salmonellosis + Coccidiosis	1 (6.6)	1 (4.3)
Lawsonia infection	1 (6.6)	1 (4.3)
Colonic spirocheatosis	1 (6.6)	1 (4.3)
계	15 (100)	23 (100%)

실시예 2: 천연 식물체에서 항균 및 항바이러스 물질의 추출

항균 및 항바이러스 효과가 알려진 식물인 백화사설초, 고삼, 영지, 어성초, 백굴채 5종을 후보물질로 선정하여 경동시장내의 동양한약유통(주)에서 구매하여 사용하였다.

추출 용매는 95% 에탄올, 70% 에탄올, 30% 에탄올 및 물을 이용하였으며, in vitro 테스트 후에 최적 용매를 정하였다.

실시예 3: 설사원인균에 대한 항균력 측정(broth dilution method)

5종의 후보식물체를 분쇄한 후 3종의 용매(95% 에탄올, 50% 에탄올 및 물)을 이용하여, 100g의 후보물질에 1L의 용매를 사용하여 50℃에서 5시간 동안 추출한 후, 필터페이퍼로 추출용액을 여과한 후, 새로운 용매를 첨가하여 5시간 동안 추출하여 동일한 방법으로 여과하였다. 2회 추출한 용액을 모아서 감압농축기를 이용하여 최대한 농축한 후 동결건조기를 이용하여 추출분말을 제조하였다.

설사 원인균으로는 설사병증을 보이는 돼지에서 분리한 Salmnella dublin, Salmonella cholerasuis, Salmonella typhimurium 및 E. coli 0157 균주를 수의과학 검역원에서 부양받아 사용하였으며, 각 균주를 blood agar에서 배양하여 오염유무를 확인한 뒤 TSB(Trypticase Soy Broth, Difco, Detroit, USA)로 24시간 배양하고 균수를 5x106 cfu/ml로 조정한 후, 상기에서 분말화하여 만들어 둔 어성초, 고삼, 백화사설초, 백굴채 및 영지 분말 0.5g을 5ml 용액에 녹여 2배부터 512배까지 mueller hinton broth(Difco, Detroit, USA)으로 희석한 다음 사용였다.

각 균주에 첨가된 배지에 후보물질이 첨가된 시료를 36℃에서 24시간 동안 배양하여 MIC(minimum inhibitory concentration)를 측정하였다.

그 결과, 원인균에 대하여 MIC는 12.5 ~ 25mg/ml로 나타났으며 그 구체적인 결과는 표 2에 나타내었다. 영지와 어성초 분획이 상대적으로 높은 항균력을 보였다.

용매별 추출물의 항균력(broth dilution method, MIC, mg/ml).

	95% EtOH				50% EtOH				D.W
	A	B	C	D	A	B	C	D	A	B	C	D
영지	12.5	1.56	12.5	12.5	25	25	25	25	12.5	12.5	12.5	12.5
고삼	12.5	12.5	12.5	12.5	50	50	50	50	50	50	50	50
어성초	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	12.5	25	25	25	25
백화사설초	50	50	50	50	25	25	25	25	25	25	25	25
백굴채	25	25	12.5	12.5	25	25	25	25	12.5	12.5	12.5	12.5

A: S. dublin, B: S. cholerasuis, C: S. typhimurium, D: E. coli 0157:H7,

실시예 4: 항바이러스 효능평가( in vitro )

5종의 식물추출물의 돼지에서 전염성 설사를 일으키는 바이러스인 TGEV (Transmissible gastroenteritis virus), PEDV(Porcine epidemic diarrhea), PRTV(Porcine Rotavirus) 및 PRRS(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome)에 대한 항바이러스 효능을 확인하였다. 각각의 바이러스에 대하여 하기의 방법으로 항바이러스능을 시험하였다.

(1) PEDV

96웰 플레이트에 Vero cell을 배양하고, 바이러스 접종전에 바이러스 감작배지{FCS 무함유, trypsin 10μg/ml(배지 10ml당 stock trypsin 0.1ml로 희석하여 사용직전 첨가)} 배지로 2회 세척한 후, 상기 배지 50ml + stock virus 0.1ml로 희석된 바이러스를 각 웰당 50μl씩 접종한 후 2시간 동안 orbital shaker에서 바이러스를 흡착시켰다. 각 웰에서 바이러스 접종액을 제거하고, 바이러스 감작배지(FCS무함유배지)로 1회 세척하였으며, 각 well당 바이러스 감작배지(FCS비함유 2번 배지)으로 2배 serial 희석된 추출물을 50μl씩 분주하였다(A번부터 well 1:20, 1:40, 1:80.......으로 희석됨). 상기 추출물이 분주된 플레이트는 37℃ 배양기에서 4시간 배양한 후, 각 well당 세포 유지배지(4% FCS함유, trypsin 비함유)를 50μl씩 분주하여, 48시간 배양시켰다.

(2) PRTV

96웰 플레이트에 MA-104 cell을 배양하고, 바이러스 접종전에 바이러스 감작배지VM(FCS 비함유, crystallized trypsin 10ug/ml(배지 10ml당 stock trypsin 0.1ml로 희석)) 배지로 2회 세척한 후, 상기 배지 50ml+stock virus 0.1ml로 희석된 바이러스를 각 웰 당 50μl씩 접종한 후 2시간 동안 orbital shaker에서 바이러스를 흡착시켰다. 각 웰에서 바이러스 접종액을 제거하고, 바이러스 감작배지VM(FCS비함유, crystallized trypsin 0.5ug/ml(배지 10ml당 stock trypsin 0.05ml로 희석))으로 1회 세척하였다.

각 well당 바이러스 감작배지 VM(FCS비함유, crystallized trypsin 0.5ug/ml(배지 10ml당 stock trypsin 0.05ml로 희석))으로 2배 계단 희석된 추출물을 50μl씩 분주한 후, 37℃에서 4시간 배양하고, 각 웰 당 세포유지배지(4% FCS함유)를 50μl씩 분주(A번부터 well 1:20, 1:40, 1:80....... 으로 희석됨)한 후, 24시간 배양시켰다.

(3) TGEV

96웰 플레이트에 ST cell을 배양하고, 바이러스 접종전에 배지를 제거한 후, 바이러스 감작배지 50ml+stock virus 0.1ml로 희석된 바이러스를 각 웰 당 50μl씩 접종하고, 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 바이러스를 흡착시켰다. 바이러스 감작배지를 제거한 후, 각 웰 당 2배 계단 희석된 추출물을 100μl씩 분주(10% FCS배지로 희석)하고, 37℃에서 24시간 배양하였다.

(4) PRRS

96웰 플레이트에 MARC-145 cell을 단층배양하고, 바이러스 접종전에 배지를 제거한 후, 바이러스 감작배지 50ml + stock virus 0.1ml로 희석된 바이러스를 각 웰당 50μl씩 접종하고, 2시간동안 37℃ 인큐베이터에서 바이러스를 흡착시켰다. 바이러스 감작배지를 제거한 후, 각 웰 당 2배 계단 희석된 추출물을 50μl씩 분주(10% FCS배지로 희석)하고, 37℃에서 24시간 배양시켰다.

그 결과, 표 3에서 나타난 것처럼 영지와 백굴채의 경우 모든 추출군 및 대상 바이러스 전체에 대하여 효능이 상대적으로 낮게 나타났으며, 고삼과 어성초 B,C의 경우 PEDV, PRTV, PRRS에 대한 효능이 높았으나 어성초의 경우가 조금 더 효능이 높은 것으로 판단되었다. 백화사설초 A, B는 TGEV, PRTV, PRRS에 대하여 효능이 높게 나타났다.

PEDV, TGEV, PRTV, PRRS에 대한 항바이러스 역가(1:희석배수)

바이러스종류 /추출조건	TGEV	PEDV	PRTV	PRRS
영지 A	80	80	320	80
영지 B	160	160	320	160
영지 C	160	160	320	160
고삼 A	320	1280	320	640
고삼 B	320	2560	1280	2560
고삼 C	320	1280	2560	1280
어성초 A	320	1280	640	640
어성초 B	640	2560	1280	2560
어성초 C	320	1280	2560	1280
백굴채 A	160	320	320	320
백굴채 B	160	640	320	640
백굴채 C	2560	640	320	640
백화사설초 A	320	2560	2560	1280
백화사설초 B	320	1280	1280	1280
백화사설초 C	320	320	80	320

A :95% EtOH 추출물, B: 50% EtOH 추출물, C: 물추출물

실시예 3 및 실시예 4의 결과를 토대로 하여 항균 및 항바이러스 효능이 다른 후보물질보다 높게 평가된 어성초와 백화사설초 EtOH 50% 추출분말을 합제로 하여 제형을 만들기로 결정하였다.

실시예 5: 식물 추출물의 유효성분 함량분석

(1) 백화사설초 추출분말의 Ursolic acid 함량분석

Ursolic acid STD(sigma, min.98%) 3.5mg을 50ml 플라스크에 칭량하여 물 10ml을 넣고 30ml의 MeOH를 가한 후 초음파로 약 5분간 처리하고, MeOH를 가하여 정확히 50ml이 되도록하여, 최종80% MeOH로 맞춘 후, 0.45㎛ syringe filter로 여과한 후,이를 표준액으로 하였다.

분석에 사용한 백화사설초 추출액은 하기의 방법으로 제조하였다.

① 백화사설초 물 100% 추출분말 : 100ml 플라스크에 분말 204.5mg을 칭량하고 물 20ml을 넣고 충분히 섞은 후 MeOH 50ml을 가하여 초음파로 약10분간 분쇄하고 이하 표준액과 동일하게 제조하였다.

② 백화사설초 EtOH 30%추출분말 : 100ml 플라스크에 분말 201.3mg을 칭량하고 물 20ml을 넣고 충분히 섞은 후, MeOH 50ml을 가하여 초음파로 약 10분간 분쇄하고 이하 표준액과 동일하게 제조하였다.

③ 백화사설초 EtOH 70%추출분말 : 100ml 플라스크에 분말 200.7mg을 칭량하고 물 20ml을 넣고 충분히 섞은 후, MeOH 50ml을 가하여 초음파로 약10분간 분쇄하고 이하 표준액과 동일하게 제조하였다.

④ 백화사설초 EtOH 100%추출분말 : 100ml 플라스크에 분말 212.1mg을 칭량하고 물 20ml을 넣고 충분히 섞은 후, MeOH 50ml을 가하여 초음파로 약 10분간 분쇄하고 이하 표준액과 동일하게 제조하였다.

분석은 HPLC를 이용하여 실시하였으며, 사용장비와 분석 조건은 하기와 같다.

o HPLC system(YOUNGLIN INSTRUMENT)

Pump-SP930D, Detector-UV730D, Column oven-CTS30

Column : Bondapack C18 3.9 x 300mm Column(Waters)

Chromatograph Data System

:Autochro-1000(ver. 1.0: YOUNGLIN INSTRUMENT)

o Analysis Condition

Mobile Phase : ACN + DW(2ml phosphoric acid) = 800 : 200

Column : μ-Bondapacked C18 3.90 x 300mm(Waters)

Flow rate : 1.0ml/min

Column oven : 35℃

Detector : UV206nm

Mobile phase : 80% MeOH

백화사설초 추출물의 Ursolic acid함량

시료	농도(ppm)	함량(%)
Ursolic acid STD	70ppm (3.5mg/50ml)
백화사설초 물100% 추출분말	2045ppm (204.5mg/100ml)	0.0086%
백화사설초 EtOH 30%추출분말	2013ppm (201.3mg/100ml)	0.15%
백화사설초 EtOH 70%추출분말	2007ppm (200.7mg/100ml)	2.76%
백화사설초 EtOH 100%추출분말	2121ppm (212.1mg/100ml)	4.18%

표 4에 나타난 바와 같이, 백화사설초추출분말중 EtOH 100% 추출분말에서 Ursolic acid 함량이 가장 높았다. 하지만 EtOH 100% 추출물의 성상이 분말이 아닌 끈적끈적한 덩어리 상태였으며 잘 깨지지도 않았다. 향후 공정을 생각한다면 30%~70% EtOH추출하는 방법이 적당할 것으로 사료되었다.

(1) 어성초 추출분말의 Quercetin 함량분석

Quercetin STD(sigma, min.98%) 5.0mg을 50ml 플라스크에 칭량하여 넣고, MeOH 30ml을 가한 후 초음파로 약 10분간 분쇄한 후 MeOH를 가하여 정확히 50ml로 용액을 만들고, 0.45㎛ syringe filter로 여과한 후, MeOH를 가해 20ppm, 40ppm, 60ppm, 80ppm으로 희석하여, 표준액을 제조하였다.

분석에 사용한 어성초 추출액은 하기의 방법으로 제조하였다.

① 어성초 물 100% 추출분말 : 100ml 플라스크에 어성초 분말 0.95g을 칭량하고 75% EtOH 50ml을 넣고 충분히 섞은 후 초음파로 약 60분간 분쇄하고 HCl을 2.5N되게 가하여 80℃ 항온수조에서 40분간 가수분해하고 방냉한 후, 75% EtOH를 가해 정확히 100ml로 하였다. 상기 용액을 0.45㎛ syringe filter로 여과하여 검액을 제조하였다.

② 어성초 EtOH 30%추출분말 : 100ml 플라스크에 분말 0.93g을 칭량하고 75% EtOH 50ml을 넣고, 이하 ①과 동일한 방법으로 검액을 제조하였다..

③ 어성초 EtOH 70%추출분말 : 100ml 플라스크에 분말 0.99g을 칭량하고 75% EtOH 50ml을 넣고, 이하 ①과 동일한 방법으로 검액을 제조하였다..

④ 어성초 EtOH 100%추출분말 : 100ml 플라스크에 분말 0.98g을 칭량하고 75% EtOH 50ml을 넣고, 이하 ①과 동일한 방법으로 검액을 제조하였다..

백화사설초 추출물 분석에 사용한 것과 동일한 HPLC를 사용하여, 칼럼을 COSMOSIL packed column C18 4.60 x 250mm을 사용하였다. 분석 조건은 하기와 같다.

Mobile Phase : MeOH +DW(2ml Acetic acid) = 500 : 500

Column : COSMOSIL packed column C18 4.60 x 250mm Column

Flow rate : 0.7ml/min

Column oven : 35℃

Detector : UV370nm

Mobile phase : 75% EtOH

어성초 추출물의 Quercetin함량

시료	농도(ppm)	함량(%)
Quercetin STD	20ppm (5.0mg/50ml) (5배 희석)
어성초 물100% 추출분말	2045ppm (204.5mg/100ml)	0.20
어성초 EtOH 30% 추출분말	2007ppm (200.7mg/100ml)	0.57
어성초 EtOH 70% 추출분말	2013ppm (201.3mg/100ml)	0.78
어성초 EtOH 100% 추출분말	2121ppm (212.1mg/100ml)	1.45

표 5에 나타난 바와 같이, 어성초추출분말 중 EtOH 100%추출 분말에서 Quercetin함량이 가장 높았다. 그러나 EtOH 100% 추출물의 성상이 분말이 아닌 끈적끈적한 덩어리 상태였으며 잘 깨지지도 않았다. 향후 공정을 생각한다면 30%~70% EtOH로 추출하는 방법이 적당할 것으로 사료된다.

실시예 6:랫드에서의 백화사설초, 어성초 단회투여 독성시험

랫드를 이용하여 백화사설초와 어성초의 단회투여독성 유무를 확인하였다..

시험물질인 백화사설초와 어성초의 단회경구투여에 의한 독성을 조사하기 위하여 7주령 Sprague - Dawley(SD)계통 랫드 ((주)중앙실험동물, 한국) 암컷 45 마리와 수컷 45 마리에 백화사설초와 어성초 50% EtOH 추출물 진공건조한 분말을 경구투여하였다. 실험군은 표 6과 같이 분류하였으며, 랫드는 1주일간의 순화기간을 두면서 일반증상을 관찰하고 건강한 동물만을 시험에 사용하였다.

시험군의 구성

군		성별	동물수
백화사설초	250 mg/kg B.W. 500 mg/kg B.W. 1000 mg/kg B.W. 2000 mg/kg B.W.	수컷 암컷 수컷 암컷 수컷 암컷 수컷 암컷	5 5 5 5 5 5 5 5
어성초	250 mg/kg B.W. 500 mg/kg B.W. 1000 mg/kg B.W. 2000 mg/kg B.W.	수컷 암컷 수컷 암컷 수컷 암컷 수컷 암컷	5 5 5 5 5 5 5 5
용매대조군	수돗물	수컷 암컷	5 5

실험은 온도 21± 3℃, 상대습도 50± 10%, 환기회수 10-12/hr, 조명시간 12시간, 조도 150 - 200 lux로 설정된 동물실험실에서 실시하였다. 순화기간 및 시험기간 중에 폴리카보네이트 상자에 5마리/사육상자로 사육하였다. 사육상자에는 시험번호, 동물번호 및 시험물질을 기입한 tag을 붙였다. 사료는 실험동물용 고형사료를 자유급여했으며, 음수는 상수도로 자유섭취시켰다. 시험물질은 주사기를 이용하여 1회 2ml 씩 경구 투여하였다. 최고농도용량을 일반적인 독성용량 2000 mg/kg B.W.으로 정하고 최고농도 용량에서 1/2 공비로 나아가서 1000 mg/kg B.W., 500 mg/kg B.W., 250 mg/kg B.W.으로 투여하였다.

투여 후 6시간은 매시간 관찰하며, 그 후 기간은 1일 1회 관찰하였다. 일반상태의 변화, 중독증상 및 사망동물의 유무를 주의 깊게 관찰하였다. 동물의 증상은 체모, 눈 및 점막, 호흡기계, 순환기계, 자율신경 및 중추신경계, 전신운동능력 및 행동패턴을 포함하여 관찰하였다. 사망한 시간은 가능한 정확히 기록하였다.

검체의 체중은 투여 개시일, 투여 후 4일, 7일, 14일에 측정하였다.

시험 중 폐사 동물은 그때마다 부검을 실시하고, 시험 종료 시 생존동물은 ether 마취로 치사시켜 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 육안적으로 이상이 확인되는 장기와 조직은 10% 중성 포르말린에 고정하였다.

통계프로그램 SPSS 10.0을 사용하여 처치 전후의 몸무게 변화를 분석하였다. 백화사설초 처치 후 시간의 변화에 따라 ANOVA로 통계처리하여 각 집단간의 체중변화의 차이를 검증하였다.

투여 후, 2주간의 사망률, 일반증상, 체중변화 및 부검소견을 관찰하였다. 시험결과는 다음과 같다.

모든 시험군에서 전시험기간을 통하여 시험물질의 투여와 관련된 사망동물이 발생하지 않았다. 일반증상에서 시험물질에 의한 특이변화는 관찰되지 않았다. 체중변화에서 시험물질에 의한 특이변화는 관찰되지 않았다. 부검한 결과 시험물질 투여에 의한 변화는 관찰되지 않았다.

따라서, 백화사설초와 어성초의 랫드에 대한 최소 치사량은 암수 모두 2000 mg/kg B.W.을 상회하는 것으로 확인되었다.

실시예 7: 랫드에서의 백화사설초, 어성초추출물 반복투여독성시험

랫드를 이용하여 백화사설초, 어성초추출물의 반복투여독성 유무를 관찰하기 위해 실시하였다.

7주령 Sprague - Dawley(SD)계통 랫드 ((주)중앙실험동물, 한국) 암컷 40 마리와 수컷 40 마리에 경구투여하였다. 실험군은 표 7과 같이 분류하였으며, 랫드는 1주일간의 순화기간을 두면서 일반증상을 관찰하고 건강한 동물만을 시험에 사용하였다.

시험물질로는 백화사설초( Oldenlandia diffusa)과 어성초( Houttuyniae Herba)를 각각 50% EtOH을 사용하여 그 추출물을 농축하여 진공건조 후 분말화한 후 백화사설초 추출분말 50% + 어성초추출분말 50%를 섞어서 시험물질로 사용하였다.

시험군 구성

군	성별	동물수
용매대조군	수컷	10
	암컷	10
저용량 투여군 (0.002%(W/W))	수컷	10
	암컷	10
중간용량 투여군 (0.02%(W/W))	수컷	10
	암컷	10
고용량 투여군 (0.2%(W/W))	수컷	10
	암컷	10

시험은 온도 22 ± 3℃, 상대습도 50 ± 10%, 환기횟수 10~12회/hr, 조명시간 12시간 (07:00 ~ 19:00), 조도 150~200 lux로 설정하였다. 순화기간 및 시험기간 중에 polycarbonate 케이지에 사육하였다. 사육상자에는 시험 번호, 동물번호 및 투여량을 기입한 tag을 붙였다. 사료(슈퍼피드)는 자유급여했으며, 음수는 수돗물을 자유섭취시켰다.

시험물질은 1일 1회, 90일간 Zonde를 이용하여 경구 투여하였다.

투여용량은 투여용매의 0.2%의 백화사설초, 어성초추출물을 섞어 저용량으로 정하고 일정한 공비 (x 10)로 중간용량과 고용량을 설정하며, 용매대조군은 백화사설초, 어성초추출물을 혼합하지 않고 시험물질과 같은 방법으로 제조하여 투여하였다.

시험물질을 처치 전에 체중을 측정하여 군간 체중 차이가 없게 무작위법으로 군분리를 실시하였다. 랫드의 식별은 꼬리에 유성매직으로 표시하며, 사육상자별 tag표시법을 이용하였다.

임상증상은 시험 기간 중에 1일 1회 관찰하였다. 관찰방법은 일반임상증상의 종류(anorexia, salivation, diarrhea, polyuria, anuria, fecal change 등)와 그 정도 등을 기록하였다. 사료 섭취량은 사육상자별로 급여총량과 잔량을 투여개시 후 13주간 주 1회 측정하였다. 음수 섭취량은 사육상자별로 급수총량과 잔량을 투여개시 후 13주간 주 1회 측정하였다. 검체의 체중은 모든 동물에 대하여 투여개시 전, 투여개시 후, 시험종료시까지 매주 1회 측정하였다.

시험기간 중 무작위로 각 군당 5마리씩의 동물에 대하여 1회 채뇨한 후, 외관과 뇨량 및 색을 관찰한 다음, 즉시 뇨검사용 시험지(N-mμltistix, AMES)를 사용하여 pH, gravity, nitrite, protein, ketone body, urobilinogen, bilirubin, glucose 및 occult blood을 측정하였다.

투여 기간 중 무작위로 각 군당 5마리씩의 동물에 대하여 육안 및 검안경을 이용한 안과학적 검사를 1회 실시하였다.

일반 혈액학적 검사는 혈액자동분석기 (Coulter S880과 H1, technicon, USA)를 이용하여 투여전 및 부검전 모든 동물에 대하여 다음의 수치를 분석하였다; 적혈구수 (RBC), 총백혈구수 (WBC), 헤모글로빈 (hemoglobin), hematocrit, MCV, MCH, MCHC, platelet, 호산구 (eosinophil), 호중구(neutrophil), 임파구 (lymphocyte), 단핵구 (monocyte), 호염구 (basophil),혈액응고기간 [Prothrombin time (PT). Partial thromboplastin time (PTT)]은 APTT, PT reagent (國際試藥, Japan)를 이용하여 직접 검사함). 혈청생화학적 검사의 경우, 투여 전 및 부검 전 모든 동물에 대하여 채취한 혈액의 일부를 실온에 30분간 방치하고 응고 후 원심분리 (1915.2 g, 30 min)하여 얻은 혈청에 대하여 혈청자동분석기 (Express 550과 SPOCHEMTM SP-440, ARKRAY, Japan)를 이용하여 alaninetransaminase (AST), aspartate transaminase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), albumin, total bilirubin, BUN, cholesterol, creatinine, glucose, Ca, total protein, triglyceride 등을 측정하였다.

모든 시험동물에 대하여 간장, 신장(좌우), 비장, 심장, 부신 (좌우), 뇌, 뇌하수체, 난소(좌우), 자궁, 고환(좌우), 폐장, 흉선 갑상선(좌우) 등의 절대장기 중량 및 체중에 대한 상대장기 중량을 측정하였다.

모든 시험동물에 대하여 ether로 마취한 다음 복대동맥을 절단하여 충분히 방혈시켰다. 장기중량 측정이 끝난 모든 장기를 10% 중성 포르말린에 고정시켰다. 2주 이상의 충분한 고정을 거친 후 장기조직을 파라핀 포매기 (SAKURA, Tissue-Tek VIP, vaccum infiltration Processor)에 포매하고 마이크로톰(Microm, HM340E)으로 4~5 ㎛ 절편을 만들어 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하여 조직을 관찰하였다.

본 실험에서 얻은 측정치의 통계학적 분석은 통계처리 computer program인 SAS (Statistical Analysis System)를 이용하여 등분산 검정후 one-way ANOVA에서 유의한 F값이 관찰되는 항목에 대하여 대조군과 각 용량군 사이에 유의수준 p<0.05로 Dunnet's t-test를 이용하여 비교하였고, 조직병리학적으로 관찰된 병변이 관찰시 발생빈도는 χ2 (Chi-square)로 검정을 하였다.

백화사설초, 어성초추출물에 대한 반복투여경구독성 유무를 식품의약품안전청 고시 제 99-61호 "의약품 등의 독성시험기준 (1999. 12. 22)"에 따라 랫드에서 90일간 반복투여 독성시험을 한 결과는 다음과 같다.

시험기간 중 모든 투여군에서 사망하거나 투여물질에 의한 것으로 사료되는 임상증상을 나타낸 동물은 없었다. 투여 기간동안 체중증가의 변화가 수컷의 경우 시험물질 투여 후 7일째에서, 암컷의 경우 14, 21, 28, 35, 49일째에서 유의성이 관찰되었으나 시험기간이 90일에 달하고 56일째 이후에는 용매대조군의 체중에 비해 유의적인 변화가 관찰되지 않았으므로 생후 8주 이전에 미성숙기를 거치는 동안 일어나는 개체차에 의한 것이라고 사료되었다.

사료섭취량의 경우 수컷에서는 투여 7, 21, 28, 35, 42일째에 시험물질 투여군이 용매대조군에 비해 유의적인 차이가 나타났다. 또한 암컷의 경우 투여 7, 21, 28, 35, 63일째에 용매대조군에 비해 모든 용량군에서 유의적인 차이가 나타났다.

음수량의 경우 수컷에서 투여 14, 21, 28, 70, 77일째에 용매대조군에 비해 고용량군과 저용량군에서 유의적인 차이를 나타냈고, 암컷의 경우 투여 7, 63일째에 용매대조군에 비해 모든 용량군에서 그리고 투여 28, 77일째에 용매대조군에 비해 고용량군, 중간용량군에서 유의적인 차이가 나타났다. 그러나, 시험물질 투여 후 56일 이전에는 성성숙이 일어나는 동안 관찰된 체중의 유의적인 변화에 이와 유사한 사료와 음수 섭취량의 유의적인 변화가 관련이 있다고 사료된다. 또한, 생후 8주 이후의 성숙 랫드에서는 정상적인 체중증가가 관찰되는 것으로 보아 백화사설초,어성초추출물의 투여로 인해 유발된 것으로 사료되지 않는다.

시험기간 중 1회 실시한 뇨검사와 안검사 결과 투여군에서 용매대조군에 비해 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 비록 뇨검사에서 occult blood와 ketone body의 수치가 모든 개체에서 양성으로 판정되었지만, 이번 시험결과를 분석하여 보면, 용매대조군을 포함한 전 투여군에서 occult blood와 ketone body의 양성 데이터가 농도의존적이지 않는 것으로 보아 시험물질에 의한 것이 기인한 것보다는 용매대조군을 포함한 전 개체가 섭취한 고형사료의 성분이나 함량에 의한 것으로 사료된다.

부검시 육안적인 검사 결과 투여물질에 의한 독성이라고 사료되는 어떠한 변화도 관찰되지 않았고, 혈액학 및 혈청생화학적 검사결과 수컷은 glucose의 수치가 용매대조군에 비해 중간용량군과 저용량군에서 유의적인 증가를 나타냈으나 용량의존적이지 못하고 부검당시인 17주령 수컷 랫드의 glucose 정상치 (163± 13 mg/dl)와 비교해 보았을 때 시험물질 중간용량군과 고용량군이 정상범위 내에 존재함으로 보아 시험물질 투여로 인해 나타난 독성이라고 판단되지 않는다. ALP의 경우, 모든 농도에서 용매대조군에 비해 유의적인 증가가 나타났고, TG 수치는 저용량군에서 용매대조군에 비해 유의적인 증가가 관찰되었으나, 17주령 랫드의 정상범위 (82± 37 mg/dl)내에 존재하기 때문에 투여물질에 의해 나타난 독성으로 사료되지 않는다.

암컷은 알부민이 용매대조군에 비해 저용량군에서 유의적 차이를 나타냈고, 나트륨이온은 중간용량군과 저용량군에서 유의적 차이가 나타났으나 용량의존적인 결과를 나타내지 못함으로 백화사설초,어성초추출물의 투여로 인한 것으로 사료되지 않는다. 그리고 암컷의 glucose 수치에서 중간용량군과 저용량군이 유의적인 증가가 나타났고, cholesterol의 수치에서 고용량군이 용매대조군에 비해 유의적인 감소가 관찰되었으나 17주령 랫드 암컷의 정상수치에 해당되므로 유의적인 결과로는 판단되지 않았다.

백화사설초,어성초추출물을 투여하는 과정에서 절대장기는 수컷의 경우 흉선에서 용매대조군에 비해 고용량군에서 유의적인 증가가 나타났고, 부고환 좌, 우 모두 중간용량군에서 유의적인 차이가 나타났다. 암컷의 경우 자궁에서 용매대조군에 비해 고용량군에서 유의적 장기중량의 차이가 관찰되었다. 상대장기는 수컷의 경우 절대장기 중량과 마찬가지로 흉선에서 용매대조군에 비해 고용량군에서 유의적인 차이가 나타났으며 좌우측 부고환이 중간용량군에서 유의적인 감소 경향을 보였다. 암컷의 경우 간에서 고용량군과 중간용량군에서 유의적 차이를 나타냈고, 흉선과 자궁에서 고용량군이 용매대조군에 비해 유의적인 경향을 나타내었다.

혈액학 및 혈청생화학적 검사결과에서 나타나는 통계학적인 유의성은 랫드에서 정상 수치의 범위 안에 있고, 장기중량의 유의적인 차이는 수컷의 흉선과 암컷의 자궁을 제외하고는 모두 고용량이 아닌 중간용량이나 저용량에서 나타나는 것으로 보아 백화사설초,어성초추출물의 투여로 인한 농도 의존적 독성변화로 보기 어렵다. 또한, 흉선과 자궁의 경우, 육안소견 및 조직병리학적 소견에서 어떠한 이상도 발견되지 않는 것으로 보아 이러한 장기중량의 유의적인 변화는 백화사설초,어성초추출물의 투여로 인한 변화로 생각되지 않는다. 조직병리학적 검사결과 대조군을 포함한 전 실험군에서 나타난 조직 병리학적 소견으로 볼 때 물질투여에 의한 독성으로는 여겨지지 않았다.

따라서, 백화사설초,어성초추출물을 랫드에 90일간 반복 투여해 체중 측정, 뇨검사, 안과학적 검사, 혈액학적 검사, 장기중량 및 크기 측정, 그리고 조직병리학적 검사를 종합해 볼 때, 고용량인 백화사설초, 어성초추출물 0.2% 이하의 농도에서는 독성이 없는 것으로 사료되었다.

실시예 8: Challenge test

국내의 양돈장의 이유자돈에서 PMWS와 PRDC의 원인체로 알려져 있고 양돈산업에 막대한 피해를 주고 있는 돼지 써코바이러스 2(porcine circovirus 2, PCV 2)와 돼지 생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)의 혼합감염에 대하여 백화사설초,어성초 복합제형의 항바이러스 효과, 면역력 증진, 내병력 증진 등의 효능을 확인하고자 시험을 실시하였다.

(1) 백화사설초 추출물 분말 및 어성초추출분말의 복합제형의 제조

백화사설초( Oldenlandia diffusa)과 어성초( Houttuyniae Herba)를 각각 50% EtOH을 사용하여 그 추출물을 농축하여 진공건조 후 분말화한 후 표 8에 나타난 조성으로 백화사설초, 어성초 복합제형을 제조하였다.

원료성분	함량(%)
백화사설초 추출분말	24
어성초 추출분말	24
유산균	1
효모	10
초유	1
함수포도당	20
알팔파	20

(2) 돼지를 이용한 효능시험

PCV와 PRRSV에 음성인 35일령의 총 18두 LY계 이유자돈을 3개 실험군으로 설계하였고, 각 실험군당 6두를 대상으로 하였다.

시험군은 실험군과 대조군으로 구분하였으며, 실험군에서 실험A군(6두)은 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형(1㎏/ton)을 시험전(25일령)부터 10일 동안 급여한 후 2.5㎖의 PCV 2(107 TCID50/㎖)와 2.5㎖의 PRRSV(105 TCID50/㎖)를 공격접종한 후에 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형(1㎏/ton)을 10일간 지속하여 급이한 군, 실험B군(6두)은 2.5㎖의 PCV 2(107 TCID50/㎖)와 2.5㎖의 PRRSV(105 TCID50/㎖)를 접종한 후 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형(2㎏/사료ton)을 10일간 급이한 군으로, 대조군(6두)은 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 일체 급이 하지 않고 2.5㎖의 PCV 2(107 TCID50/㎖)와 2.5㎖의 PRRSV(105 TCID50/㎖)만을 접종한 군으로 나누어 실시하였다.

시험 전 기간 동안 모든 시험군은 교차 오염을 방지하기 위하여 분리된 사육시설에 동일한 사육환경하에서 수용하였고, 사료급이는 일령에 따라 정해진 양을 급여하였으며, 음수는 자유급이토록 하였다.

바이러스의 공격접종은 마취를 실시하여 기관내로 투브를 삽입하여 접종하였고, 공격접종한 후 10일 후에 부검을 실시하여 육안으로 폐병변에 대한 검사를 실시하였다. 시험 전 기간 동안 임상증상은 직장체온, 호흡수, 복식호흡, 활동성, 눈과 비강 분비물, 기침, 식욕부진, 설사 등을 공격접종 후 매일 일정시간에 검사하였다. 직장체온은 40℃미만은 0, 40℃이상일 때는 1로 하여 총 실험군당 체온지수와 두당체온지수를, 호흡수, 복식호흡, 활동성은 정상은 0, 미약한 정도는 1, 뚜렷한 정도는 2로, 기침과 식욕부진은 무증상은 0, 증상을 관찰시는 1, 눈과 비강의 분비물 및 설사는 관찰기간일로 측정하여 정상은 0, 1-4일간은 1, 5-8일간은 2, 9-10일간은 3으로 하여 시험 기간 동안 실험군간 총 관찰 임상증상지수와 두당 관찰임상증상지수로 측정하였다. 체중은 바이러스 공격접종 전과 공격접종 후 10일인 종료 시에 측정하여 성장률을 확인하였다. 공격 접종한 바이러스에 대한 비강 swab은 공격접종 후 매일 실시하여 바이러스 배설 유무를 PCR로 확인하였다.

바이러스를 기관내로 공격접종을 한 후 10일 동안 매일 직장에서 체온을 측정하고 호흡수, 복식호흡, 활동성, 식욕부진, 설사, 기침, 눈과 비강의 분비물을 검사한 결과는 표 9 및 표 10에 나타내었다.

직장체온에 있어서 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험(A)군은 총 직장체온지수는 8, 두당 직장체온지수는 1.3을, 실험(B)군은 총 직장체온지수는 7, 두당 직장체온지수는 1.2를, 대조군은 총 직장체온지수는 13, 두당 직장체온지수는 2.2를 보여 대조군이 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험구들에 비하여 높은 직장체온을 보였다 (표 9).

호흡수, 복식호흡, 활동성, 식욕부진, 설사, 기침, 눈과 비강의 분비물면에 있어서 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험(A)군은 각각의 총임상지수는 4, 3, 15, 18, 0, 13, 0을, 각각 임상증상에 대한 두당 임상지수는 0.7, 0.5, 2.5, 3.0, 0.0, 2.2, 0.0을 보였고, 실험(B)군은 각각의 총임상지수는 6, 3, 16, 13, 0, 16, 0을, 각각 임상증상에 대한 두당 임상지수는 1.0, 0.5, 2.7, 2.2, 0.0, 2.7, 0.0을 보였다. 대조군은 각각의 총임상지수는 21, 6, 15, 13, 0, 31, 6을, 각각 임상증상에 대한 두당 임상지수는 4.5, 1.0, 3.0, 2.2, 0.0, 6.5, 1.5를 보였다. 전반적으로 대조군이 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형 급이실험군들에 비하여 심한 호흡기성 임상증상을 보였으나 식욕부진과 활동성에 있어서는 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형 급이 실험군들이 대조군에 비하여 높은 임상지수를 보였다 (표 10).

폐사면에 있어서는 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험군들에서는 폐사를 관찰할 수 없었으나 대조군에서는 2두(33.3%)가 폐사하였다 (표 10).

PCV 2 및 PRRSV가 접종된 돼지의 체온 변화

군	Piglet No.	Body temperature (℃)											Cumulative score
		Days postchallenge
		0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
A	1	39.39	39.54	NTa )	39.77	39.74	39.69	40.73	39.54	39.28	39.22	39.89	8 (1.3)*
	2	39.25	39.55	NT	39.67	39.37	39.62	39.98	39.81	39.72	39.64	40.12
	3	39.70	39.40	NT	39.21	39.27	39.39	39.70	39.65	39.47	39.32	39.64
	4	39.63	39.34	NT	39.96	39.77	39.98	40.98	39.11	39.4	40.21	40.55
	5	39.26	39.59	NT	39.16	39.20	39.25	39.65	40.04	39.66	39.54	40.30
	6	39.78	39.50	NT	39.76	39.30	39.45	39.97	39.34	39.48	40.77	39.64
B	1	39.40	39.47	NT	39.06	39.16	39.26	39.65	40.01	39.78	39.66	39.56	7 (1.2)
	2	38.63	39.32	NT	38.52	39.15	38.70	39.47	39.39	39.79	39.72	39.23
	3	39.07	39.48	NT	38.40	39.45	39.75	41.02	41.04	40.16	40.06	41.59
	4	39.62	39.39	NT	38.88	39.54	39.34	39.82	39.75	39.1	38.88	39.40
	5	40.80	39.28	NT	38.80	38.80	39.37	39.52	39.78	39.97	39.45	39.63
	6	39.57	39.51	NT	38.91	39.54	39.45	39.43	39.77	39.57	39.44	39.72
C	1	39.57	39.46	NT	39.59	38.80	39.46	40.09	39.51	39.52	39.65	39.61	13 (2.2)
	2	39.25	40.03	NT	39.19	39.68	40.00	40.31	Db )
	3	39.84	39.23	NT	39.09	39.83	40.50	D
	4	38.76	39.19	NT	38.82	38.89	39.28	39.86	40.01	40.57	39.59	38.94
	5	38.96	39.46	NT	39.94	39.34	39.46	39.75	40.03	41.18	40.75	39.71
	6	39.65	39.28	NT	39.16	39.41	40.44	39.72	40.69	41.33	40.98	40.48

a) : NT=not tested, b) : D=died. * : No. of pigs showing ≥40.0℃/No. of pigs tested.

PCV 2 및 PRRSV가 접종된 돼지의 임상지수

군	Clinical sign	Days postchallenge											Cumulative score	Mortality (%)
		0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
A	Respiratory rate	0*	2	2	0	0	0	0	0	0	0	0	4(0.7)**	0/6(0.0)
	Abdominal breath	0	1	1	1	0	0	0	0	0	0	0	3(0.5)
	Activity	0	2	2	2	0	0	0	3	2	2	2	15(2.5)
	Anorexia	0	0	0	2	2	3	2	3	2	2	2	18(3.0)
	Diarrhea	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0(0.0)
	Coughing	0	2	2	2	0	0	0	0	3	2	2	13(2.2)
	Ocular and nasal discharge	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0(0.0)
B	Respiratory rate	0	3	3	0	0	0	0	0	0	0	0	6(1.0)	0/6(0.0)
	Abdominal breath	0	1	2	0	0	0	0	0	0	0	0	3(0.5)
	Activity	0	3	2	3	0	0	1	1	2	2	2	16(2.7)
	Anorexia	0	0	0	0	0	0	2	2	3	3	3	13(2.2)
	Diarrhea	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0(0.0)
	Coughing	0	3	3	1	3	0	0	0	2	2	2	16(2.7)
	Ocular and nasal discharge	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0(0.0)
C	Respiratory rate	0	3	3	3	0	0	0	0	4	4	4	21(4.5)	2/6(33.3)
	Abdominal breath	0	2	2	2	0	0	0	0	0	0	0	6(1.0)
	Activity	0	3	3	3	0	0	0	0	2	2	2	15(3.0)
	Anorexia	0	2	2	3	0	0	0	0	2	2	2	13(2.2)
	Diarrhea	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0(0.0)
	Coughing	0	4	3	4	0	0	0	0	4	4	4	31(6.5)
	Ocular and nasal discharge	0	0	0	0	0	0	0	0	2	2	2	6(1.5)

* : No. of pigs showing clinical sign x point of clinical sign,

** : No. of pigs showing clinical sign x point of clinical sign/No. of pigs tested.

바이러스를 공격접종하고 시험 전기간 동안의 체중, 두당평균일당증체(ADG), 사료요구율(FC)에 대한 성장률은 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험(A)군은 시험전 평균두당체중은 8.48kg, 종료시 두당평균체중은 10.93kg으로 두당평균일당증체(ADG)는 0.244kg, 사료요구율은 3.840이었고, 실험(B)군은 시험전 평균두당체중은 8.97kg, 종료시 두당평균체중은 11.9kg으로 두당평균일당증체(ADG)는 0.297kg, 사료요구율은 3.160이었다. 실험군간에는 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 바이러스를 공격접종 전과 후에 각각 10일간 급이한 실험(A)군이 공격접종 후 10일 동안 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험(B)군에 비해 낮은 성장률을 보였다. 대조군은 시험전 평균두당체중은 9.31kg, 종료시 두당평균체중은 11.48kg으로 두당평균일당증체(ADG)는 0.217kg, 사료요구율은 4.294로 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험군들에 비하여 낮은 증체율을 보였다 (표 11).

PCV 2 및 PRRSV가 접종된 돼지의 체중, 일일 증체율(ADG) 및 사료전환율(FC)

Group	Piglet No.	Body weight(㎏)			ADG(kg)	FC
		Days postchallenge		Difference
		0	10
A	1	9.35	11	1.65	0.244	3.840
	2	10.45	11.35	0.9
	3	8.45	11.75	3.3
	4	9.05	13.3	4.25
	5	6.5	8.4	1.9
	6	7.1	9.75	2.65
B	1	8.9	10.7	1.8	0.297	3.160
	2	9.85	12.8	2.95
	3	10.85	13.15	2.3
	4	8.75	12.8	4.05
	5	7.4	11.05	3.65
	6	8.05	11.1	3.05
C	1	8.35	10.55	2.2	0.217	4.294
	2	11.1	14.5, Da )	3.4
	3	8.4	7.3, D	-1.1
	4	8.0	10.6	2.6
	5	8.85	12.8	3.95
	6	11.15	13.15	2.0

a) : D=died

공격 접종한 바이러스에 대한 배설여부를 확인하기 위하여 공격접종 후 매일 비강에서 샘플 채취하였으며, 부검을 실시한 후 폐조직에서 공격접종 바이러스의 검출 유무를 PCR로 확인하였다. 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험(A)군의 PCV2와 PRRSV의 검출은 각각 비강 swab 샘플에서는 66예 중에서 29예(43.9%)와 18예(27.3%), 폐에서는 6예 중에서 2예(33.3%)와 1예(16.7%)에서, 실험(A)군은 각각 비강 swab 샘플에서는 66예 중에서 32예(48.5%)와 19예(28.8%), 폐에서는 6예 중에서 2예(33.3%)와 2예(33.3%)에서 검출되었다. 대조군에서는 각각 비강 swab 샘플에서는 59예 중에서 49예(83.1%)와 22예(37.3%), 폐에서는 6예 중에서 6예(100%)와 3예(50.0%)에서 검출되어 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험군들에 비하여 비강과 폐에서 높은 검출률을 보였고, 바이러스 공격접종 전과 후에 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험군에서 가장 낮은 검출률을 보였다 (표 12).

PCV 2 및 PRRSV가 접종된 돼지의 비강과 폐에서의 바이러스 검출율

군

Piglet No .

Nasal swabs

Lung

Cum μ lative positivity (%)***

Days postchallenge

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Nasal swab

Lung

PCV 2

PRRSV

PCV 2

PRRSV

A

1

-/-*

+/+

+/+

+/+

+/+

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

29/66 (43.9)

18/66 (27.3)

2/6 (33.3)

1/6 (16.7)

2

-/-

+/+

+/+

+/+

-/+

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

3

-/-

+/+

+/+

+/-

+/+

+/-

+/-

-/-

-/-

-/-

+/-

+/+

4

-/-

+/+

+/+

+/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

5

-/-

+/+

+/+

+/-

+/+

+/-

+/-

-/-

-/-

-/-

+/-

+/+

6

-/-

+/+

+/+

+/-

+/-

+/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

B

1

-/-

+/+

+/+

+/-

+/-

-/-

-/-

-/-

-/-

+/-

-/-

+/-

32/66 (48.5)

19/66 (28.8)

2/6 (33.3)

2/6 (33.)

2

-/-

+/+

+/+

+/-

+/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

3

-/-

+/+

+/+

+/+

+/+

+/-

+/-

-/-

-/+

+/-

-/-

+/+

4

-/-

+/+

+/+

+/-

+/-

+/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

5

-/-

+/+

+/+

+/+

+/-

-/-

-/+

+/-

+/-

-/-

-/-

-/+

6

-/-

+/+

+/+

+/+

+/-

-/-

-/-

-/-

-/-

-/-

+/+

-/-

C

1

-/-

+/+

+/+

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

49/59 (83.1)

22/59 (37.3)

6/6 (100.0)

3/6 (50.0)

2

-/-

+/+

+/+

+/-

+/-

+/-

+/-

+/+ D**

+/+

3

-/-

+/+

+/+

+/+

+/+

+/+

+/+D

+/+

4

-/-

+/-

+/+

+/+

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

5

-/-

+/-

+/+

+/+

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

6

-/-

-/-

+/+

+/+

+/+

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

+/-

* : No. of case detected of PCV 2 / PRRSV, -; non detected, +; detected.

** : D=died.

*** : No. of case of the lung detected / No. of total lungs of piglets tested.

바이러스 공격접종한 후 10일이 경과한 시점에 부검을 실시하여 육안으로 폐병변에 대한 검사를 실시하였다. 폐는 좌ㅇ우측 첨엽, 심엽, 횡격막엽 및 복면의 부엽을 100으로 하여 폐렴을 보인 부위를 폐병변지수로 하여 실험군간은 두당 평균폐병변지수로 비교하였다.

백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험(A)군은 총 폐병변지수는 11, 두당 평균폐병변지수는 1.8, 실험(B)군은 총 폐병변지수는 15, 두당 평균폐병변지수는 2.5, 대조군은 총 폐병변지수는 48, 두당 평균폐병변지수는 8.0을 보였다. 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급이한 실험군들은 대조군에 비하여 낮은 폐병변지수를 보였다 (표 13).

PCV 2 및 PRRSV가 접종된 돼지의 폐병변 지수

Group	Piglet No.	Lung lesion index
		Lung lesion(%)	Average lung lesion index
A	1	0	1.8
	2	0
	3	0
	4	3
	5	3
	6	5
B	1	4	2.5
	2	3
	3	0
	4	3
	5	0
	6	5
C	1	8	8.0
	2	10
	3	15
	4	0
	5	10
	6	5

상기 결과들에 의하여, 이유자돈에 있어서 PMWS와 PRDC의 원인체로 알려져 있는 PCV2와 PRRSV의 혼합감염에 대하여 백화사설초,어성초 복합제형이 방어효과가 있다는 것을 확인하였다.

실시예 9: 임신돈과 자돈에 추출물 경구투여 실험

분만전의 임신기 모돈과 태어난 자돈에 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 급여하여 이유시의 자돈과 이유말기의 자돈의 생산두수를 관찰하였고, 이때의 체중과 혈액화학치를 검사하였다.

백화사설초, 어성초추출분말 복합제형을 다음과 같이 경구적으로 투여하였다.실험동물로는 농장에서 사육중인 모돈 8두와 모돈에서 분만한 자돈을 선정하였다.

실험군 ;

모돈; 4두에 분만 2주전부터 모돈 ( 180-230 kg ) ; 5 g /day 경구투여

자돈; 분만된 자돈을 분만 후부터 포유기인 3주까지

자돈(6 kg)에는 0.5 g/ day 을 경구투여 이유 후부터 육성기 전 8주까지는 자돈 (25kg)에는 1 g/ day을 경구투여

대조군 ; 4두의 비투여군

비투여군의 자돈에는 약제를 투여하지 않았다.

실험군에서 자돈의 폐사와 위축돈을 조사하고, 이유시와 이유후에 체중을 측정하였다. 혈액검사를 위하여 이유기와 이유 후에 투여군 10두와 비투여군 10두에서 혈액 10 ml(EDTA 2 ml와 전혈 8ml)를 채혈하여 검사하였다. 돼지의 설사 정도는 (-;정상, +;연변, ++;설사)로 구분하여 매일 검사하였다.

그 결과, 실험군에서 분만한 자돈의 수는 실험군 4두에서는 39두, 대조군에서는 41두가 분만하여 이유두수가 가각 35두와 38두였으며, 이유후인 8주에는 35두(91.4 %)와 38두(92.1 %)가 비육단계로 넘어갔고, 실험에서는 이유두수가 평균 8두 이상이었다.

자돈의 평균체중은 실험군과 대조군에서 각각 이유 시에는 6.1 kg과 6.9 kg이었고, 이유 후에는 23.7 kg과 23.5 kg으로 나타났다. 이유시에 대조군의 체중이 많은 것은 분만시기가 1주정도 빠른 것이 있었다 (표 14).

자돈두수와 이유두수의 체중

	모돈수	자돈			평균체중
		분만두수	이유두수	비육두수	이유전	이유후
투여군	4두	39	35	32(91.4)	6.1	23.7
대조군	4두	41	38	35(92.1)	6.9	23.5

혈액화학치의 검사결과 이유 시에는 PCV와 WBC가 실험군에서 33.5±4.2 %와 10869±2,977 /㎕로 대조군에 비하여 유의성 있게 높았으며, RBC, TP 그리고 섬유소(Fib) 값은 실험군과 대조군 사이에 큰 차이는 없었다. 그리고 이유후의 검사값들도 비슷한 값을 나타내었으나 WBC와 섬유소원의 값은 약간씩 증가하였다 (표 15).

추출물 투여 전후의 혈액학적 수치와 섬유소원의 변화 (Mean±SD)

Group		No. of heads	RBC (104/㎕)	PCV (%)	TP (g/100㎖)	WBC (/㎕)	Fib. (㎎/100㎖)
이유시	투여군	13	522±99	33.5±4.2A	5.2±0.44	10869±2,977A	231±75
	대조군	11	465±58	28.6±3.7a	4.9±0.44	7050±1,997a	291±104
이유후	투여군	15	528±64	31.0±2.3	5.3±0.38	13,733±2,588	347±141
	대조군	11	539±60	31.6±3.0	5.3±0.54	14,018±2249	473±162

A:a,; Significantly differential pairs with same column (P<0.05)

혈청의 AST활성도, ALT활성도, BUN, creatinine 농도와 T bilirubin 농도는 이유전에는 투여군과 대조군 간에 큰 차이없이 비슷한 값을 나타내었으며, 이유후에도 두군간에는 차이가 없었으나 이유초에 비하여 creatinine 값은 증가하였고, BUN 값은 감소되었다 (표 16).

추출물 투여 전후의 혈청의 AST활성도, ALT활성도, BUN, creatinine 농도와 T bilirubin 농도 변화 비교(Mean±SD)

Group		No. of heads	AST (IU/L)	ALT (IU/L)	BUN (㎎/100㎖)	Creatinine (㎎/100㎖)	T bilirubin (㎎/100㎖)
이유전	투여군	13	87 ±35.8	50 ±35.8	7.3±3.14	1.15±0.26	1.40±0.55
	대조군	11	67 ±30.5	44 ±20.8	10.0±4.25	1.17±0.26	1.43±0.68
이유후	투여군	15	80 ±16.8	70 ±28.3	10.2±5.50	1.56±0.52	0.81±0.35
	대조군	11	83 ±48.1	65 ±19.9	12.6±4.751	1.56±0.33	0.70±0.38

상기 결과에서는 백화사설초, 어성초추출분말 복합제형의 급여가 자돈의 생존율이 90 %이상으로 나타난 것으로 설사예방에 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한 혈액화학치 상에서는 큰변화를 나타내지 않은 것으로 보아 본 추출물의 투여가 자돈에 어떠한 독성을 나타내지는 않은 것으로 판단된다.

추출물의 기호성 문제로 자돈의 사료섭취가 일정하지 않아서 사료를 섭취한 자돈은 건강하게 체중도 높게 나타났으나 사료를 거부하는 자돈도 나타나서 일부는 위축돈으로 나타났다. 그러므로 앞으로 기호성의 개선이 요구되어 진다.

본 발명은 식물체 추출물을 함유하는 돼지 설사병 예방용 사료첨가제를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따르면, 재배가 용이하면서도 저렴한 식물의 추출물을 사료첨가제로 사용함으로써, 경제적이면서도 친환경적인 방법으로 돼지의 설사병을 예방할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

1. 백화사설초, 어성초, 고삼, 영지 및 백굴채로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 식물체의 추출물을 함유하는 돼지설사병 예방용 사료첨가제.
2. 제1항에 있어서, 추출물은 20~100% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
3. 백화사설초 추출물 및 어성초 추출물을 함유하는 돼지설사병 예방용 사료첨가제.
4. 제3항에 있어서, 상기 백화사설초 추출물 및 어성초 추출물은 20~100% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
5. 제3항에 있어서, 백화사설초 추출물을 10~50% 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
6. 제3항에 있어서, 어성초 추출물을 10~50% 함유하는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.