CN110623965B - 一种知母皂苷组合物及其在治疗病毒性心肌炎上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种知母皂苷组合物，所述组合物含有知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ和知母皂苷N，其中知母皂苷AⅢ的重量百分含量为22%~34%，知母皂苷BⅡ的重量百分含量为18%~30%，知母皂苷N的重量百分含量为10%~17%，本发明组合物能够明显抑制心肌组织病毒增值，发挥对心肌细胞及组织的保护作用，提高病毒性心肌炎的治疗有效率。

Description

一种知母皂苷组合物及其在治疗病毒性心肌炎上的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种知母皂苷组合物及其在治疗病毒性心肌炎上的应用。

背景技术

心肌炎是由各种各样的病毒、细菌、原虫、立克次体等病原微生物或其他理化因素在感染期间或感染后引起的心肌细胞、心内膜、血管及心外膜的炎症反应。临床上最常见的是病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)，由病毒感染所致的局部性或弥漫性心肌炎症性病变，好发于青壮年，近年来有逐渐升高的趋势。

病毒性心肌炎会导致不同程度的心功能障碍或全身症状，临床表现轻重不一，部分病人几乎无临床症状，预后大多良好，但少数可发生心源性休克，甚至猝死，迁延不愈者，可形成慢性心肌炎或导致心肌病。几乎所有的病毒均可能引起心肌炎，目前已知可引起心肌炎的病毒有20多种，例如艾柯病毒、流感病毒，最常见的是柯萨奇病毒B。由于病毒性心肌炎严重危害人类健康，尤其是青少年的健康，引起了医学界和众多学者的广泛关注，虽然其发病机理尚未完全阐明，但尤其引起的心机损害已被证实，病毒性心肌炎的治疗对于减少扩张型心肌病的发生具有重要意义。

病毒性心肌炎目前没有特异性治疗亦无肯定有效药物，多采用综合疗法，包括抗病毒、保护心肌、免疫调节治疗等。西药对病毒性心肌炎有一定的治疗作用，但常合并骨盆抑制、免疫损伤等严重的毒副作用。目前，中医方面已有学者对病毒性心肌炎病人进行辩证、分型分期后给予中药汤剂资料，实验研究和临床观察证明，单味中药和复方验方在治疗病毒性心肌炎方面有一定效果。例如研究表明，人参和黄芪对治疗心肌炎有疗效，人参的有效成分可降低心肌氧耗量，改善缺氧区，增加心肌供血供氧，并对心肌细胞有保护作用，黄芪则能改善心肌功能，发挥强心苷样作用，改变心肌收缩力。

知母，也叫毛知母，为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides)的根茎，味甘苦，性寒，入肺、胃、肾经。具有清热泻火、滋阴润燥、止渴除烦等功效。知母中富含皂苷类、黄酮类、木质素类等各种成分，且具有很好的药理活性，其中，皂苷及其苷元是其具有广泛药理活性的最主要成分，在根茎含量中约占6％。Changrun Guo等发现知母皂苷BⅡ具有通过抑制高糖诱导的氧化应激中的内皮细胞的抗凋亡作用，并具有用于防止糖尿病的心血管并发症的潜力；韩兵等发现知母总皂苷可以降低血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量并明显缩小动脉斑块面积；李素燕等发现知母皂苷AⅢ在体内外具有明显的抗血栓作用，但不影响体内凝血时间，提示其在抑制凝血过程中可能只影响血小板的聚集、粘附和活化，而对血液中的各种凝血因子和血细胞因子没有影响；Kim等认为知母皂苷B具有阻断细胞炎症因子NF-κB生成的作用，可通过抑制p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)途径实现抗炎作用；刘卓提出知母皂苷可抑制脂多糖引起的巨噬细胞炎症因子TNF-α和NO释放；Ying-guangSun表示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和AⅢ等是EMP抗炎和抗哮喘作用的主要活性成分；UJ Youn等发现知母皂苷AⅢ具有抗病毒活性，但是，目前并没有将知母皂苷用于病毒性心肌炎治疗的报道，也没有相关知母皂苷对病毒性心肌炎的药理作用研究。

发明内容

本发明的目的在于解决上述技术问题，研究知母有效提取部位对心肌细胞的保护及对病毒性心肌炎的治疗作用，为病毒性心肌炎的中药治疗提供新的药物来源。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种知母皂苷组合物，所述组合物含有知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ和知母皂苷N，其中知母皂苷AⅢ的重量百分含量为22％～34％，知母皂苷BⅡ的重量百分含量为18％～30％，知母皂苷N的重量百分含量为10％～17％。

本发明所述知母皂苷AⅢ，分子式为C₃₉H₆₄O₁₃，结构式如下：

本发明所述知母皂苷BⅡ，分子式为C₄₅H₇₆O₁₉，结构式如下：

本发明所述知母皂苷N，分子式为C₄₅H₇₆O₃₀，结构式如下：

作为本发明优选的实施方案，所述知母皂苷AⅢ的重量百分含量为26％～30％，知母皂苷BⅡ的重量百分含量为22％～26％，知母皂苷N的重量百分含量为12％～15％。

作为本发明优选的实施方案，所述知母皂苷AⅢ的重量百分含量为28％，知母皂苷BⅡ的重量百分含量为24％，知母皂苷N的重量百分含量为13％。

由于通常采用的知母皂苷水提或醇提方法直接制备的产物，其中知母皂苷BⅡ的含量普遍高于知母皂苷AⅢ的含量，而知母皂苷N的含量往往低于5％，因此，本发明所述知母皂苷组合物的制备方法，可以是分别提取纯化知母皂苷中的知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和知母皂苷N，然后检测其纯度，添加或不添加辅料，按照重量配比进行混合制备本发明所述的含量范围内的知母皂苷组合物。但是，优选的，可以针对知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和知母皂苷N在不同溶剂中的溶解性能差异以及知母皂苷BⅡ在一定环境下向知母皂苷AⅢ转化的特性，本发明提供了一种优选的所述知母皂苷组合物的制备方法，步骤如下：

(1)知母总皂苷的提取：取知母药材，以6～10倍量70％乙醇回流提取2次，第一次2h，第二次1.5h，合并醇提液，减压浓缩至相对密度为1.25～1.35的浓缩液；

(2)知母皂苷BⅡ的提取：取一半体积的步骤(1)所得浓缩液，将HP20吸附树脂装柱，浓缩液过滤后上样，用水洗除杂质，然后用3BV的50％乙醇洗脱，收集洗脱液回收乙醇，然后将得到的液体用SP825大孔树脂柱上样，4BV的50％乙醇洗脱，收集洗脱液回收乙醇，浓缩后得到相对密度为1.25～1.35的浓缩液，喷雾干燥得到知母皂苷BⅡ粉末；

(3)知母皂苷AⅢ的制备：取60％～65％重量的步骤(2)所得知母皂苷BⅡ粉末，加入pH4.8的无水乙酸-醋酸缓冲液，搅拌均匀后加热至53℃并加入β-葡萄糖苷酶，反应2h，产物用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收溶剂得到知母皂苷AⅢ粉末；

(4)知母皂苷N的提取：取剩余的步骤(1)所得浓缩液，将HPD100大孔树脂装柱，浓缩液过滤后滤液上样，6BV的水洗脱除杂，然后用6BV的40％乙醇洗脱除杂，用6BV的60％乙醇洗脱下柱，洗脱液回收乙醇后，溶解于水，通入ODS柱，用40％丙酮洗脱，收集洗脱液，回收丙酮，浓缩干燥得到知母皂苷N粉末；

(5)皂苷组合物的制备：将步骤(2)所得知母皂苷BⅡ粉末、步骤(3)所得知母皂苷AⅢ粉末和步骤(4)所得知母皂苷N粉末，以及填充剂按照1.70～1.75:1.90～1.95:1:2进行混合，得到知母皂苷组合物。

上述制备方法可获得知母皂苷AⅢ重量百分含量为22％～34％，知母皂苷BⅡ重量百分含量为18％～30％，知母皂苷N重量百分含量为10％～17％的知母皂苷组合物。并且该方法节约药材资源，步骤设计合理，简化操作步骤。

本发明所述知母皂苷组合物用于制备治疗病毒性心肌炎的药物。所述治疗病毒性心肌炎药物包括药物赋形剂或载体与治疗有效量的知母皂苷组合物，所述治疗病毒性心肌炎药物的制剂形式为固体制剂，例如片剂、胶囊剂、丸剂等。

作为本发明优选的实施方案，所述治疗有效量为以总皂苷含量计5～20mg/kg·d。

综上，与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明申请人研究发现，单独使用知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ对病毒性心肌炎的治疗效果极弱，体外和大鼠体内CVB3病毒感染试验表明，知母皂苷AⅢ虽然有一定抗病毒作用，知母皂苷BⅡ虽有一定的抗炎作用，但两者单独使用对心肌细胞的保护作用均较弱，而在通常提取的知母皂苷组合物中，知母皂苷BⅡ的含量高于知母皂苷AⅢ，这种知母皂苷组合物对病毒性心肌炎的保护和治疗作用并不明显，但意外的，在含有较高知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ含量的情况下，10％以上的知母皂苷N能够起到良好的协同作用，极大的提高知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ保护心肌的药物活性，三者在一定含量配比下能够明显抑制病毒增值，发挥对心肌细胞及组织的保护作用，临床研究表明，在常规治疗手段下结合本发明的知母皂苷组合物，能够提高病毒性心肌炎的治疗有效率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

一、知母皂苷组合物的制备

实施例1

(1)取知母药材，以10倍量70％乙醇回流提取3次，分别提取2h、1.5h和1h，合并提取液浓缩至相对密度为1.15，正丁醇萃取后，正丁醇部分过滤后浓缩成浸膏，上D101大孔树脂，以4BV的50％乙醇洗脱，收集洗脱液经反相ODS柱层析，产物浓缩干燥后粉碎，得到知母皂苷AⅢ粉末，测定知母皂苷AⅢ的纯度为95.4％；

(2)取知母药材，以10倍量70％乙醇回流提取3次，分别提取2h、1.5h和1h，合并提取液过滤后浓缩成浸膏，上HPD100大孔树脂，水和20％乙醇依次洗脱除杂，5BV的50％乙醇洗脱，洗脱液收集后浓缩成浸膏，上HPD400大孔树脂，4BV的45％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩后干燥，得到知母皂苷BⅡ的纯度为90.7％；

(3)取知母药材，以10倍量70％乙醇回流提取3次，分别提取2h、1.5h和1h，合并提取液过滤后浓缩成浸膏，将ADS-17树脂装柱，浓缩液过滤后滤液上样，6BV的水洗脱除杂，然后用6BV的60％乙醇洗脱下柱，洗脱液回收乙醇后，溶解于水，通入ODS柱，用40％甲醇洗脱，收集洗脱液，回收甲醇，浓缩干燥得到知母皂苷N粉末，检测其纯度为92.4％；

(4)取知母皂苷AⅢ粉末31g，知母皂苷BⅡ粉末25g、知母皂苷N粉末14g以及填充剂乳糖30g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为29.6％，知母皂苷BⅡ含量为22.7％，知母皂苷N含量为12.9％。

实施例2

(1)知母总皂苷的提取：取知母药材，以8倍量70％乙醇回流提取2次，第一次2h，第二次1.5h，合并醇提液，减压浓缩至相对密度为1.28的浓缩液；

(2)知母皂苷BⅡ的提取：取1/2体积的步骤(1)所得浓缩液，将HP20吸附树脂装柱，浓缩液过滤后上样，用水洗除杂质，然后用3BV的50％乙醇洗脱，收集洗脱液回收乙醇，然后将得到的液体用SP825大孔树脂柱上样，4BV的50％乙醇洗脱，收集洗脱液回收乙醇，浓缩后得到相对密度为1.32的浓缩液，喷雾干燥得到知母皂苷BⅡ粉末，检测其纯度为94.3％；

(3)知母皂苷AⅢ的制备：取65％重量的步骤(2)所得知母皂苷BⅡ粉末，加入pH4.8的无水乙酸-醋酸缓冲液，搅拌均匀后加热至53℃并加入β-葡萄糖苷酶，反应2h，产物用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收溶剂得到知母皂苷AⅢ粉末，测定知母皂苷AⅢ的纯度为96.6％；

(4)知母皂苷N的提取：取剩余的步骤(1)所得浓缩液，将HPD100大孔树脂装柱，浓缩液过滤后滤液上样，6BV的水洗脱除杂，然后用6BV的40％乙醇洗脱除杂，用6BV的60％乙醇洗脱下柱，洗脱液回收乙醇后，溶解于水，通入ODS柱，用40％丙酮洗脱，收集洗脱液，回收丙酮，浓缩干燥得到知母皂苷N粉末，检测其纯度为92.3％；

(5)皂苷组合物的制备：将步骤(2)所得知母皂苷BⅡ粉末26g、步骤(3)所得知母皂苷AⅢ粉末29g、步骤(4)所得知母皂苷N粉末15g以及填充剂乳糖30g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其知母皂苷AⅢ的含量为28.0％，知母皂苷BⅡ的含量为24.5％，知母皂苷N的含量为13.8％。

实施例3

将实施例1制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末28g，知母皂苷BⅡ粉末28g、知母皂苷N粉末16g以及填充剂乳糖28g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为26.7％，知母皂苷BⅡ含量为25.4％，知母皂苷N含量为14.7％。

实施例4

将实施例1制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末24g，知母皂苷BⅡ粉末33g、知母皂苷N粉末11g以及填充剂乳糖32g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为22.9％，知母皂苷BⅡ含量为29.9％，知母皂苷N含量为10.1％。

实施例5

将实施例2制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末35g，知母皂苷BⅡ粉末28g、知母皂苷N粉末18g以及填充剂乳糖19g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为33.8％，知母皂苷BⅡ含量为18.8％，知母皂苷N含量为16.6％。

对比例1

将实施例1制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末13g，知母皂苷BⅡ粉末39g、知母皂苷N粉末1.5g以及填充剂乳糖46.5g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为12.4％，知母皂苷BⅡ含量为35.3％，知母皂苷N含量为1.39％。

对比例2

将实施例2制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末19g，知母皂苷BⅡ粉末27g、知母皂苷N粉末13g以及填充剂乳糖41g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为18.3％，知母皂苷BⅡ含量为25.4％，知母皂苷N含量为11.9％。

对比例3

将实施例2制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末47g，知母皂苷BⅡ粉末15g、知母皂苷N粉末15g以及填充剂乳糖23g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为45.4％，知母皂苷BⅡ含量为14.1％，知母皂苷N含量为13.8％。

对比例4

将实施例2制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末25g，知母皂苷BⅡ粉末40g、知母皂苷N粉末21g以及填充剂乳糖14g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为24.1％，知母皂苷BⅡ含量为37.7％，知母皂苷N含量为19.4％。

对比例5

将实施例2制备的知母皂苷，按照知母皂苷AⅢ粉末39g，知母皂苷BⅡ粉末16g、知母皂苷N粉末27g以及填充剂乳糖18g混合均匀，得到知母皂苷组合物，检测其中知母皂苷AⅢ含量为37.6％，知母皂苷BⅡ含量为15.1％，知母皂苷N含量为24.9％。

二、知母皂苷对CVB3感染大鼠心肌细胞的保护作用研究(体外实验)

(一)试验分组及试验样品

取出生1-3d的SD大鼠胎鼠共20只，取出其心脏，培养全心脏心肌细胞，使用市售Hela细胞进行培养并冻存，进行体外抗CVB3病毒试验，试验共设17组，分别为正常细胞组、病毒对照组、空白辅料组、阳性对照组和A-M组，以观察不同的知母皂苷以及知母皂苷组合物对大鼠心肌细胞的体外保护作用，各试验组测试样品情况见表1。

表1各试验组试验样品情况

上述试验组中，α-干扰素和乳糖均为市售，A-M组所用知母皂苷或其组合物均为自制。在上述实施例及对比例中，皂苷组合物是将制备的皂苷与辅料乳糖混合配制，但实际运用中，可以与其他任何常用的惰性辅料如淀粉、纤维素、甘露醇等混合配制，只要该辅料对心肌细胞不产生药理作用即可。

(二)试验方法

1.细胞的培养

1.1全心肌细胞培养

使用出生1-3天的SD大鼠培20只，75％酒精消毒胸部，取出心脏，放入4℃预冷的D-HANK’S缓冲液中，除去血液后置于培养皿中，加入D-HANK’S缓冲液，将心脏剪成1mm³大小的组织块，然后将组织块置于含有15ml 0.1％胰蛋白酶(以D-HANK’S缓冲液配制)的烧瓶中，37℃水浴消化20分钟，静置后吸取上清液，加入15ml 0.1％胰蛋白酶(以D-HANK’S缓冲液配制)消化15分钟，反复消化7次，收集上清液，加入含20％FBS的MEM培养液终止消化，贴壁培养1小时，去除成纤维细胞，收集心肌细胞悬液，胎盘蓝染色计数，调整细胞密度为5×10⁵/ml，接种24孔细胞培养板，每孔1ml，另接种96孔细胞培养板，每孔100ul，将接种好心肌细胞的培养板在5％二氧化碳、37℃培养箱内培养24小时，换液后继续培养24小时。

1.2 Hela细胞培养方法

(1)细胞传代：倾去Hela细胞培养瓶中的培养液，加入0.1％胰蛋白酶，待细胞圆缩后，用滴管吹吸使脱离贴壁，转移至离心管后，800rpm离心5分钟，弃去上清液，加入20％FBS的DMEM培养液，吹吸均匀后，接种到培养瓶中。

(2)细胞冻存：取贴壁良好，生长良好的细胞，倾去原培养液，加入0.1％胰蛋白酶，待细胞圆缩后，用滴管吹吸使脱离贴壁，转移至离心管后，1000rpm离心3分钟，弃去上清液，保存于-80℃冰箱中。

(3)细胞复苏：取出冻存管，投入37℃温水中晃动至溶解，转移至离心管，加入10ml培养液，混匀后1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入20ml培养液，混匀，转移至培养瓶内。

2.知母皂苷细胞毒性测定

将试验例A-M组的知母皂苷用1％DMSO助溶配制成体外实验用溶液，将溶液离心取上清液，微孔滤膜过滤，除菌后，用20％FBS的MEM培养液将其稀释成11个浓度，加入到培养了单层心肌细胞的96孔中，培养板于37℃，5％二氧化碳孵箱培养5d，以细胞病变(CPE)法测定最大无毒浓度(TD₀)。结果为各试验组知母皂苷的TD₀在43.5～87.3mg/mL。

3.CVB3病毒毒力测定

用无血清培养基将病毒连续10倍稀释，分别为10^-1-10^-8稀释度，之后接种于已培养单层心肌细胞的96孔板上，37℃，5％二氧化碳孵箱培养1小时，弃去病毒液，用Hank’s液洗三次后加入细胞培养液，放回孵箱培养，定时更换细胞培养液，观察CPE，以细胞病变达“++”以上为阳性，以最高稀释度不再出现CPE时为终点。用Reed-Muench法计算TCID₅₀；距离比＝(＞50％病变率-50％)/(＞50％病变率-＜50％病变率)；LgTCID₅₀＝大于50％的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数选择100TCID₅₀作为真实试验的接种浓度。经计算本试验使用的柯萨奇B3病毒的TCID₅₀为3.51，即能够使50％细胞发生CPE的病毒浓度是10^3.51/ml。

4.知母皂苷对心肌细胞的保护作用研究

按照上表表1的设定，在培养48h后已成规律搏动的心肌细胞中加入病毒稀释液0.5mL100TCID₅₀，作用1h后，A-M组加入不同的药物溶液0.5ml继续培养，所述药物溶液是将A-M组的皂苷物用含20％FBS的MEM培养液稀释而成的总皂苷浓度为0.05g/ml的溶液，正常细胞组只加入培养液，病毒对照组仅加入病毒，空白辅料组加入病毒和20％FBS的MEM培养液制备的0.05g/ml乳糖溶液0.5ml，阳性对照组加入病毒和280u/ulα-干扰素0.5ml，分别于第2、5d，在倒置显微镜下测定每孔细胞搏动速率，并在第2、5d收集各组的细胞及培养液，反复冻融使释放病毒颗粒，离心后去上清液，稀释后的病毒液接种于培养好的Hela细胞96孔板上，测定各组TCID₅₀，数据采用SPSS13.0医学统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素的方差分析，两两比较采用LSD分析方法，结果见表2和表3。

表2知母皂苷对CVB3感染的心肌细胞搏动速率影响(n＝10)

试验组	给药量(0.5ml)	2d搏动速率/min	5d搏动速率/min
				正常细胞组	/	134.2±4.254	113.8±2.117
病毒对照组	/	76.45±1.547	0
				空白辅料组	0.05g/ml	78.63±2.345	0
阳性对照组	250u/ul	97.45±1.325	96.29±2.481*<sup>#</sup>
				A组	0.05g/ml	72.41±3.547	56.72±3.257*
B组	0.05g/ml	80.87±1.545	0
				C组	0.05g/ml	71.54±1.842	0
D组(实施例1)	0.05g/ml	97.54±2.455	86.44±1.942*<sup>#</sup>
				E组(实施例2)	0.05g/ml	96.37±2.314	95.67±1.487*<sup>#</sup>
F组(实施例3)	0.05g/ml	94.16±3.697	88.87±2.541*<sup>#</sup>
				G组(实施例4)	0.05g/ml	89.24±4.632	78.45±1.974*<sup>#</sup>
H组(实施例5)	0.05g/ml	85.14±3.422	80.33±2.317*<sup>#</sup>
				I组(对比例1)	0.05g/ml	68.66±1.954	32.15±1.652*
J组(对比例2)	0.05g/ml	62.18±1.366	36.84±3.478*
				K组(对比例3)	0.05g/ml	74.54±2.145	60.24±2.487*
L组(对比例4)	0.05g/ml	65.87±3.122	42.21±2.698*
				M组(对比例5)	0.05g/ml	78.45±2.647	39.15±1.354*

与病毒对照组相比，*：P＜0.05，D-H组和A组相比，#：P＜0.05。

表3知母皂苷干预后对心肌细胞TCID₅₀影响(n＝10)

与病毒对照组相比，*：P＜0.05，D-H组和A组相比，#：P＜0.05。

结果表明，病毒对照组在2d后可见细胞团缩和变圆，心肌细胞波动速率降低，5d细胞死亡，单独使用知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ和知母皂苷N处理以及采用I-M组的知母皂苷组合物处理，知母皂苷BⅡ和知母皂苷N与病毒对照组的结果没有显著差异，5d后细胞死亡，但知母皂苷AⅢ有一定保护作用，而采用实施例1-5制备的知母皂苷组合物与α-干扰素一样发挥了保护作用，5d时，心肌细胞波动明显，且这种作用与单独使用知母皂苷AⅢ相比具有显著差异；细胞在感染CVB3 2d时，α干扰素组能降低病毒滴度至0，A组、K组和L组虽然能降低病毒滴度，但作用并不十分显著，而D-H组则能显著降低病毒滴度，5d时，仅有A组、D-H组和L组能降低病毒滴度，但D-H组效果更为显著。

三、知母皂苷对CVB3感染的Balb/C小鼠心肌炎的治疗作用研究

(一)前期处理

通过空斑形成试验测定病毒的滴度，将Hela细胞(8×10⁵个/孔)接种于六孔板中，37℃孵育24h后细胞融合率达到90％，用PBS洗2次，感染梯度稀释的各组CVB3病毒，体积为200ul，37℃感染1h，用PBS清洗去除病毒上清，加入2ml琼脂-MEM培养基(2×MEM：1.5％琼脂＝1:1)。72h后，用卡洛氏固定液固定30min，然后1％结晶紫染色，利用空斑数计算病毒滴度，然后将该病毒滴度以10倍倍比稀释为8个滴度，分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，病毒用DMEM稀释，小鼠腹腔接种0.3mlCVB3病毒，应用Reed-Muench方法统计结果，计算该病毒的LD₅₀为2.7×10⁹PFU。对A组、E组、F组和L组药物进行急毒实验，确定安全给药剂量。

(二)试验方法

采用4周龄纯系雄性Balb/c小鼠150只，随机分为15组，每组10只，试验设空白对照组、病毒对照组、阳性对照组，以及A组、E组、F组和L组药物高中低各3个剂量组，病毒对照组为每只小鼠腹腔注射0.3ml滴度为9×10⁹PFU/ml的CVB3病毒液而不给药，0.5小时后每日灌胃0.3ml生理盐水，空白对照组为正常对照小鼠不接种病毒，每日灌胃0.3ml生理盐水，阳性对照组为腹腔注射同等量的病毒液0.5小时后每日腹腔注射α干扰素10⁴IU/g体重，一次/d，连用7d，其余组全部腹腔注射与病毒对照组等量的病毒液，灌胃受试药物，其中A组、E组、F组和L组灌胃药液浓度(药液以水配置)为低剂量组2.4mg/ml，中剂量组为4.8mg/ml，高剂量组为9.6mg/ml，试验周期为2周。试验期统计各组小鼠死亡情况，分别在7d和14d，取出大鼠心脏，PBS液冲洗，沿左室长轴分为两部分，一半用10％中性甲醛固定，做HE染色，观察心肌组织病理变化情况，并进行心脏病理变化积分，无病变计为0分，病变面积<25％计1分，25-50％计2分，51-75％计3分，>75％计4分；另一半心肌用于检测病毒滴度，具体方法为将心肌组织反复冻溶3次，用Hank’s液作连续1稀释10^-1至10^-8倍比稀释，接种于长层单层Hela细胞的微量细胞培养板上，37℃吸附1小时，吸弃病毒液，Hank’s液洗一次，用10％小牛血清的MEM培养基培养5天，以Reed-Mueneh法计算心肌病毒滴度TCID₅₀。结果见表4和表5。

表4各试验组小鼠心肌组织病理积分

与病毒对照组相比，*：P＜0.05，E和F组和A组同等剂量相比，#：P＜0.05。

表5各试验组小鼠心肌组织病毒滴度(TCID₅₀)结果

试验组	7d	14d
			空白对照组	0	0
病毒对照组	2.57±0.18	3.48±0.02
			阳性对照组	1.02±0.51*	0.98±0.43*
A组高剂量	2.04±0.09	2.16±0.05*
			A组中剂量	2.18±0.04	2.26±0.18*
A组低剂量	2.22±0.15	2.33±0.16
			E组(实施例2)高剂量	1.03±0.14*<sup>#</sup>	1.14±0.07*<sup>#</sup>
E组(实施例2)中剂量	1.28±0.07*<sup>#</sup>	1.38±0.09*<sup>#</sup>
			E组(实施例2)低剂量	1.32±0.18*<sup>#</sup>	1.42±0.21*<sup>#</sup>
F组(实施例3)高剂量	1.19±0.15*<sup>#</sup>	1.25±0.33*<sup>#</sup>
			F组(实施例3)中剂量	1.28±0.07*<sup>#</sup>	1.34±0.07*<sup>#</sup>
F组(实施例3)低剂量	1.33±0.12*<sup>#</sup>	1.40±0.05*<sup>#</sup>
			L组(对比例4)高剂量	2.02±0.16	2.26±0.19*
L组(对比例4)中剂量	2.58±0.18	2.88±0.24
			L组(对比例4)低剂量	2.86±0.19	3.14±0.13

与病毒对照组相比，*：P＜0.05，E和F组和A组同等剂量相比，#：P＜0.05。

结果表明，E组和F组高中低三个剂量组的知母皂苷组合物均能显著降低病毒滴度(TCID₅₀)，抑制病毒增值和保护心肌细胞免受病毒破坏，A组和L组采用单独的知母皂苷AⅢ和其他配比的皂苷组合物对大鼠的心肌细胞保护作用则较弱，而E组和F组将知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ和知母皂苷N以一定比例配合的组合物在高中低三种剂量下均能明显提高皂苷组合物对心肌细胞的保护能力，表明三者的联合使用起到意料之外的协同作用，对CVB3介导的病毒性心肌损伤发挥了意想不到的作用。

实施例6

胶囊制备

将实施例2制备的知母皂苷BⅡ粉末260g、知母皂苷AⅢ粉末290g、知母皂苷N粉末150g以及填充剂淀粉180g，微晶纤维素70g混合均匀，得到混粉，取50g羟丙甲纤维素配制成5％的水溶液，加至混粉中，搅拌制粒，干燥后以0.20g/粒装入胶囊壳中，得到知母皂苷胶囊，检测其知母皂苷AⅢ的含量为28.2％，知母皂苷BⅡ的含量为24.3％，知母皂苷N的含量为13.2％。

四、知母皂苷组合物临床治疗作用研究

选取来某院就诊的病毒性心肌炎患者96例，随机分为知母皂苷组和对照组各48例，知母皂苷组男25例，女23例，年龄32-48岁，病程12d-10个月，对照组男20例女28例，年龄30-50岁，病程9d-12个月。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义，具有可比性。

病例纳入标准复合病毒性心肌炎诊断标准，并排除了过敏或特异性体质者，对本研究用药不耐受者，合并严重心血管、肝等原发性疾病者等。

对照组采用常规治疗，包括对症治疗、抗病毒治疗等，知母皂苷组在常规治疗的基础上，加用实施例6制备的知母皂苷组合物胶囊，每日3次，每次2粒，两组患者均治疗1个月。

疗效判定标准：无临床症状，行心电图等检查显示无异常为显效；临床症状明显好转，行心电图等检查基本恢复为有效；上述指标均未达到或恶化为无效，有效率＝(显效+有效)/n×100％。结果见表6。

表6两组病毒性心肌炎患者临床疗效比较

组别	n(例)	显效(例)	有效(例)	无效(例)	有效率(％)
						对照组	48	15	22	11	77.08
知母皂苷组	48	24	19	5	89.58

Claims (4)

1.一种用于治疗病毒性心肌炎的药物组合物，其特征在于药物组合物的有效成分为知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ和知母皂苷N，药物组合物中知母皂苷AⅢ的重量百分含量为22%~34%，知母皂苷BⅡ的重量百分含量为18%~30%，知母皂苷N的重量百分含量为10%~17%。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述知母皂苷AⅢ的重量百分含量为26%~30%，知母皂苷BⅡ的重量百分含量为22%~26%，知母皂苷N的重量百分含量为12%~15%。

3.根据权利要求1所述的一种用于治疗病毒性心肌炎的药物组合物，其特征在于所述知母皂苷AⅢ的重量百分含量为28%，知母皂苷BⅡ的重量百分含量为24%，知母皂苷N的重量百分含量为13%。

4.根据权利要求1所述的一种用于治疗病毒性心肌炎的药物组合物，其特征在于所述知母皂苷组合物的制备方法如下：

（1）知母总皂苷的提取：取知母药材，以6~10倍量70%乙醇回流提取2次，第一次2h，第二次1.5h，合并醇提液，减压浓缩至相对密度为1.25~1.35的浓缩液；

（2）知母皂苷BⅡ的提取：取一半体积的步骤（1）所得浓缩液，将HP20吸附树脂装柱，浓缩液过滤后上样，用水洗除杂质，然后用3BV的50%乙醇洗脱，收集洗脱液回收乙醇，然后将得到的液体用SP825大孔树脂柱上样，4BV的50%乙醇洗脱，收集洗脱液回收乙醇，浓缩后得到相对密度为1.25~1.35的浓缩液，喷雾干燥得到知母皂苷BⅡ粉末；

（3）知母皂苷AⅢ的制备：取60%~65%重量的步骤（2）所得知母皂苷BⅡ粉末，加入pH4.8的无水乙酸-醋酸缓冲液，搅拌均匀后加热至53℃并加入β-葡萄糖苷酶，反应2h，产物用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，回收溶剂得到知母皂苷AⅢ粉末；

（4）知母皂苷N的提取：取剩余的步骤（1）所得浓缩液，将HPD100大孔树脂装柱，浓缩液过滤后滤液上样，6BV的水洗脱除杂，然后用6BV的40%乙醇洗脱除杂，用6BV的60%乙醇洗脱下柱，洗脱液回收乙醇后，溶解于水，通入ODS柱，用40%丙酮洗脱，收集洗脱液，回收丙酮，浓缩干燥得到知母皂苷N粉末；

（5）皂苷组合物的制备：将步骤（2）所得知母皂苷BⅡ粉末、步骤（3）所得知母皂苷AⅢ粉末和步骤（4）所得知母皂苷N粉末混合均匀，得到知母皂苷组合物。