CN1981776B

CN1981776B - 含稀有人参皂甙的组合物及其制备方法以及用途

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Publication number: CN1981776B
Application number: CN2005100486947A
Authority: CN
Inventors: 刘学系; 韩颖; 王曙彩; 王娟; 陈锡强; 高心湘
Original assignee: Weitaier Health Science And Technology Co Ltd Kunming
Current assignee: Weitaier Health Science And Technology Co Ltd Kunming
Priority date: 2005-12-15
Filing date: 2005-12-15
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2025-12-15
Also published as: CN1981776A

Abstract

本发明涉及一种含有稀有人参皂甙-Rh₂和-Rg₃的组合物，这种组合物的应用及其制备工艺。本发明所述的含稀有人参皂甙的组合物为组合物中人参皂甙Rh₂和Rg₃的总含量为重量百分比5％～49.9％，人参皂甙Rh₂与Rg₃两组分间的相对重量比例人参皂甙Rh₂∶人参皂甙Rg₃为1∶0.1～8。上述组合物可用于神经细胞损伤性疾病的预防、治疗和辅助治疗，心脑血管疾病的预防、治疗和辅助治疗、实体性恶性肿瘤的预防、治疗和辅助治疗，以及抗衰老、抗疲劳等。可以制成药物或功能性食品，如散剂、颗粒剂、胶囊剂、缓释和控释胶囊剂、素片和包衣片、缓释和控释片、分散片、口含片、口服液等。

Description

含稀有人参皂甙的组合物及其制备方法以及用途

技术领域

本发明涉及一种含有稀有人参皂甙-Rh₂和-Rg₃的组合物，这种组合物的应用及其制备工艺。

背景技术

五加科(araliaceae)人参属(Panax)植物，如人参(P.ginseng)、西洋参(P.quenquefolinus)、三七(P.notoginseng)、竹节参(P.uaponicus)，葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Thrunb Mak)等均为我国习用药用植物，其主要有效成分为人参皂甙。目前已发现的人参皂甙有42种，分为三种类型：人参二醇甙，人参三醇甙，齐墩果酸皂甙。各组中甙元均相同，而糖链有所不同。

人参二醇甙组中的稀有人参皂甙Rh₂和Rg₃均为日本学者北川勋于1983年由红参中分离得到的微量组分。

前此的大量实验研究已经证实，人参皂甙-Rh₂可诱导肿瘤细胞的逆向转化，从而使增殖的癌细胞逆转为正常细胞(Chemical studies on crude drugsI[J].Yakugaku Zasshi 1983，103(6)：612-62)。试验研究表明，人参皂甙Rh₂对培养的小鼠肺癌细胞、大鼠Morris肝癌细胞及小鼠B16黑色素瘤细胞具有明显的特异性抑制作用，表现为黑色素生成能力明显增加；形态向正常上皮细胞分化；细胞呈网状结构；黑色素颗粒增多；生成变缓慢。细胞动力学研究结果表明，人参皂甙Rh₂可使B16黑色素瘤细胞阻断在G1期，药物作用后，G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少，进一步说明人参皂甙Rh₂对B16黑色素瘤细胞具有分化诱导作用(药学学报，1996，31(10)：742-745.)。此外，人参皂苷Rh₂可以改善局部缺血导致的脑损伤(Biol Pharm Bull.2004 Mar；27(3)：433-6.)，并有细胞膜稳定作用，对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO和PGE2具有抑制作用(Biol PharmBull.2003，26(11).-1581～1584)。

人参皂甙Rg₃具有选择性地抑制肿瘤细胞浸润和转移的作用。人参皂甙Rg₃可促进NO的生成，阻碍肿瘤细胞对纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的粘附，抑制血管内皮细胞的增殖和肿瘤新生血管的形成，降低细胞内C²⁺浓度，破坏其在血管壁的着床和进入浸润血管内壁，特别是能抑制细胞生长因子和血管内皮生产因子的产生与表达。从而起到抑制肿瘤生长、扩散和转移的作用(中国中西医结合外科杂志，2001，7(4)：289-290.)。高勇等人利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)观察人参皂甙Rg₃作用后肿瘤新生血管的生长状况，结果表明：人参皂甙Rg₃可明显抑制Lewis肺癌的生长，同时人参皂甙Rg₃具有与苏拉明类似的抗新生血管作用(第二军医大学学报，2001，22(1)：40-42.)。人参皂苷Rg₃可以逆转酒精和东莨菪碱所致记忆功能紊乱(Arch Pharm Res.2005 Mar；28(3)：335-42.)；拮抗NMDA受体，对缺血和谷氨酸所致脑细胞坏死有明显改善作用(Neurochem Res.2004Dec，29(12)：2257-66.)，对脑细胞Na⁺通道有电压依赖性和剂量依赖性的可逆抑制作用。人参皂苷Rg₃对家兔基底动脉平滑肌有明显的舒张作用，且呈剂量依赖性，其机理可能与血管平滑肌细胞上的钙通道和钙激活的钾通道有关，而与内皮细胞的功能无关。

上述药理实验研究结果表明，人参皂甙Rh₂和Rg₃具有多方面很高的生物活性。但迄今尚未见含有人参皂甙Rh₂和Rg₃的组合物药用和/或作功能性食品应用的公开资料。

人参皂甙Rh₂和Rg₃为人参属植物中的痕量成分，在原植物中含量很低或几乎不能检出。如人参皂甙Rh₂在红参中含量仅为十万分之一，在白参中几乎不存在。人参皂甙Rg₃在红参(晒干或蒸制后)中含量也仅有十万分之三左右。

近年来，国内外研究者一直在探寻批量生产人参皂甙Rh₂和Rg₃的工艺技术，并已取得了一些进展。目前已公开的生产人参皂甙Rh₂或Rg₃的工艺路线主要有：

1、半合成法制取人参皂甙Rh₂

前苏联学者提出了两个半合成法制备人参皂甙Rh₂的方法，一条路线为用人参三醇和乙酰溴代葡萄糖缩合合成人参皂甙Rh₂。但选择性较差，混合物难以分离。另一条路线则采用从桦树叶分得的白桦烯三醇为原料，通过五步区域选择性和立体选择性反应合成人参皂甙-Rh₂(中国药物化学杂志，1992，2(1)：64-70)。1995年韩国专利申请公告95-7250则公开了首先用强碱的醇溶液水解人参叶和/或根茎的干燥粉末，得到20(S)-Rh₂甙元，然后再在碳酸银等催化剂存在下与葡萄糖缩合制备20(S)-Rh₂的方法。上述方法反应步骤繁琐，经济上也不实用。

2、碱水解法制取人参皂甙Rh₂

1992年，宋长春等人报导，利用西洋参茎叶总皂甙为起始材料，经用20％的NaOH水解后，经纯化得到20(S)-人参皂甙Rh₂，回收率1.42％(中国药学杂志，27(1)：6，1992)。而韩国人参烟草研究所1994年公开了一种从人参组分中制备制备20(R)-人参皂甙Rh₂的方法，其特征在于首先用酸水解人参皂甙原人参二醇组分，再经乙酰化及水解处理得到20(S&R)-人参皂甙Rg₃，再用碱水解得到20(S&R)-人参皂甙Rh₂(韩国专利申请公告94-8291)。另一项专利申请公开了用酸水解原人参二醇组分(系列)单体皂甙制得Rg₃，然后乙酰化处理并用半制备HPLC法分离得到20(S)-人参皂甙Rh₂的方法。CN1225366A，1999-8-11；CN1293198A，2001-05-02；CN1352977A，2002-06-12也分别公开了以人参二醇组皂甙为起始材料，用强碱水解法制备人参皂甙Rh₂的方法。上述方法收率在1.42～5.6％之间。

3、酶水解法制备人参皂甙Rh₂

CN1229086A，1999-09-22公开了一种用皂甙β-葡萄糖苷酶等皂甙酶制取人参皂甙Rh₁、Rh₂等的方法。该法用自微生物中分离纯化的皂甙酶水解人参皂甙Rg₃得到Rh₂，水解人参皂甙Re得到Rg₁，水解人参皂甙Rg₂得到Rh₁。并称可水解人参混合皂甙，使其中的稀有抗癌皂甙Rh₂、Rh₁含量增加几百倍。酶法水解有较好的定向性，但皂甙酶本身需要提取纯化，成本较高。就收率而言，按专利说明书中所声称稀有人参皂甙含量提高了几百倍计，人参皂甙Rh₂在其混合皂甙中的理论含量也仅能达到5％以下。

4、酸水解法制取人参皂甙Rg₃。

1991年，日本学者发现动物胃液和盐酸可使人参皂甙Rb₂部分地水解为人参皂甙Rg₃(Chem Pharm Bull(Tokyo).1991 Feb；39(2)：400-4.)。在国内，2002年，CN1092204C，2002-10-09公开了一种20(S)-人参皂甙Rg₃的半合成工艺，首先用乙酸乙酯与正丁醇萃取人参总皂甙分离出人参皂甙二醇组，再用盐酸的醇溶液对人参皂甙二醇组进行水解，制取20(S)-人参皂甙Rg₃。该法需用有机溶剂萃取人参皂甙二醇组作为水解起始材料，并需在有机溶剂系中进行水解，工艺仍较为繁复，有机溶剂用量大，回收困难，且仅能获得20(S)-人参皂甙Rg₃，收率仅能达到5～7％。2003年，CN1417225A，2003-05-14公开了一种由人参皂甙直接酸水解制备人参皂甙Rg₃的方法，以纯度人参皂甙≥90％，不含有三醇型皂甙的人参二醇型皂甙，在含有保护剂的有机溶剂酸溶液中、惰性气体保护下进行水解，制备人参皂甙Rg₃。

上述方法均可以分别获得人参皂甙Rh₂或Rg₃，但大多对半合成或水解条件有比较严格的要求，如要求以人参二醇甙甚至单体皂甙为水解起始原料，或/和须在有机溶剂系中水解，或/和须添加保护剂，或/和须使用保护气体等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有预防和治疗神经细胞损伤性疾病、心脑血管疾病、恶性肿瘤及抗衰老、抗疲劳功能的含有特定比例的稀有人参皂甙Rh₂和Rg₃的组合物。

本发明的另一目的在于提供这种组合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供这种组合物的用途。

本发明所述的含稀有人参皂甙的组合物为组合物中人参皂甙Rh₂和Rg₃的总含量为重量百分比5％～49.9％，人参皂甙Rh₂与Rg₃两组分间的相对重量比例人参皂甙Rh₂∶人参皂甙Rg₃为1∶0.1～8。

上述组合物中更佳的范围为：组合物中人参皂甙Rh₂和Rg₃的总含量为重量百分比20％～49.9％，人参皂甙Rh₂与Rg₃两组分间的相对重量比例人参皂甙Rh₂∶人参皂甙Rg₃为1∶0.1～8。

在上述组合物中，剩余成分为Rh₂和Rg₃自然带如的成分。

本发明所述的含稀有人参皂甙的组合物的制备方法为：以人参总皂甙为起始原料，在水系溶剂系统中，在0.01～10mol/L酸浓度及40℃～160℃、常压～1.5MPa(表压)条件下，进行人参总皂甙水解20分钟～960分钟，降温至28℃以下、加碱中和至PH值为中性，沉淀，去除母液，沉淀物干燥直接获取含有稀有人参皂甙Rh₂和Rg₃总含量为5％～49.9％的组合物。

上述的降温可以是自然降温，也可为在8-10分钟内的急速降温；所加的碱并不苛求，可用常用碱。

本发明制备方法的特点是以人参总皂甙为起始原料，在不含任何有机溶剂的水系溶剂系统中进行，不需添加保护剂，或/和须使用保护气体等，无有剂溶剂残留，更简单、经济和在工业中批量生产。

其中：人参总皂甙为由五加科(araliaceae)人参属(Panax)植物，如人参(P.ginseng)、西洋参(P.quenquefolinus)、三七(P.notoginseng)、竹节参(P.uaponicus)，葫芦科绞股蓝属绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Thrunb Mak)等植物中的一种的全植物提取的总皂甙；或前述植物根、茎、叶、果中的一种或二种以上部位提取的总皂甙；以及前述总皂甙的精制品。人参总皂甙中皂甙含量范围为：20％～99％。酸为盐酸、乙酸、磷酸、硫酸、冰醋酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、三氟乙酸、二氟乙酸、一氟乙酸、三氯乙酸、二氯乙酸、一氯乙酸中的一种或二种以上。

更佳的参数范围为：酸浓度0.08～4mol/L，温度90℃～130℃，压力0.05～0.8MPa，时间30分钟～270分钟。

上述组合物可用于神经细胞损伤性疾病的预防、治疗和辅助治疗，心脑血管疾病的预防、治疗和辅助治疗、实体性恶性肿瘤(肺癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌、卵巢癌、神经胶质瘤等)的预防、治疗和辅助治疗，以及抗衰老、抗疲劳等。可以制成药物或功能性食品，如散剂、颗粒剂、胶囊剂、缓释和控释胶囊剂、素片和包衣片、缓释和控释片、分散片、口含片、口服液等。

上述组合物可以由人参皂甙Rh₂与Rg₃单体，和/或分别含有人参皂甙Rh₂与Rg₃的混合皂甙按上述比例配制而成，也可以按本发明所提供的制备工艺制取。

以下提供本发明所述组合物的药效学及功能性实验资料：

实验一对肿瘤细胞株生长的抑制试验

(一)材料和仪器

癌株：S-180肉瘤株和Lewis肺癌瘤株均由中国医学科学院药物研究所提供。

受试药物：人参总皂甙水解组合物为自制，含人参皂甙Rh₂13.8％，Rg₃32.1％；人参皂甙Rh₂为自制，含量为92.7％；人参皂甙Rg₃为自制，含量为95.34％。

阳性对照药物：5-氟尿嘧啶(5-FU)。

阴性对照：含5％新生牛血清的RPMI-1640培养基。

0.4％台盼蓝溶液；

Hank’s平衡盐水(HBSS)。

二氧化碳培养箱；生物显微镜；超净工作台。

2实验方法

取对数生长期的肿瘤细胞，用含5％新生牛血清的RPMI1-640配成浓度为4×10⁴个/ml的肿瘤细胞悬液，分装于每个培养瓶中，接种细胞悬液4ml的第2天每瓶加入受试药物40μl(受试药物用时溶于少量DMSO和95％乙醇，用含5％新生牛血清的RPMI-1640培养基分别稀释成0.2，1，5，10μg/ml(人参总皂甙水解组合物以人参皂甙Rh₂，Rg₃总含量计，人参皂甙Rh₂，Rg₃均以纯物质计)4个浓度，每个浓度3瓶，阴性对照组加等体积的含5％新生牛血清的RPMI1640，阳性对照组加等体积的5-氟尿嘧啶(浓度为1μg/ml)，继续在37℃，5％CO₂的培养箱中培养72h，摇匀组织培养瓶，取悬浮液0.2ml，加入0.4％台盼蓝溶液0.5ml及平衡盐水0.3ml，充分混合，在血球计数板上分别计数(200个以上)其中未染色的活细胞及染色的死细胞。计算出抑制率(公式：抑制率＝染色细胞/总细胞×100％)，并通过X²(2×2)统计法对数据进行统计。

3实验结果

实验结果见表1、表2。

表1 人参总皂甙水解物和Rh₂，Rg₃对S180肉瘤株的抑制作用

	药物浓度(μg/ml)	抑制率(％)
			空白对照组5-氟尿嘧啶组(阳性对照)人参总皂甙水解组合物实验组人参皂甙Rh₂实验组人参皂甙Rg₃实验组	010501020.4501020.4501020.4	6.1±4.757.5±5.153.4±4.831.9±4.024.6±6.79.7±5.558.7±5.139.0±4.621.3±4.311.1±4.541.2±5.026.8±4.714.9±5.26.8±5.5

表2 人参总皂甙水解物和Rh₂，Rg₃对Lewis肺癌瘤株的抑制作用

	药物浓度(μg/ml)	抑制率(％)
			空白对照组5-氟尿嘧啶组(阳性对照)人参总皂甙水解组合物实验组人参皂甙Rh₂实验组人参皂甙Rg₃实验组	010501020.4501020.4501020.4	3.6±5.289.4±4.376.7±6.151.9±4.534.6±5.711.7±5.380.5±4.949.0±5.439.3±4.717.1±3.869.2±5.338.9±6.720.4±4.811.8±4.1

4结论

不同浓度(125，25，5，1μg/ml)的人参总皂甙水解组合物(含人参皂甙Rh₂13.8％，Rg₃32.1％)，人参皂甙Rh₂，Rg₃对体外培养的S180肉瘤瘤株和Lewis肺癌瘤株均有抑制作用，并且抑制作用呈剂量依赖性增强。人参总皂甙水解组合物与人参皂甙Rh₂，Rg₃相比较，抑制作用相当(P＞0.05)或稍强于单体人参皂甙Rh₂，Rg₃(P＜0.05)。

实验二舒张血管作用

1实验材料

人参总皂甙水解组合物：自制，HPLC检测含人参皂甙Rh₂1 3.8％，Rg₃32.1％，人参皂甙Rg₃为自制，HPLC检测含量为95.34％。

苯肾上腺素(phenylephrine，PE)。

Cremophor EL。

人参总皂甙水解组合物，人参皂甙Rh₂，人参皂甙Rg₃均以Cremophor EL制成10μg/ml的母液(人参总皂甙水解组合物以人参皂甙Rh₂，Rg₃总含量计，人参皂甙Rg₃以纯物质计)。实验开始前，上述药物均用Krebs-Henseleit(K-H)液配制成梯度稀释液备用。

雄性成年家兔，体重2.7±0.5kg。

张力换能器。

8导生理记录仪。

恒温水浴。

2实验方法

家兔经击头和颈动脉放血致死，取椎基底动脉置入富氧的K-H溶液中；除去血管外脂肪，以螺旋状连续剪成3mm×15mm的平滑肌条，一端固定于含K-H液的5ml浴槽底部，另一端固定于量程为5.0g的张力换能器上，并将整个平滑肌条自始至终浸泡于K-H液中，连续充以95％O₂与5％CO₂混合气，浴槽以(37.0±0.5)℃循环水恒温水浴。换能器接8导生理记录仪，加2.0g基础负荷，平衡20min，每隔10min换液1次。肌条张力稳定后备用。

加入10μmol/mlPE使平滑肌条张力达到3.0g，后累积加入供试药物人参总皂甙水解组合物，人参皂甙Rg₃，控制终浓度为50、100、200、400、800、1600ng/ml，空白对照加同溶剂浓度的Cremophorel，给药间隔为5min，每个实验浓度进行3个标本重复，取平均值，计算基底动脉平滑肌条舒张率。

舒张率(％)＝100×(前负荷-实际张力)/前负荷。

3实验结果，见表3。

表3 人参总皂甙水解组合物及人参皂甙Rg3的舒张血管作用

	供试药物浓度(ng/ml)	舒张率(％)
			人参总皂甙水解组合物组人参皂甙Rg₃	501002004008001600501002004008001600	014.3321.2747.5479.8882.35013.0723.7440.6074.9276.03

4结论

人参总皂甙水解组合物及人参皂甙Rg₃均具有显著的剂量依赖性舒张血管平滑肌的作用，起效浓度＜5μg/ml。人参总皂甙水解组合物较人参皂甙Rg₃作用稍弱，但组间比较差异不显著(P＞0.05)。

实验三对脑皮层神经细胞的保护作用

1材料

1.1药品与试剂人参总皂甙水解组合物与人参皂甙Rg₃：自制，HPLC检测含人参皂甙Rh₂13.8％，Rg₃32.1％，人参皂甙Rh₂为自制，含量为92.7％，人参皂甙Rg₃为自制，HPLC检测含量为95.34％。先用60％乙醇溶解为20mg·ml^-1，再用双蒸水配制浓度为2mg·ml^-1受试溶液。氯酯醒(meclofenoxane，MEC)，双蒸水溶解。上述三种药物均以微孔滤膜除菌过滤，4℃冰箱保存备用。实验时以DMEM培养液稀释至所需浓度。DMEM培养基及马血清。连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)。葡萄糖氧化酶。硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)。咖啡因(caffeine，Caf)、NMDA(N-methyl-D-aspartate)。多聚赖氨酸。胰蛋白酶。

1.2动物Wister乳鼠，1～2日龄。

2方法

2.1原代大鼠乳鼠脑皮层神经细胞的制备及培养

取Wister大鼠乳鼠数只，常规消毒头颈部，解剖大脑，分离出脑皮层，Hank’s液洗涤3次，剪碎成1mm³小块，置0.25％胰酶中，37℃消化1h，吸弃消化液，Hank’s液洗涤3次，滴管吹打至细胞分散。用DMEM生长液(含10％马血清，10％小牛血清)调整细胞浓度为1×10⁶ml^-1，将细胞悬液加至用0.01％多聚赖氨酸浸泡过夜的96孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂温箱中培养，每周换液2次。培养至第7天，换含10μmol/L阿糖胞苷的DMEM培养液培养48h，以抑制非神经原细胞增殖，再换成DMEM生长液，继续培养至11～14d进行实验。

2.2药物对实验模型的保护作用

2.2.1药物对缺糖损伤模型的保护作用

不同浓度的人参总皂甙水解组合物、人参皂甙Rg3和氯酯醒(DMEM维持液稀释)作用细胞24h后，吸弃药液，加入无糖Earle’s液，作用10h后，换成DMEM维持液，继续培养18h，观察实验结果。实验同时设损伤模型对照及正常细胞对照。

2.2.2药物对缺氧损伤模型的保护作用

将Na₂S₂O₄干粉加入DMEM培养液中，使终浓度为5mmol/L，充分搅拌，调整pH为7.2，即为缺氧溶液。缺氧损伤8h造成损伤模型。实验除设损伤对照及正常对照外，还设非低氧溶液(配制同缺氧溶液，但需放置3d以上)对照，以消除Na₂S₂O₄在水中分解产物的影响。

2.2.3药物对自由基损伤模型的保护作用

含葡萄糖(25mmol/L)-葡萄糖氧化酶(12.5mU/ml)的无血清DMEM培养基，作用3h造成自由基损伤模型。实验分组及结果观察同上。

2.2.4药物对咖啡因损伤模型的保护作用

含10mmol/L咖啡因的DMEM培养液作用45min后，造成细胞损伤模型。实验分组及结果观察同上。

2.2.5药物对NO神经毒性损伤模型的保护作用

含SNP100μmol/L的DMEM培养液作用细胞10min后，造成NO神经毒性损伤模型。实验分组及结果观察同上。

2.2.6药物对NMDA神经毒性损伤模型的保护作用

用无Mg²⁺Earle’s液洗涤细胞3次，加入含30μmol/L的NMDA，0.5μmol/L甘氨酸的无Mg²⁺Earle’s液，37℃，5％CO₂温箱中作用4h后，吸弃培养上清，Earle’s液洗涤3次，再换成正常维持液，37℃，5％CO₂温箱中继续培养18h，观察实验结果。

2.3观察指标

2.3.1细胞形态

倒置显微镜下观察细胞生长情况和细胞形态。

2.3.2结晶紫活细胞染色

模型损伤18h后，吸弃上清，以37℃，pH7.4 PBS洗涤3次，加入0.2％结晶紫溶液(内含0.2％乙醇)染色1min，洗涤6次，加1％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液100μl/孔，37℃温育30min，使细胞彻底裂解，用DG3002酶联检测仪测定OD值(λ＝630nm)。组间数据进行t检验。

3结果

3.1培养细胞形态学观察

细胞接种于多聚赖氨酸处理过的细胞培养板，37℃，5％CO₂温箱孵育2h后，倒置显微镜观察：镜下见细胞贴壁，形状呈圆形，分布均匀。培养48h，细胞逐渐伸出突触。d4，细胞大多伸展，突触相互交织成网状，胞体呈梭形，三角形。培养至d11，细胞生长成单层。

3.2药物对实验模型的保护作用

3.2.1药物对损伤模型中结晶紫染色活细胞吸光度的影响

存活细胞吸收结晶紫着色，通过测量染色活细胞在630nm波长处的吸光度，可计算存活神经细胞的比值，结果见表4。

表4 对原代培养的大脑皮层神经细胞缺血损伤的保护作用(OD值)(n＝10，)

组别

剂量μg/ml

缺糖损伤

缺氧损伤

自由基损伤

咖啡因损伤

NO损伤

NMDA损伤

对照组模型组人参总皂甙水解组合物Rg₃MEC

25510.25100

0.49±0.030.17±0.040.47±0.040.45±0.070.12±0.040.08±0.030.41±0.050.42±0.06

0.33±0.020.09±0.030.26±0.070.17±0.020.15±0.010.11±0.060.14±0.030.15±0.01

0.39±0.030.10±0.010.23±0.040.19±0.010.11±0.090.12±0.030.18±0.040.16±0.01

0.68±0.090.21±0.010.59±0.060.62±0.030.57±0.050.48±0.010.52±0.020.43±0.02

0.50±0.010.32±0.030.51±0.020.48±0.020.51±0.010.52±0.040.56±0.030.49±0.05

0.29±0.040.02±0.010.24±0.080.17±0.030.14±0.070.04±0.010.16±0.030.08±0.02

表4结果显示：与正常细胞组相比，六种脑缺血样损伤模型组细胞的OD值有极显著降低，表明活细胞数显著减少。加入药物保护后，可明显提高损伤细胞的OD值，相应的存活细胞数增加。某些组别中药物的量效关系不明显，可能是由于进行原代细胞培养时，个别培养孔中残存的其它非皮层神经细胞量的差异所致。

3.2.2药物对脑缺血模型中损伤细胞形态的影响倒置显微镜下观察：在各类缺血性损伤模型中，神经细胞均出明显的细胞病变，表现为胞体肿胀，折光性减弱，突触断裂，呈拉网状，最终细胞圆缩，脱落。细胞加药保护后，细胞损伤明显减轻，细胞形态基本保持完整，仅见部分突触断裂、胞体略有肿胀等现象。

4讨论

脑缺血最初过程为神经细胞能量供应缺乏，药物是否具有保护作用，可通过缺氧和缺糖损伤模型进行验证。实验证实人参总皂甙水解组合物对这两种细胞损伤模型具有不同程度的保护。

自由基、NO和NMDA所致神经细胞损伤模型可模拟脑缺血损伤的具体过程，高浓度Caf也导致细胞内钙释放，从而引起神经细胞死亡。以上模型从不同方面反映出脑缺血损伤过程中，由于细胞缺氧导致钙内流，同时受损细胞器内的钙离子释放，使钙离子浓度上升，出现Ca²⁺超载而致细胞死亡。实验发现人参总皂甙水解组合物能抑制氧自由基损伤过程，对NO-氧自由基损伤途径同样发挥抑制作用，尤其对Caf导致的Ca²⁺大量释放所致细胞死亡表现出非常显著的保护作用。推测人参总皂甙水解组合物抗氧自由基的作用可能与增强超氧化物歧化酶作用相关。NMDA受体激活后可引起受体型钙通道开放，刺激Ca²⁺内流，引起钙超载。同时激活诱导型一氧化氮合成酶产生NO，进一步损伤细胞。人参总皂甙水解组合物对此类模型的保护作用提示其作用机理可能是直接抑制了NMDA受体依赖性的钙通道。

实验四对免疫系统的作用

1实验材料

药物与试剂：人参总皂甙水解组合物：自制，HPLC检测含人参皂甙Rh₂13.8％，Rg₃32.1％；5-FU；CTX；印度墨汁(1∶10)；RPMI1640；吩嗪二甲酯硫酸盐；硝基氯化四氮唑盐；氧化型辅酶。

动物：昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄兼用；补体，3只豚鼠的新鲜血清1∶10稀释。

仪器设备：DG3022A型酶联免疫检测仪，紫外分光光度计，CO₂培养箱，分析天平，超净工作台。

2方法及结果

2.1对碳粒廓清速率的影响

将50只小鼠雌雄分开，随机分为5组，每组10只，实验组分三个剂量连续给人参总皂甙水解组合物，对照组给5-FU8d后，尾静脉注射印度墨汁每只100μl，于1min和5min后，分别眼眶取血，于680nm处测定吸收值，计算廓清指数。结果表明3个剂量组呈剂量依赖性明显增加碳粒廓清速率(表5)。

廓清指数(K)＝(IgA1-IgA5)/(t_s-t₁)

表5 人参总皂甙水解物对小鼠碳粒廓清速率的影响(n＝10)

	剂量(μg/kg×d)	K value
			空白对照人参总皂甙水解组合物5-FU	0300×8600×8900×85000×8	0.0012±0.0030.0106±0.002^*0.0210±0.005^0.0367±0.003^*0.0011±0.009^

*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，与空白对照比较。

2.2对荷瘤鼠免疫器官重量的影响

50只小鼠雌雄分开，随机分为5组，每组10只。接种癌细胞：S180细胞悬液0.2ml/只，次日实验组分三个剂量连续给人参总皂甙水解组合物，对照组给5-FU，8d后解剖，取出脾脏和胸腺，称重，计算10g体重的脏器mg重，结果人参总皂甙水解组合物3个剂量组可使荷瘤小鼠脾脏和胸腺的重量明显的增加。

表6 人参总皂甙水解组合物对脏器系数的影响(n＝10)

	剂量(μg/kg×d)	Thymus Index	Spleen Index
				空白对照人参总皂甙水解组合物5-FU	0300×8600×8900×85000×8	29.97±5.2641.38±7.37^*48.22±9.47^59.73±12.51^17.54±6.96^*	28.63±12.1438.38±13.11^63.23±10.09^97.58±14.79^*27.23±23.03^

*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，与空白对照比较。

2.3对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响

选择KM种小鼠50只，雌雄各半随机分5组，每组10只。实验组分三个剂量给人参总皂甙水解组合物，对照组给CTX，连续给药8d后，解剖取脾脏，制或脾细胞悬液，加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，再加入PHA100μl，放置5％CO₂，37℃培养箱中，48h后弃上清液加入MTT10μl，放置37℃，5％CO₂孵箱内反应2h，每孔加入酸化异丙醇100μl，振荡溶解，置酶标光度计570nm处测定OD值，结果表明，三个剂量组均能刺激淋巴细胞的增殖，结果见表7。

表7 人参总皂甙水解组合物对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响(n＝10)

	剂量(μg/kg×d)	OD(xq±s)	K
				空白对照人参总皂甙水解组合物CTX	0300×8600×8900×81000×3	0.51±0.341.10±0.63^*1.12±0.49^1.19±0.57^0.20±0.04^	2.042.052.130.19

*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，与空白对照比较。

2.4对小鼠体液免疫功能的影响

本实验采用血清溶血素分光光度法，测定血清中溶血素含量。首先将小鼠用5％绵羊红细胞腹腔注射0.2ml免疫，同时开始给药，实验组分三个剂量给人参总皂甙水解组合物，对照组给5-FU，4d后摘眼球取血，分离血清，稀释500倍，再加0.5mlSRBC，在补体的作用下，37℃反应10min，离心取上清液，加都氏液，于540nm测定OD值，结果表明三个剂量组均能促进小鼠血清中溶血素生成，提高体液免疫功能。

HC₅₀＝(给药组OD值/SRBC半数溶血OD值)×500

表8 人参总皂甙水解组合物对小鼠体液免疫功能的影响(n＝10)

	Dose(μg/kg×d)	HC₅₀
			空白对照人参总皂甙水解组合物5-FU	0300×4600×4900×45000×4	73.84±18.59158.76±43.22^*177.93±37.04^208.61±55.19^*88.26±38.26^

*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01，与空白对照比较。

2.5对荷瘤鼠NK活性的影响

选择KM小鼠，分三个剂量给人参总皂甙水解组合物，给药8d后取脾脏，制成脾细胞悬液，按效应细胞和靶细胞10∶1比例各加100μl置96孔培养板上，于5％CO₂，37℃共孵24h，吸上清液100μl，加底物100μl，反应5min，加0.1mol/L柠檬酸50μl置酶标光度计570nm处测定OD值，计算NK活性，结果表明，三个剂量均能提高NK细胞活性结果见表9。

NK(％)＝(实验管OD-自然释放OD)/(最大释放管OD-自然释放管OD)×100％

表9 人参总皂甙水解组合物对荷瘤鼠NK活性的影响(n＝10)

	剂量(μg/kg×d)	OD(xq±s)	NK cell activity(K)
				空白对照	0300×8600×8900×8	0.51±0.050.77±0.31^*1.01±0.27^1.52±0.36^**	19.0563.8178.3591.72

P＞0.05，P＜0.05，P＜0.01，与空白对照比较。

实验五抗疲劳作用

1、材料和方法

1.1试药：人参总皂甙水解组合物，自制，HPLC检测含人参皂甙Rh₂13.8％，Rg₃32.1％。

1.2实验动物：18～22g的雄性昆明种小白鼠。

1.3剂量：三批动物，每批60只，分别做游泳试验、血清尿素氮和肝糖原试验。每批小鼠随机分为4组，每组15只，空白对照组给予N.S，人参总皂甙水解组合物低、中、高剂量组的给药剂量分别为：200、600、1800μg/kg，每天一次。

1.4主要仪器与试剂：全自动生化分析仪；超微量半自动生化分析仪；乳酸盐分析仪；50×50×40cm³方形有机玻璃游泳箱，自制；电子天平；手持式多功能粉碎器；尿素氮试剂盒。

1.5实验方法

1.5.1负重游泳实验：小鼠于末次给予人参总皂甙水解组合物30分钟后，使尾部负重5％体重的铅皮，在水深30cm、水温25℃的游泳箱中游泳，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间。

1.5.2血清尿素氮测定：小鼠于末次给予人参总皂甙水解组合物30分钟后，在水深30cm、水温30℃的游泳箱中不负重游泳90分钟，休息30分钟后，眼眶静脉丛取血约0.5ml。待血液凝固离心，取血清测定尿素氮含量。

1.5.3肝糖原测定：小鼠于末次给予人参总皂甙水解组合物30分钟后，立即颈椎脱臼处死取出肝脏，经生理盐水空白漂洗，滤纸吸干，精确称取肝脏100mg于试管内，加入8ml三氯醋酸匀浆1分钟，3000r离心15分钟。取上清液于另1支试管内，用蒽酮法测定肝糖原含量。

2结果

2.1人参总皂甙水解组合物对小鼠负重游泳时间的影响

表10 人参总皂甙水解组合物对小鼠负重游泳时间的影响

分组	剂量(μg/kg)	动物数(只)	负重游泳时间(分)	P值
					空白对照组(N.S)低剂量组中剂量组高剂量组	20ml2006001800	15151515	32.2±37.592.6±87.873.1±79.7107.4±75.5	-＜0.05＜0.01＜0.01

由表10可见，人参总皂甙水解组合物低、中、高三个剂量组小鼠负重游泳时间均明显长于空白对照组，组间比较，差异具有显著性意义(P＜0.05)，提示人参总皂甙水解组合物能明显延长小鼠负重游泳时间，增强小鼠耐疲劳的能力。

2.2人参总皂甙水解组合物对小鼠血清尿素氮的影响

表11 人参总皂甙水解组合物对小鼠运动时血清尿素氮的影响

分组	剂量(μg/kg)	动物数(只)	尿素氮(mmol/L)	P值
					空白对照组(N.S)低剂量组中剂量组高剂量组	20ml2006001800	15151515	10.56±0.779.70±0.889.87±0.789.36±0.87	-＜0.05＜0.05＜0.01

由表11可见，人参总皂甙水解组合物低、中、高三个剂量组小鼠运动时血清尿素氮水平均低于与空白对照组，差异有显著性意义(P＜0.05)，提示本试验条件下人参总皂甙水解组合物能降低运动时小鼠血清尿素氮。

2.3人参总皂甙水解组合物对小鼠肝糖原含量的影响

表12 人参总皂甙水解组合物对小鼠肝糖原含量的影响

分组	剂量(μg/kg)	动物数(只)	肝糖原(mg/100g肝组织)	P值
					空白对照组(N.S)低剂量组中剂量组高剂量组	20ml2006001800	15151515	5359±10735557±16886724±16886621±1186	--＜0.05＜0.05

由表12可见，人参总皂甙水解组合物中、高剂量组肝糖原含量明显高于空白对照组，差异有显著性意义(P＜0.05)，提示人参总皂甙水解组合物能增加小鼠肝糖原的含量。

具体实施方式

本发明以下引用实施例进一步说明，但所引用实施例并不对本发明涵盖范围形成限制。

实施例1：称取人参皂甙粉末200g，用3.0mol/L稀醋酸12000ml充分分散，置反应器中加热至120℃，保持反应器内压力为7.0MPa，水解40分钟，急速降温至28℃后用40％氢氧化钠溶液将水解液中和，过滤，将固形物收集干燥，即得含有稀有人参皂甙G-Rh₂和G-Rg₃的组合物。组合物得率为41.2％，组合物中G-Rh₂含量为11.2％，G-Rg₃含量27.6％。取该组合物40g研细，过100目筛，加入过100目筛的蔗糖粉600g，乳糖1200g，微晶纤维素150g，香兰素10g，混合均匀，用适量的10％淀粉浆制粒，干燥，分装为1000份，制成颗粒剂型药物或功能性食品。

实施例2：称取三七叶甙粉末200g，用0.5mol/L稀盐酸10000ml充分分散，置反应器中加热至90℃，保持反应器内压力为2.0MPa，水解120分钟，急速降温至28℃后用40％氢氧化钠溶液将水解液中和，过滤，将固形物收集干燥，即得含有稀有人参皂甙G-Rh₂和G-Rg₃的组合物。组合物得率为33.2％，组合物中G-Rh₂含量为9.1％，G-Rg₃含量22.8％。取该组合物38g，研细，过80目筛，加入药用淀粉200g，用10％淀粉浆制粒，干燥，整粒后，加入3g硬脂酸镁，混合均匀，填充入1^#胶囊，制得1000粒，制成胶囊剂药物或功能性食品，。

实施例3：称取西洋参总甙粉末200g，用1.0mol/L稀柠檬酸15000ml充分分散，置反应器中加热至135℃，保持反应器内压力为4.0MPa，水解270分钟，急速降温至28℃后用40％氢氧化钠溶液将水解液中和，过滤，将固形物收集干燥，即得含有稀有人参皂甙G-Rh₂和G-Rg₃的组合物。组合物得率为40.5％，组合物中G-Rh₂含量为11.9％，G-Rg₃含量32.6％。取该组合物27g，研细，过100目筛，加入淀粉40g，乳糖75g，微晶纤维素8g，交联羧甲基纤维素2.5g混合，用适量的3％羧甲基纤维素溶液制粒，干燥，整粒，加入1.5g硬酯酸镁，2g微粉硅胶混合均匀，用8mm冲模，压制成1000片素片。

如将上述素片作为片芯，在高效包衣机中用LE薄膜包衣剂(胃溶型或肠溶型)包衣，即可得薄膜衣片或肠溶片1000片，制成片剂药物或功能性食品。

实施例4：称取绞股蓝总甙粉末200g，用0.5mol/L稀硫酸12000ml充分分散，置反应器中加热至90℃，保持反应器内压力为2.0MPa，水解120分钟，急速降温至28℃后用40％氢氧化钠溶液将水解液中和，过滤，将固形物收集干燥，即得含有稀有人参皂甙G-Rh₂和G-Rg₃的组合物。组合物得率为23.7％，组合物中G-Rh₂含量为9.4％，G-Rg₃含量18.3％。取该组合物43g，研细，过120目筛，加入低取代羟丙基纤维素20g，可溶性淀粉80g，乳糖100g，甜叶菊甙4g，混合均匀。另取聚乙烯吡咯烷酮5g，用适量40％乙醇制成浆状，将混合药粉制成80目的颗粒，整粒，干燥，加入硬酯酸镁2g，混匀，用12mm冲模，压制成1000片分散片。

实施例5：分别称取人参皂甙G-Rh₂含量31.55％的混合皂甙43g，人参皂甙G-Rg₃含量45.62％的混合皂甙57g，置混合器中混合45分钟，即得含有稀有人参皂甙G-Rh₂和G-Rg₃的组合物。组合物中G-Rh₂含量为13.57％，G-Rg₃含量26.0％。按照常规工艺制成药物或功能性食品。

Claims

1.一种含稀有人参皂甙的组合物，其特征在于所述的组合物是含人参皂甙Rh₂ 13.8％和Rg₃ 32.1％的人参总皂甙水解组合物。

2.权利要求1所述的含稀有人参皂甙的组合物在制备治疗神经细胞损伤性疾病的药物中的应用。

3.权利要求1所述的含稀有人参皂甙的组合物在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。

4.权利要求1所述的含稀有人参皂甙的组合物在制备治疗实体性恶性肿瘤疾病的药物中的应用。

5.权利要求1所述的含稀有人参皂甙的组合物在制备治疗抗衰老、抗疲劳的药物中的应用。

6.权利要求1所述的含稀有人参皂甙的组合物在制备功能性食品中的应用。