CN114306354A - 一种具有抗2型登革病毒作用的植物单体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物单体三七皂苷‑3在制备用于抗登革病毒药物中的应用。其中，所述三七皂苷‑3结构为：

Description

一种具有抗2型登革病毒作用的植物单体及其应用

技术领域

本发明涉及登革热病毒治疗技术领域，具体涉及一种具有抗2型登革病毒作用的植物单体三七皂 苷-3，属于抗病毒医药技术领域。

背景技术

登革病毒(Dengue virus，DENV)一种借助于蚊媒传播的病毒，感染人后很容易引起登革热， 并进一步引起严重的登革出血热和登革休克综合征，是最常见的蚊虫传播病毒，其病毒主要包括四 种血清型(DENV1—DENV4)。据估计，全球每年约有3.9亿人感染，其中960万例出现临床症状， 约50万例因病情严重需要住院。而登革热也已在我国大规模流行，2014年广东省爆发严重疫情，发 病人数达47143人；2019年再次爆发，全国发病人数达22599人。因此登革热已成为我国乃至世界的 重大公共卫生问题。

然而，目前在临床上缺乏针对登革病毒的特异性抗病毒药物，且由于其病毒血清型较多、抗体依 赖性增强作用(Antibody-dependent enhancement，ADE)等特点也使得难以获得针对DENV稳定有效 的疫苗，针对登革热仍只能以改善发热、出血等症状为主，这对登革热的临床治疗带来了巨大的阻碍。 因此，抗登革病毒的活性分子的发现具有重要的生物学研究意义和实践意义。

三七又名田七、山漆、金不换等，是我国著名传统中药，为五加科人参属植物。三七以干燥根 及根茎入药。味甘、微苦、性温、入肝、胃经，有散瘀止血，消肿止痛之功能。三七富含皂苷类成 分，迄今已从三七的不同部位分离鉴定了多种化学成分，大量的研究结果表明，三七的提取物具有 广泛的生理活性，是最具有多样性、含量最高、最有医疗保健价值、最具有开发利用前景的药材。

目前，关于三七皂苷的药理活性报道主要是降血脂、抗肿瘤、消除氧自由基、抗氧化作用，至 今未见三七皂苷作为抗登革病毒用途的相关报道。

发明内容

本发明提供植物单体三七皂苷-3在制备抗登革热病毒药物上的应用，以解决背景技术中所提出的 问题。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供植物单体三七皂苷-3在在制备抗登革热病毒药物上的 应用，所述三七皂苷-3的化学结构式如下：

本发明的实施例还提供一种抗登革热病毒的药物，其特征在于，至少包括含有治疗有效量的植物 单体三七皂苷-3及药学上可接受的辅料。

优选的，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量百分比的作为活性成分的三七皂苷-3，更优选 含有0.2-20％重量百分比的作为活性成分的三七皂苷-3，更优选含有0.3-10％重量百分比的作为活性 成分的三七皂苷-3，更优选含有0.4-5％重量百分比的作为活性成分的三七皂苷-3。

“可接受的辅料”不会破坏本发明的三七皂苷-3的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物 载体作用时的用量对人体无毒。

所述可接受的辅料包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递 系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质 如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、 崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬 脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

本发明进一步提供一种药物组合物，其含有作为活性成分的三七皂苷-3，以及药学上可接受的载 体、赋形剂或稀释剂。

上述药用赋形剂包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种以上的组 合。

本发明所述的三七皂苷-3以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道 或局部途径给药。

其中，肠道给药制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道 给药制剂包括注射液等；局部途径给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。

本发明所述的三七皂苷-3以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、 皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。

与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：

1、本发明的植物单体三七皂苷-3在制备抗登革热病毒药物上的应用，通过三七皂苷-3对BHK-21 的细胞毒性影响实验，三七皂苷-3抑制DENV-2的E和NS1蛋白的表达，抑制DENV-2复制中间体 dsRNA、E和NS1的合成以及抑制DENV-2的早期复制阶段这几个方面，植物单体三七皂苷-3制备 的药物在抗2型登革热病毒上具有显著作用，植物单体三七皂苷-3具有抗登革病毒药物的潜在价值。

2、本发明为植物单体三七皂苷-3抗登革热病毒中的应用提供实验和理论依据，找到临床上抗登 革热病毒的新突破口。

附图说明

图1是三七皂苷-3对BHK-21细胞生存率的影响；

图2是三七皂苷-3对DENV-2引起的BHK-21细胞中E和NS1表达的影响；图2B为实时荧光定 量PCR检测NS1表达水平的结果图；图2C为蛋白免疫印迹分析检测E和NS1表达水平的结果图。 图中，“*”表示与病毒感染(模型)组相比，统计学差异有显著性。

图3是三七皂苷-3对DENV-2引起的BHK-21细胞中dsRNA合成的影响；

图4是三七皂苷-3对DENV-2引起的BHK-21细胞中E蛋白合成的影响；

图5是三七皂苷-3对DENV-2引起的BHK-21细胞中NS1蛋白合成的影响；

图6是三七皂苷-3对DENV-2生命周期的影响。通过分时给药处理，检测三七皂苷-3作用于 DENV-2生命周期的哪个阶段。图6A为实时荧光定量PCR检测E表达水平的结果图；图6B为实时 荧光定量PCR检测NS1表达水平的结果图。图中，“*”表示与病毒感染(模型)组相比，统计学 差异有显著性。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例用到的三七皂苷-3由从植物三七中分离制备(暨南大学药学院认证)，通过UV、MS、 NMR等光谱方法鉴定其结构，纯度经HPLC-DAD峰面积归一化法测得在98％以上。

本发明所述实施例涉及包括以下几个方面：

(1)三七皂苷-3对BHK-21的细胞毒性影响：通过检测BHK-21细胞的生存率检测三七皂苷-3 对BHK-1细胞的活性影响；

(2)三七皂苷-3抑制DENV-2的囊膜蛋白(E)和非结构蛋白1(NS1)的表达：通过实时荧光 定量PCR和Western blot检测E和NS1的mRNA和蛋白水平；

(3)三七皂苷-3抑制DENV-2复制中间体dsRNA、E和NS1的合成：通过免疫荧光法检测dsRNA、 E和NS1的合成；

(4)三七皂苷-3抑制DENV-2的早期复制阶段：通过分时给药处理，运用qRT-PCR检测E和 NS1的mRNA水平。

实施例1三七皂苷-3在2.5、5、10μM浓度下，对BHK-21细胞毒性较低

试验方法：将BHK-21细胞接种在96孔板(0.8×10⁴/孔)中并培养24h。随后，采用RPMI-1640 培养基稀释三七皂苷-3至2.5、5、10μM浓度，加入到BHK-21细胞上清中，同时设正常细胞对照。 在37℃、5％CO₂培养96h后，加入MTT溶液，孵育4h后，吸去上清并加入200μL的DMSO，使用 酶标仪检测波长570nm处的吸光度，根据吸光度计算BHK-21的细胞存活率。

BHK-21细胞各组生存率按如下公式计算：

存活率＝各组BHK-21细胞的OD值/空白组的OD值×100％

试验结果如图1所示，三七皂苷-3在2.5、5、10μM浓度下，对BHK-21细胞毒性较低。

实施例2三七皂苷-3抑制DENV-2引起的BHK-21细胞中E和NS1表达

试验方法：将BHK-21细胞接种在6孔板(2×10⁵/孔)中并培养24h。随后，加入病毒液，37℃ 感染1h，感染完后即给药三七皂苷-3(2.5μmoL/L、5μmoL/L、10μmoL/L)或利巴韦林处理。48h 后，Trizol试剂提取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR实验或提取细胞总蛋白进行Western blot实验， 检测化合物对E和NS1的mRNA和蛋白表达的抑制作用。

试验结果显示：如图2所示，实时荧光定量PCR检测病毒E和NS1的mRNA水平，发现三七皂 苷-3呈浓度依赖地降低细胞内DENV2 E蛋白和NS1的RNA水平。在DENV-2感染BHK-21细胞48h 后，Western blot检测细胞内病毒包膜蛋白E和NS1含量，发现三七皂苷-3处理后，E和NS1蛋白含 量呈浓度依赖减少，表明病毒E和NS1蛋白的合成受到抑制。

实施例3三七皂苷-3抑制DENV-2引起的BHK-21细胞中复制中间体dsRNA、E和NS1的合 成

试验方法：将BHK-21细胞接种在共聚焦小皿(2×10⁴/皿)中并培养24h。随后，加入病毒液，37℃ 感染1h，感染完后即给药三七皂苷-3(10μmoL/L)或利巴韦林处理。48h后，依次加入用5％Milk 配制的dsRNA、E蛋白或NS1蛋白一抗、二抗，在激光共聚焦显微镜下拍照。

试验结果：通过对dsRNA进行标记，激光共聚焦实验显示，明亮绿色荧光聚集在胞质呈点状分 布，表明在这些区域存在大量的病毒复制中间体dsRNA。而在10μmoL/L三七皂苷-3处理下，DENV-2 的复制中间体dsRNA含量明显减少，表明三七皂苷-3抑制病毒RNA复制合成。

此外，在DENV-2感染的BHK-21细胞中，病毒包膜蛋白E和非结构蛋白NS1在胞质大量分布， 表明DENV-2在胞质进行活跃的蛋白合成，而在10μmoL/L三七皂苷-3处理下，病毒E和NS1在胞 质的累积减少，证明三七皂苷-3抑制病毒蛋白E和NS1的合成。(如图3、4、5所示)

实施例4三七皂苷-3抑制DENV-2的早期复制阶段

试验方法：将BHK-21细胞接种在6孔板(2×10⁵/孔)中并培养24h。随后，加入病毒液，37℃ 感染1h。PBS洗涤3次去除未吸附的病毒，分别于0、4、8和12小时，将培养基更换为含10μmoL/L 三七皂苷-3的培养基，设置不加药物的空白对照组。48h后，Trizol试剂提取细胞总RNA，实时荧光 定量PCR实验检测E和NS1的mRNA水平。

试验结果：如图6所示，三七皂苷-3影响DENV生命周期的哪一阶段通过分时给药确定。在黄 病毒的一个生命周期中，在感染后的1-5h(hpi)病毒蛋白从基因组RNA中翻译出来；病毒RNA合 成在5hpi后发生，子代病毒体在感染12h后组装并释放。三七皂苷-3对DENV-2的E和NS1 mRNA 水平有明显的抑制作用，但0时、4时、8时给药的抑制效果最好，随着给药时间的推迟，三七皂苷 -3的抑制效果逐渐减弱，表明三七皂苷-3主要作用于DENV复制的前期阶段。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任 何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.植物单体三七皂苷-3在制备抗登革热病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述药物含有治疗有效量的三七皂苷-3及药学上可接受的辅料。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的抗登革病毒药物制剂包括但不限于胶囊剂、颗粒剂、片剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、控释剂或分散片。

4.一种药物组合物，其特征是，含有权利要求1所述作为活性成分的三七皂苷-3，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述药用赋形剂包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种以上的组合。

6.根据权利要求4所述的组合物，其可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述肠道给药制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述非肠道给药制剂包括注射液等。

9.根据权利要求6所述的组合物，其中所述局部途径给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。

10.根据权利要求4所述的组合物，其中给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。

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