CN101658525A - 用于抗血栓性疾病的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于抗血栓性疾病的药物组合物及其制备方法和用途。该药物组合物主要包含知母皂苷AIII和知母皂苷BII，任选包含药用辅料，其特征在于所述知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。本发明还涉及知母皂苷AIII和知母皂苷BII组合物在制备用于预防或治疗血栓性疾病的药物或产品中的用途。本发明药物组合物在发挥预防或治疗血栓性疾病的作用的同时，可以减轻患者出血或出血倾向。

Description

用于抗血栓性疾病的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种用于抗血栓性疾病的药物组合物及其制备方法和用途，具体涉及一种包含知母皂苷AIII和知母皂苷BII的药物组合物，及其制备方法和在制备用于预防或治疗血栓性疾病的药物中的用途。

背景技术

血小板的粘附、聚集、释放反应导致血栓形成。血栓形成是心肌梗塞、脑卒中等许多人类心脑血管疾病的主要发病原因，也是糖尿病、脉管炎等一些重要疾病的加重因素。抗血栓治疗是这些疾病的主要治疗措施之一。抑制血小板聚集、抗凝和溶栓是血栓性疾病治疗的三大主题，其中以抗血小板聚集治疗应用最广，疗效突出，相关药物的研发也最为活跃。从最早的环氧化酶抑制剂阿司匹林，到ADP受体拮抗剂塞氯吡啶，再到血小板GPIIb/IIIa受体拮抗剂替罗非斑，以及系列前列腺素类药物，如PGE1、PGI2等，已广泛应用于心、脑血管性疾病的临床治疗。

中药知母为百合科(Liliaceae)知母属多年生草本植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的根茎，主要成分是甾体皂苷(steroidal saponins)，到目前为止，文献报道从知母中分离鉴定了几十种甾体皂苷及皂苷元；其次还有黄酮、寡糖、多糖及脂肪酸等。

Jianying ZHANG等报道了单体化合物知母皂苷Ia、BI、BII、BIII和AIII具有显著的抗人血小板聚集及延长凝血时间的活性。(Jianying ZHANG等，Clinica Chimica Acta，1999；289：79-88)。

知母皂苷AIII、B和BII的结构如下：

知母皂苷AIII                     知母皂苷BII

知母皂苷B

马百平等报道了单体化合物知母皂苷BII可明显改善局灶性脑缺血大鼠神经症状，缩小脑梗塞范围，减轻脑水肿程度；明显改善模型动物的血液流变性、减轻脑缺血所致炎性损伤等，可用于防治脑卒中(脑中风)(发明专利申请书，申请号200410037347.X)。

陈万生等报道了知母总皂苷用于制备防治脑卒中药物的用途(发明专利申请公开书，公开号CN1451384A，申请号03116824.8)。该申请中公开的知母总皂苷的特征为知母皂苷BII、E、B、AIII的含量之和≥50％。

陈万生等还报道了知母提取物的注射剂(含知母皂苷BII、E1和B，三者比例为78-92：7-12：0-6)可明显改善大鼠脑缺血再灌注损伤引起的行为症状，缩小脑梗塞体积，降低脑缺血大鼠脑水肿，可用于治疗缺血性脑血管疾病(发明专利申请公开书，公开号为CN1628790A，申请号为200410054146.0)。

至今未发现以知母皂苷AIII为主，联合知母皂苷BII的抗血栓药物。因此，提供一种以知母皂苷AIII为主，联合知母皂苷BII的抗血栓药物是合乎临床需要的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗血栓性疾病的主要包含知母皂苷AIII和知母皂苷BII的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供用于制备本发明药物组合物的方法。

本发明的还一个目的是提供本发明药物组合物在制备用于预防或治疗血栓性疾病的药物中的用途。

本发明的发明人通过多年潜心研究，首次发现并证实，将知母皂苷AIII和知母皂苷BII联合用于抗血栓性疾病，只要知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量，该组合物就可以在产生令人满意的抗血栓作用的同时，减轻抗血栓药通常具有的出血或出血倾向。基于此发现，本发明人完成了本发明。

一方面，本发明提供一种用于预防或治疗血栓性疾病的药物组合物，其包含有效量的知母皂苷AIII和知母皂苷BII，并且包含或不含一种或多种药用辅料，其特征在于其中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。

在一个实施方案中，知母皂苷AIII和知母皂苷BII都以知母皂苷提取物的形式用于本发明的药物组合物中。在该实施方案中，本发明的药物组合物可以仅包含有效量的含有知母皂苷AIII的提取物和含有知母皂苷BII的提取物，可以不使用药用辅料。

在另一个实施方案中，在本发明的药物组合物中，知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为1∶1至10∶1。

在另一个实施方案中，在本发明的药物组合物中，知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为2∶1至5∶1。

在再一个实施方案中，在本发明的药物组合物中，知母皂苷AIII和知母皂苷BII的重量比为3∶1。

另一方面，本发明提供用于制备本发明药物组合物的方法，该方法包括将含所需量的知母皂苷AIII提取物和知母皂苷BII提取物混合，并且根据需要，可以不加入辅料或加入一种或多种药用辅料，然后使用适当的方法制成所需的制剂。

在一个实施方案中，制备本发明药物组合物的方法包括将所需量的知母皂苷AIII单体化合物和知母皂苷BII单体化合物，以及一种或多种药用辅料混合，然后使用适当的方法制成所需的制剂。

在另一个实施方案中，制备本发明药物组合物的方法包括如下步骤：

使用适合的提取方法提取知母药材饮片、新鲜根茎、须根等，将提取液过滤并收集滤液，然后将滤液注入大孔吸附树脂柱，用适合的溶剂洗脱，收集相应的组分，分离得到主要含知母皂苷BII的知母原生总皂苷；

使用自然发酵、酶转化、缓冲盐转化、酸水解或它们的组合方法转化所述组分足够的时间，得到知母次生总皂苷；

以及将一定比例的知母原生总皂苷和次生总皂苷混合得到本发明的药物组合物。

在一个具体实施方案中，制备本发明药物组合物的方法包括如下步骤：

使用40～70％C₁-C₄醇或40～70％丙酮提取知母饮片、新鲜根茎或须根，将提取液过滤，收集滤液并离心，然后将上清液注入大孔吸附树脂柱，用选自水、20～90％C₁-C₄醇和10～80％丙酮的溶剂梯度洗脱，收集50～90％C₁-C₄醇组分或35～80％丙酮组分，得到所述知母原生总皂苷；

使用选自β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、纤维素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的酶或微生物转化所述组分足够长的时间，将转化溶液离心后得到知母次生总皂苷；

以及将一定比例的上述知母原生总皂苷和次生总皂苷混合得到本发明的药物组合物。

在另一个具体实施方案中，制备本发明药物组合物的方法包括如下步骤：

用40～70％的乙醇提取知母饮片、新鲜根茎，或须根，将提取液过滤并收集滤液，减压浓缩后加入90～100％乙醇，离心，然后将上清液装入大孔吸附树脂柱，用20～95％乙醇梯度洗脱，收集50～90％乙醇组分，得到所述知母原生总皂苷；

使用选自β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、纤维素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的酶或微生物的一种或几种组合酶转化所述组分一定时间(？至少10小时)，将转化溶液离心后得到知母次生总皂苷；

以及将一定比例的上述知母原生总皂苷和次生总皂苷混合得到本发明的药物组合物。

另一方面，本发明提供知母皂苷AIII和知母皂苷BII在制备用于预防或治疗血栓性疾病的药物中的用途，其中在所制备的药物中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。

在一个实施方案中，在所制备的药物中，知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为1∶1至10∶1。

在另一个实施方案中，在所制备的药物中，知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为2∶1至5∶1。

在另一个实施方案中，在所制备的药物中，知母皂苷AIII和知母皂苷BII的重量比为3∶1。

在另一个实施方案中，所述血栓性疾病及与血栓相关性疾病包括例如冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑卒中、脑血栓、肺栓塞、糖尿病和脉管炎。

本申请中所称的“有效量”是指知母皂苷AIII和知母皂苷BII二者联合应用时能够实现临床上预防或治疗血栓性疾病目标的量。

对于本领域的技术人员来说，本发明的药物组合物可以通过本领域中的各种常规方法被轻易地配制成各种剂型，如口服制剂，如片剂，胶囊，溶液，悬浮液和颗粒剂等；非肠道给予剂型，如注射剂，软膏，贴剂等。本发明的药物组合物可以通过本领域中的各种给药途径使用。

可以用口服或肠胃外给药等方式将本发明的药物组合物或其制剂给予需要它的患者。对于成人来说，每人口服日剂量为约150mg～450mg，例如约300mg。

经研究表明，知母皂苷AIII体外可以显著抑制血小板聚集，增强PGE1的抗血小板聚集作用，体内给药具有明显的抗血栓活性；而知母皂苷BII体外不能抑制血小板聚集，但可扩张血管，体内可改善血液流变性、减少白细胞在血管内皮细胞上粘附。因此，本发明中一定比例配比的知母皂苷AIII和知母皂苷BII两个具有不同作用机制和靶点的组合，可以在体内获得抗血栓作用强，但出血倾向低的优点。

本发明的药物组合物在发挥预防或治疗血栓性疾病的作用的同时，可以减轻患者的出血或出血倾向。

附图说明

图1是各组小鼠尾静脉注射胶原致死时间散点分布图

图2是各组小鼠尾静脉出血时间散点分布图

具体实施方式

下面的实施例用于进一步说明本发明，但其不意味着对本发明的任何限制。

除非特别指明，否则本申请中的百分比或份数均指重量百分比或份数，并且组合物中各组分的含量之和等于百分之百。

实施例1

本发明的药物组合物对小鼠尾静脉出血时间 和尾静脉胶原注射致死时间的影响

一、实验材料和方法

1实验材料

根据已知方法(药学学报1996；31(4)：271-277；Chem Pharm Bull，1963，11：1221)制备了知母皂苷AIII和BII单体化合物，这2种化合物的纯度均大于98.5％；Wistar大鼠，雄性，体重280-320克，昆明种小鼠，雄性，体重22-24克，由军事医学科学院动物饲养中心提供。肾上腺素购自北京市永康药业有限公司。胶原为本实验室自制的大鼠尾部胶原。PBS购自天为时代公司。肝素购自Sigma公司，生理盐水购自山东临淄制药厂。阿司匹林，石家庄制药集团欧意药业有限公司。

2动物分组

将Wistar大鼠随机分成七组，对照组、阿司匹林组(ASP，40mg/Kg)、AIII组(40mg/Kg)、BII组(40mg/Kg)、1比1组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)、1比3组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)、3比1组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)。连续灌胃给药七天，每天给药一次，第七天给药一小时后开始实验。对照组给予相同体积的生理盐水。

3实验方法

3.1血小板最大聚集率的检测

Wistar大鼠，第7天给药1小时后，戊巴比妥钠(40～60mg/kg)腹腔注射麻醉，心脏取血，以3.8％枸橼酸钠(体积比1∶9)抗凝。于室温800rpm离心10分钟，分离富血小板血浆(PRP)，然后再室温3000rpm离心20分钟，分离贫血小板血浆(PPP)。用F-820血细胞计数仪计数，以PPP将PRP浓度调整为3.0×10¹¹/L。

Chronolog血小板聚集仪检测。用血浆将血小板悬液浓度调整到3.0×10¹¹/L，打开血小板聚集仪并预温30分钟，以PPP做空白对照调节透光率到100％。取血小板悬液450μL，加入搅拌子37℃预温3分钟，分别加入诱导剂(50μL)ADP试剂(终浓度为20μM)，然后记录5分钟图形，读取1分钟、3分钟、5分钟及最大的聚集率。

3.2动-静脉旁路血栓实验

将大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(30-40mg/kg)麻醉，仰卧位固定，分离右侧颈总动脉和左颈外静脉，将三段聚乙烯管相连，一端插入右颈总动脉，另一端插入左颈外静脉，两端聚乙烯管内充满25u/mL肝素(以生理盐水临用新制)，中间段长10cm，放入一根长为8cm的7^#手术线(已称重)，管内注满生理盐水(注意：不得有气泡)，建立动静脉旁路。15分钟后取下套管，取出血栓，在湿润的滤纸上滚动，去除多余浮血，置已称重的硫酸纸上称湿重。再置于烘箱内60℃烘烤1h至恒重，冷却称重得血栓干重。

3.3小鼠尾静脉出血时间实验

将小鼠随机分成七组，对照组、阿司匹林组(40mg/Kg)、BII组(40mg/Kg)、AIII组(40mg/Kg)、1比1组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)、1比3组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)、3比1组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)。连续灌胃给药五天，每天给药两次，第六天给药一小时后开始实验。对照组给予相同体积的生理盐水。所有药物比例均为AIII和BII。

将小鼠用戊巴比妥钠(40-60mg/Kg)麻醉小鼠，放置在温暖舒适的垫子上，在小鼠尾巴的直径为2.25-2.5mm处切去尾尖，并立即置入PBS(37℃)中，开始计时。观察10分钟内的止血时间和再出血现象，并通过血红蛋白的含量推测小鼠出血的体积。10分钟内没有止住出血的，压迫止血，出血时间记为600秒。

3.4小鼠尾静脉胶原注射致死时间实验

将小鼠随机分成七组，对照组、阿司匹林组(40mg/Kg)、BII组(40mg/Kg)、AIII组(40mg/Kg)、1比1组(40mg/Kg)、1比3组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)、3比1组(AIII与BII的重量比，40mg/Kg)。连续灌胃给药五天，每天给药两次，第六天给药一小时后开始实验。对照组给予相同体积的生理盐水。

将小鼠在小鼠固定架上固定以后，尾静脉注射由胶原(0.5mg/Kg)和肾上腺素(60ug/Kg)组成的血栓剂100μL/只。观察10分钟内小鼠的症状、症状出现时间和死亡时间，10分钟以上死亡的视为存活。

二、实验结果

1.知母皂苷灌胃给药对小鼠血小板聚集率的影响

知母皂甙末次灌胃给药1小时后进行麻醉心脏取血，检测给药后对ADP(20μM)诱导的血小板聚集率，结果显示，同对照组相比，AIII组、3∶1组和1∶1组的血小板最大聚集率均明显降低，其中AIII组和3∶1组血小板聚集抑制效应与阿司匹林组相当。说明知母皂甙AIII在体内对血小板聚集的抑制作用强于BII，但3∶1组仍有明显的抗血小板聚集活性。

表1.本发明的药物组合物体内给药对血栓形成的影响

注：与对照组比：^＊＊P＜0.01 ^＊P＜0.05

2.动-静脉旁路血栓形成实验

与正常对照相比各给药组的血栓湿重和干重均有下降的趋势，AIII组和3∶1组血栓湿重与对照组相比差异显著，1∶1组存在差异，但BII组和1∶3组与对照组相比没有统计学上的差异。从本实验的结果来看AIII在抗血栓方面占主导作用。AIII组的血栓湿重低于阳性对照药阿司匹林，说明AIII在抗血栓方面强于阿司匹林。具体实验结果如表2所示。

表2.本发明的药物组合物体内给药对血栓形成的影响

注：与对照组比：^＊＊P＜0.01    ^＊P＜0.05

3.3小鼠尾静脉胶原注射致死时间实验

小鼠尾静脉注入血栓剂后，出现呼吸加快、燥动不宁、旋转和眼球突出等症状，随后很快死亡。对照组的平均死亡时间为129.3±26.9秒，而单纯给予BII和AIII的动物死亡时间明显延长，分别为259.1±169.9秒、237.9±125.1秒，与对照组相比具有显著差异。两药合用的动物死亡时间与对照组相比也有一定程度的延长，但除3比1组外，其效果不如单纯用药组。3比1组动物死亡时间及存活率与单纯给药组相仿，说明AIII在组合给药中占主导作用。各组的具体存活率和死亡时间见表3和图1。

表3.本发明的药物组合物体内给药对小鼠尾静脉胶原注射致死时间的影响

注：与对照组比：^★★P＜0.01    ^★P＜0.05

3.2小鼠尾静脉出血时间实验

对照组的平均止血时间为88.9±45.9秒，与对照组相比给药组的出血时间明显延长，阳性对照阿司匹林组的平均止血时间为277.4±188.5秒，与正常对照组相比差异极显著。BII和AIII单纯用药时平均止血时间大于阳性对照药，这说明知母皂苷BII和AIII单独给药时有明显的出血倾向。同对照组相比，组合给药出血时间也有所延长，但出血体积明显少于单纯给药组及阿司匹林组。说明知母皂苷BII和AIII虽然具有强烈抗血栓的作用，但有明显的出血倾向；二者合理组合后(3比1组)，在产生抗血栓活性的同时，出血时间及总的出血量明显减少。具体结果如表4和图2所示。

表4.本发明的药物组合物体内给药对小鼠尾静脉出血时间及出血体积的影响

注：与对照组比：★★★P＜0.001  ★★P＜0.01  ★P＜0.05

与BII组比：###P＜0.001；##P＜0.01；#P＜0.05

与AIII组比：§§§P＜0.001；§§P＜0.01；§P＜0.05

三、讨论

体外活性筛选发现知母皂苷AIII具有明显的抑制血小板聚集作用，而知母皂苷BII具有明显的扩血管作用。动物体内实验结果显示，知母皂苷AIII抑制体内血小板聚集活性和抗大鼠动静脉旁路血栓形成作用最强，BII较弱，且知母皂苷不同组合也具有抗血小板聚集和抗血栓形成作用，尤其是知母皂苷AIII和BII的3∶1组合。

在尾静脉胶原注射致死实验中，具有抗血小板聚集作用的知母皂苷AIII和具有扩血管作用的知母皂苷BII均能明显延长模型小鼠的存活时间，提高模型小鼠的存活率，但小鼠断尾实验发现这两个化合物单独给药尾静脉出血时间延长，出血体积增加；同时实验也发现知母皂苷AIII和BII3∶1组合也有与单独给药相当的抗血栓形成作用，尾静脉出血时间虽有延长，但出血体积明显减少；知母皂苷其它比例组合尾静脉出血时间和出血体积虽有减少，但抗血栓活性也明显降低。实验表明，较强的抑制血小板聚集和适当的扩血管可达到体内最为理想的抗血栓效果。

因此，本实验的一个重要发现是以AIII比例为主的知母皂苷组合在体内可发挥最佳的抗血栓形成作用，同时具有较低的出血副作用。以此而开发的各种剂型的药物，用于各种心脑血管性疾病的治疗，可达到安全、高效的目的。

实施例2本发明的药物组合物体外抑制 血小板聚集作用的研究

一、材料与方法

1.实验材料

Wistar大鼠，雄性，体重280-320g，大耳白兔，雌性，体重2-2.5Kg，猕猴，雄性，体重5-7Kg，均由军事医学科学院动物养殖中心提供。人血小板由北京血液中心提供。本发明的药物组合物，为白色粉末，是根据实施例15中所述的方法制备的。二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、二甲基亚砜(DMSO)均为Sigma公司产品；瑞斯托霉素(Ristocetin)、肾上腺素购自Biopool公司。

2.实验方法

2.1血液的采集

Wistar雄性大鼠，2％戊巴比妥钠(30～40mg/kg)腹腔注射麻醉，心脏取血；大耳雌性白兔，在安静的状态下，耳中动脉取血，取血完成后立即以3.8％枸橼酸钠(体积比1∶9)抗凝。

2.2血小板的制备

将所取血液室温800rpm离心10分钟，取上层富血小板血浆(PRP)，室温3000rpm离心20分钟，取上层贫血小板血浆(PPP)。用F-820血细胞计数仪计数，以PPP调PRP浓度为3.0×10¹¹/L。

2.3血小板最大聚集率测定

Chronolog血小板聚集仪检测。用血浆将血小板悬液浓度调整到3.0×10¹¹/L，打开血小板聚集仪，以PPP做空白对照调节透光率到100％。取血小板悬液450μL，加入搅拌子37℃预温3分钟，分别加入各种诱导剂(50μL)：ADP试剂(终浓度为20μM)、AA(终浓度为80μM)、瑞斯托霉素(终浓度为1.2mg/mL)、肾上腺素(终浓度为10μM)，然后记录5分钟图形，读取1分钟、3分钟、5分钟及最大的聚集率。

二、实验结果

1.本发明的药物组合物体外抑制ADP诱导大鼠血小板聚集作用

对大鼠血小板预先给予不同浓度的本发明的药物组合物，孵育2分钟后，加入聚集诱导剂ADP，检测不同时间血小板聚集率。结果如表5所示，10μg/mL的本发明的药物组合物便能明显抑制大鼠血小板的聚集，随着本发明的药物组合物剂量的增加，抑制作用明显增强，本发明的药物组合物50μg/mL可完全抑制大鼠血小板的聚集。通过统计处理，计算出本发明的药物组合物抑制大鼠血小板聚集的IC₅₀值为26.92±4.75μg/mL。

表5.本发明的药物组合物对大鼠血小板聚集的抑制作用(n＝8)

注：最大聚集率与ADP组比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

2.本发明的药物组合物体外抑制兔子血小板聚集作用

兔子是抗血栓药物研究的常用动物之一，本实验观察了不同剂量的本发明的药物组合物对兔血小板聚集的抑制作用。结果如表6所示，10μg/mL的本发明的药物组合物可使ADP诱导的兔血小板最大聚集率抑制到23％，随着本发明的药物组合物剂量的增加，抑制作用明显增强，本发明的药物组合物60μg/mL可使兔血小板的最大聚集率抑制到80％。通过统计处理，计算出本发明的药物组合物抑制兔血小板聚集的IC₅₀值为16.1±2.1μg/mL。

表6.本发明的药物组合物对兔子血小板聚集的抑制作用(n＝3)

注：最大聚集率与ADP组比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.本发明的药物组合物体外抑制猕猴血小板聚集作用

猕猴的基因背景与人最为接近，本文继续观察了本发明的药物组合物对猕猴血小板聚集的抑制作用。实验发现50μg/mL的本发明的药物组合物可使ADP诱导的猕猴血小板最大聚集率抑制到13％，随着本发明的药物组合物剂量的增加，抑制作用明显增强，本发明的药物组合物150μg/mL可使猕猴血小板的最大聚集率抑制到90％。通过统计处理，计算出本发明的药物组合物抑制猕猴血小板聚集的IC₅₀值为79.16±5.31μg/mL。从中看出，本发明的药物组合物抑制猕猴血小板的IC₅₀值明显高于兔和大鼠。

表7.本发明的药物组合物对猕猴血小板聚集的抑制作用(n＝5)

注：最大聚集率与ADP组比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

4.本发明的药物组合物对不同诱导剂诱导人血小板聚集的体外抑制效果比较

在新鲜健康人血小板中预先加入不同浓度的本发明的药物组合物后，再以各种诱导剂诱导血小板聚集，得到的结果见表8～11。实验发现，ADP(20μM)、花生四稀酸(80μM)、瑞斯托霉素(1.2mg/mL)和肾上腺素(10μM)均能诱导人血小板聚集，聚集率均在50％以上。本发明的药物组合物20-25μg/mL均能有效抑制上述诱导剂引起的血小板聚集，随着本发明的药物组合物给药剂量的增加，抑制作用明显增强，本发明的药物组合物150-300μg/mL可完全抑制上述诱导剂引起的人血小板聚集。本发明的药物组合物抑制不同诱导剂引起的人血小板聚集的IC₅₀值见表12。

通过以上实验，不同来源的血小板对本发明的药物组合物的敏感性存在差异，但大剂量的本发明的药物组合物可完全抑制ADP、花生四稀酸、瑞斯脱霉素和肾上腺素诱导的人血小板聚集。提示本发明的药物组合物具有潜在的临床应用价值。

表8.本发明的药物组合物对ADP诱导人血小板聚集功能的影响(n＝5)

注：最大聚集率与ADP组比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表9.本发明的药物组合物对AA诱导的人血小板聚集功能的影响(n＝5)

注：5分钟最大聚集率与AA组比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表10.本发明的药物组合物对瑞斯托霉素诱导人血小板聚集功能的影响(n＝5)

注：最大聚集率与瑞斯托霉素组比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表11.本发明的药物组合物对肾上腺素诱导人血小板聚集功能的影响(n＝5)

注：最大聚集率与肾上腺素组比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表12.本发明的药物组合物对不同诱导剂引起人血小板聚集的IC₅₀值

实施例3.本发明的药物组合物体内给药 抑制血栓形成作用研究

一、材料与方法

1.实验材料

Wistar大鼠，雄性，体重280～320g，由军事医学科学院实验动物中心提供。知母皂苷BII和AIII组合物是根据实施例5中所述的方法制备得到的。肝素，购自美国Sigma公司。生理盐水，购自北京双鹤药业股份有限公司。阿司匹林，石家庄制药集团欧意药业有限公司。出凝血时间(PT、TT和APTT)试剂盒购于上海太阳生物技术公司。

2.实验方法

2.1动物分组

将Wistar大鼠随机分为五组，即空白对照组、阿斯匹林40mg/kg组、本发明的药物组合物10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg组，各组动物连续灌胃给药七天，每日给药一次，给药体积为10mL/kg，第七天给药后1h施行手术，空白对照组给予等体积蒸馏水。

2.2大鼠动-静脉旁路血栓形成实验

参考文献方略加改进。将大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(30-40mg/kg)麻醉，仰卧位固定，分离右侧颈总动脉和左颈外静脉，将三段聚乙烯管相连，一端插入右颈总动脉，另一端插入左颈外静脉，两端聚乙烯管内充满25u/mL肝素(以生理盐水临用新制)，中间段长10cm，放入一根长为8cm的7^#手术线(已称重)，管内注满生理盐水(注意：不得有气泡)，建立动静脉旁路。20分钟后取下套管，取出血栓，在湿润的滤纸上滚动，去除多余浮血，置已称重的硫酸纸上称湿重。再置于烘箱内60℃烘烤1h至恒重，冷却称重得血栓干重。

2.3PRP和PPP的制备

Wistar雄性大鼠，第7天给药1小时后，戊巴比妥钠(30～40mg/kg)腹腔注射麻醉，心脏取血，以3.8％枸橼酸钠(体积比1∶9)抗凝。于室温800rpm离心10分钟，取上层富血小板血浆(PRP)，室温3000rpm离心20分钟，取上层贫血小板血浆(PPP)。用F-820血细胞计数仪计数，以PPP调PRP浓度为3.0×10¹¹/L。

2.4血小板最大聚集率的检测

Chronolog血小板聚集仪检测。用血浆将血小板悬液浓度调整到3.0×10¹¹/L，打开血小板聚集仪，以PPP做空白对照调节透光率到100％。取血小板悬液450μL，加入搅拌子37℃预温3分钟，分别加入诱导剂(50μL)ADP试剂(终浓度为20μM)，然后记录5分钟图形，读取1分钟、3分钟、5分钟及最大的聚集率。

2.5出凝血时间的测定

取血、分离血浆后，参照试剂盒说明书操作。

二、实验结果

1.本发明的药物组合物灌胃给药对大鼠大鼠动静脉旁路血栓形成的影响

本发明的药物组合物灌胃给药，给药剂量分别为40、20和10mg/Kg，每日一次，阿司匹林40mg/Kg为阳性对照，给药后第七天进行颈动-静脉旁路血栓形成实验。结果显示本发明的药物组合物大剂量组和中剂量组血栓干重和湿重较对照组均明显降低，其中以大剂量组降低最为明显，小剂量组血栓重量低于对照组，但无明显差异。阿司匹林阳性对照组血栓干、湿重略高于大剂量组，同对照组相比有明显差异。这些结果说明本发明的药物组合物具有抑制体内血栓形成的作用。

表13.本发明的药物组合物灌胃给药对大鼠颈动静脉旁路血栓形成的影响

注：同对照组相比，＊＊p＜0.01；＊p＜0.05

2.本发明的药物组合物灌胃给药对大鼠血小板聚集率及出凝血时间的影响

本发明的药物组合物给药方式及分组同第三部分，大鼠给药后第七天进行心脏取血，同批检测ADP诱导血小板聚集率和出凝血时间(PT、TT和APTT)。结果显示本发明的药物组合物三个剂量组的血小板聚集率均明显低于对照组，并具有一定的剂量效应。阿司匹林组血小板聚集率低于对照组，但无明显差异。本发明的药物组合物各处理组PT、TT和APTT同对照组相比均没有统计学差异；阿司匹林组除APTT同对照组相比有明显延长外，其余两个指标同对照组相比没有明显差异。上述结果表明，本发明的药物组合物体内给药可抑制血小板聚集，阻止血栓形成，但不影响出凝血时间。

表14.本发明的药物组合物灌胃给药对大鼠ADP诱导血小板聚集率的影响

注：同对照组相比，＊＊p＜0.01；＊p＜0.05

表15.口服给药后对大鼠凝血参数APTT、PT、TT的影响

注：与正常对照组相比，＊P＜0.05

实施例4.本发明药物组合物对局灶性脑缺血大鼠 运动感觉功能的影响

缺血性脑血管病(主要指脑血栓形成)的最佳治疗时间窗是发病6小时以内，积极的治疗措施有望使损伤减少到最低限度。然而，大多数脑缺血患者多在睡眠等安静状态发生，加之运送、影像学检查等原因不能及时救治而残留偏瘫、失语等后遗症，因此对于脑缺血亚急性期及恢复早期的治疗干预显得尤为重要。本实验拟通过大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，于病理改变的亚急性期：缺血后3-14天，给予本发明的组合物，以探讨本发明的药物组合物对脑缺血损伤大鼠运动功能的影响，为本发明的药物组合物合理应用于临床提供一定实验依据。

一、材料和方法

1.实验动物

SD大鼠，雄性，体重280-300g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2002-2003。

2.实验药品

本发明的药物组合物，按实施例6的方法制备。

3.实验方法

3.1大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型的制备

大鼠用10％水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定，常规消毒皮肤，颈正中切口，分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，穿线备用，结扎颈外动脉与颈总动脉，以动脉夹夹闭颈内动脉远心端后，于颈外动脉与颈内动脉分叉处作一切口，从切口处插入头端磨成球形的光滑尼龙线(直径0.25mm，头端直径0.27mm，距头端18mm处作标记)，有阻力感时停止进线并记录缺血时间，插入深度18mm左右，实现大脑中动脉阻塞导致脑缺血。结扎切口处，固定尼龙线，逐层缝合肌肉和皮肤，消毒。2小时后将尼龙线头端轻轻拔出到近切口处，实现再灌注。假手术组只暴露和分离右侧颈总动脉。脑缺血及再灌注过程中保持室温23℃，常规分笼饲养。

3.2模型成功的判定

按照Zea Longa 5级评分法(请注明文献出处)，大鼠完全清醒后进行评定，评分标准：无明显神经病学症状，0分；不能完全伸展左侧前爪，1分；向左侧旋转，2分；行走时向左侧倾倒，3分；不能自行行走，4分。1-3分的大鼠入选后续的实验。

3.3分组及给药

将神经症状1-3分的大鼠分成5组：模型组；本发明的药物组合物15mg/kg(低)、30mg/kg(中)、60mg/kg(高)给药组；安宫牛黄丸(请注明生产厂家及其批号)400mg/kg作为阳性对照组。假手术与模型组给等量0.5％CMC溶液。术后3天至14天灌胃给药，每天一次。

3.4肢体运动感觉功能检测

3.4.1横木行走实验

横木行走实验[Feeney DM et al，Science，1982，217：855-857]评价运动的协调和整合缺损。横木宽2.0cm，长120cm，厚1cm，，距地面80cm水平悬空放置，横木一端连接一个暗盒(长25cm，宽22cm，高18cm)，用噪音刺激大鼠通过横木走进暗盒。评分标准：大鼠不能呆在横木上，0分；大鼠能呆在横木上但不动，1分；大鼠试图通过，但从横木摔下，2分；大鼠走上横木，但损伤的后肢滑落次数超过50％，3分；超过1次但不到50％，4分；仅滑落1次，5分；顺利通过，6分。缺血前训练2天，让大鼠学会顺利走过横木。以缺血后3，7，10，14天为观察时间点分别进行检测。

3.4.2触觉刺激实验

评价躯体感觉和精细运动执行功能(请注明该方法的文献出处)。用相同面积(0.7cm×0.7cm)的医用胶布贴在大鼠左前肢腕部腹侧面作为触觉刺激，记录大鼠揭除胶布的潜伏期。术前训练2天，1次/天，使大鼠能够在20秒内完成揭除胶布的动作。以缺血后3，7，10，14天为观察时间点分别进行检测。

3.5取材

检测结束后，大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉(0.35g/kg)，经左心室插管，分别用37度生理盐水及预冷的4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.2)灌注，大鼠僵硬后断头取脑，浸泡于4％多聚甲醛溶液中固定24小时，常规脱水，石蜡包埋，取前囟前2.2mm-前囟前1.7mm组织块，冠状位连续切片，脑片厚3μm。

3.6组织病理学及免疫组织化学染色

每组取5例进行HE染色及免疫组织化学染色(Sp两步法)。200倍光学显微镜下，每张切片在梗死周围区选取3个固定视野拍照，用Image-Pro Plus(v.5.1，Silver Spring，Maryland，USA)软件进行图象分析，观察皮层运动感觉区神经细胞的形态结构，计数200倍视野(HP)内神经细胞的数目，即：n/200HP；测定梗死灶周围脑组织VEGF阳性细胞(细胞浆出现棕黄色颗粒)的积分光密度(IOD)以及微血管的密度(MVD)，按Weidner等[Weidner N.et al，N Engl JMed，1991，324：1-8.]方法进行，凡染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管计数，不以出现血管腔为唯一计数标准，计算出每m²面积内微血管的数量，取3个视野的均值作为测定结果。

3.7统计方法

运用Windows适用的SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析，数值采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

二、实验结果

1.本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠运动感觉功能的影响

1.1本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠横木行走能力的影响

由表16可见，假手术组大鼠横木行走能力没有变化，各缺血组大鼠横木行走能力明显降低，观察期内未恢复到正常水平。本发明的药物组合物30mg/kg、60mg/kg给药组、安宫牛黄丸组能够促进大鼠行走能力的恢复，与模型组比较，在术后14天P＜0.05，P＜0.01。

表16本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠横木行走能力的影响(x±s)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较#P＜0.01

1.3本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠触觉刺激反应的影响

各缺血组大鼠缺血对侧前肢的触觉敏感度以及精细运动执行能力明显减弱，虽然在观察期中逐渐有所恢复，但14天后该指标仍显著低于正常组。与模型组比较，本发明的药物组合物30mg/kg、60mg/kg给药组明显缩短大鼠揭除胶布的潜伏期，P＜0.05。

表17.本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠触觉刺激的影响(x±s)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较#P＜0.01

2.本发明组合物对脑缺血再灌注大鼠皮层运动感觉区神经元损伤的影响

模型组大鼠皮层运动感觉区以及新纹状体神经细胞大量变性坏死，排列散乱，胞膜胞核轮廓不清，胞核固缩深染，胞体皱缩，神经元密度降低，神经元脱失明显，间质疏松呈筛状。本发明的药物组合物30mg/kg、60mg/kg给药组，安宫牛黄丸组与模型组相比，神经元数量明显增多，变性坏死组织范围较小、程度较轻。

表18.本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠皮层运动感觉区神经元数目的影响(x±s)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与假手术组比较#P＜0.01

3.本发明组合物对脑缺血再灌注大鼠血管新生及VEGF表达的影响

假手术组大鼠，在皮层及纹状体可见少量棕黄色的微血管及VEGF呈阳性的神经元和内皮细胞；脑缺血各组大鼠，皮层及纹状体梗死周围区可见大量神经元，胶质细胞和内皮细胞均呈VEGF阳性，散布或丛集呈簇的CD34阳性细胞及其形成的毛细血管分布于梗死周围区，并向梗死中心区延伸。其中本发明的药物组合物30mg/kg、60mg/kg给药组、安宫牛黄丸组与模型组比较：VEGF表达明显增多，微血管数目明显增加；P＜0.05，P＜0.01。

表19.本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠血管新生的影响(x±s)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与假手术组比较#P＜0.01

表20.本发明的药物组合物对脑缺血再灌注大鼠VEGF表达的影响(x±s)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，与假手术组比较#P＜0.01

三、讨论

大鼠局灶性脑组织缺血再灌注后，损伤导致皮层运动感觉区及新纹状体大量神经细胞变性坏死，肢体运动感觉功能发生障碍，运动协调平衡能力明显降低，尽早建立缺血组织的血液供应是神经功能恢复的关键环节。本研究在缺血后的亚急性期(第3-14天)，通过本发明组合物(30mg/kg、60mg/kg)给药干预后，大鼠的感觉运动功能得到明显改善，与模型组比较，能够提高大鼠横木行走的能力，缩短揭除胶布的潜伏期，减轻皮层运动感觉区的神经细胞损伤，升高梗死周围区VEGF的表达以及微血管的数目，P＜0.05，P＜0.01。总之，本发明组合物可加快大鼠局灶性脑缺血后运动感觉功能的恢复，其可能的机制是促进了大脑VEGF的表达和微血管的新生。

实施例5.本发明药物组合物的制备

知母新鲜根茎3Kg，切薄片，加70％乙醇8L浸泡1小时，回流提取，过滤，药渣再加70％乙醇6L回流提取两次。合并提取液，回收乙醇，减压浓缩至10L。将预先处理好的大孔吸附树脂SP825(日本三菱公司)装柱(4L)，水平衡。浓缩液过滤，滤液通入色谱柱，依次用4BV(4倍柱体积)水和4BV的20％乙醇洗除杂，再用4BV的70％乙醇和3BV的95％乙醇洗脱，70％部分洗脱液回收乙醇，浓缩至1000mL，冷冻干燥，得原生总皂苷81g。知母新鲜根茎9Kg，切薄片，加水24L，与37℃水浴保温72h自然发酵。过滤，滤液舍去，药渣用18L甲醇回流提取1小时，过滤，药渣再用18L甲醇同样回流提取两次。合并甲醇提取液，回收部分溶剂，析出沉淀，干燥，称重得212g粗AIII样品。HPLC-ELSD法测定原生总皂苷中知母皂苷BII含量为58.7％，粗AIII中知母皂苷AIII的含量为55.4％。取80g原生总皂苷和210g粗AIII混合均匀即得本发明的药物组合物。分别用HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为40.9％和16.1％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为82.7％。

实施例6.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加水48L，浸泡1小时，加热煎煮1小时，过滤；药渣再加水36L煎煮2次，过滤。合并滤液，减压浓缩至30L，离心，上清液备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP700(日本三菱公司)装柱(18L)，水平衡。备用上清液通入平衡好的SP700树脂柱，水平衡。提取浓缩液过滤，滤液上样，用水洗除去杂质。之后依次用4BV的25％乙醇、4BV的90％乙醇洗脱。90％部分洗脱液回收乙醇，浓缩至5000mL。取其中1000mL冷冻干燥，得原生总皂苷78g。另外4000mL加水稀释到15000mL，加入20mL的β-葡萄糖苷酶混匀后放在50℃水浴中保温转化24h。转化后溶液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘10h至干燥，得次生总皂苷213g，粉碎成粉末状。分别用HPLC-ELSD法测定原生总皂苷和次生总皂苷中知母皂苷BII和AIII的含量为52.6％和66.3％。取75g原生总皂苷和180g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为47.1％和15.6％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为88.5％。

实施例7.本发明药物组合物的制备

知母须根8Kg，切咀，加入60％乙醇48L，浸泡1小时，回流提取1小时，过滤；药渣再加60％乙醇48L回流提取两次，过滤。合并滤液，减压回收乙醇至20L，加乙醇至浓度为30％，静置备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP700(日本三菱公司)装柱(10L)，30％乙醇平衡。上述备用提取液离心，上清液通入平衡好的树脂柱，依次用4BV的30％乙醇、4BV的90％乙醇洗脱，收集90％乙醇部分，回收乙醇，浓缩至4000mL。取其中2000mL冷冻干燥，得原生总皂苷165g。另外2000mL加水稀释到3200mL后，加入30mL果胶酶(NCB-PE40)混匀后放在50℃水浴中保温转化12h。转化后溶液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘6h至干燥，得次生总皂苷119g。HPLC-ELSD法测定原生总皂苷中知母皂苷BII和AIII的含量为19.2％和32.6％，次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量为61.3％。取100g原生总皂苷和100g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为47.2％和9.7％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为79.4％。

实施例8.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加30％乙醇48L，浸泡1小时，回流提取1小时，过滤；药渣再加30％乙醇36L同样回流提取2次。合并醇提液，备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP825(日本三菱公司)装柱(18L)，30％乙醇平衡。备用上清液通入平衡好的SP825树脂柱，30％乙醇洗4BV除去杂质，再依次用4BV的50％乙醇和3BV的80％乙醇洗脱，最后用3BV的95％乙醇再生色谱柱。收集50％和80％乙醇洗脱液，分别回收乙醇，减压浓缩。50％乙醇浓缩液冷冻干燥得粗BII为113g，80％乙醇浓缩液干燥得粗AIII为221g。HPLC-ELSD法测定粗BII和粗AIII中知母皂苷BII和AIII的含量为61.2％和55.9％。取110g粗BII和150g粗AIII混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为32.4％和26.2％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为83.3％。

实施例9.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加水48L，浸泡1小时，加热煎煮1小时，过滤；药渣再加水36L同样煎煮2次。合并提取液，减压浓缩至30L，加乙醇至浓度为30％，摇匀后放置过夜，离心，上清液备用。将预先处理好的大孔吸附树脂HP20(日本三菱公司)装柱(18L)，30％乙醇平衡。备用上清液通入平衡好的HP20树脂柱，4BV的30％乙醇洗除去杂质，再依次用4BV的50％乙醇和4BV的80％乙醇洗脱，最后用3BV的95％乙醇再生色谱柱。收集50％和80％乙醇洗脱液。80％乙醇浓缩液干燥得粗AIII为125g。50％乙醇部分回收乙醇，浓缩至4000ml。将50％乙醇浓缩液取出1500mL冷冻干燥得粗BII为153g。将另外2500mL溶液加水稀释到7000mL后，加入40mL的复合果浆酶(NCB-PE200)混匀后放在50℃摇床中，以120转/分钟，转化36h。转化后溶液离心得沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘6h至干燥，得次生总皂苷183g。HPLC-ELSD法测定粗BII中知母皂苷BII的含量为53.2％，粗AIII以及次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量57.1％和64.3％。取50g粗BII、120g粗AIII和180g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定本发明的药物组合物中知母皂苷AIII和BII的含量52.7％和7.8％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为85.8％。

实施例10.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加50％乙醇48L，浸泡1小时，回流提取1小时，过滤；药渣再加50％乙醇36L同样回流提取2次。合并提取液，减压回收乙醇浓缩至6L，加入水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层，浓缩得原生总皂苷551g。取原生总皂苷500g用水10000mL溶解后，加入110mL的纤维素酶(AE80)混匀后放在50℃摇床中，以120转/分钟，转化36h。转化后溶液离心得沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘6h至干燥，得次生总皂苷283g。HPLC-ELSD法测定粗BII中知母皂苷BII的含量为44.1％，次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量为62.3％。取50g原生总皂苷和280g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定BII和AIII组合物中知母皂苷AIII和BII的含量53.7％和6.9％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为86.1％。

实施例11.本发明药物组合物的制备

知母新鲜根茎6Kg，切薄片，加入70％乙醇8L，浸泡2小时，加热回流提取1小时，过滤；药渣再加70％乙醇6L同样回流提取2次。合并提取液，回收乙醇，减压浓缩至10L。将预先处理好的大孔吸附树脂SP700(日本三菱公司)装柱(6L)，20％乙醇平衡。提取浓缩液加乙醇至20％，过滤，滤液通入色谱柱，依次用4BV的20％乙醇、4BV的80％乙醇和3BV的95％乙醇洗脱，80％的乙醇回收溶剂，浓缩至小体积，得2000mL。取500mL冷冻干燥得原生总皂苷56g。剩余1500mL稀释到7000mL，加入200mL苦杏仁酶液，混匀后放在37℃摇床中，以120转/分钟转速，转化24h。转化后溶液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘干，得次生总皂苷105g。HPLC-ELSD法测定原生总皂苷中知母皂苷BII的含量为43.3％，次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量为55.6％。取50g原生总皂苷和100g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为37.5％和14.7％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为73.5％。

实施例12.本发明药物组合物的制备

知母新鲜根茎6Kg，切薄片，加入60％乙醇8L，浸泡2小时，超声波振荡器超声提取0.5h，过滤；药渣再加60％乙醇6L同样超声提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩至10L，加丙酮到20％备用。将预先处理好的大孔吸附树脂AB-8(天津南开化工厂)装柱(6L)，20％丙酮平衡。备用的20％丙酮溶液通入色谱柱，依次用4BV的20％丙酮、4BV的80％丙酮洗脱，收集80％丙酮部分，回收丙酮，浓缩至2000mL。取500mL冷冻干燥得原生总皂苷43g。剩余1500mL稀释到7000mL，加入200mL苦杏仁酶液，混匀后放在37℃水浴中保温转化24h。转化后溶液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘6小试至干燥，得次生总皂苷94g。分别用HPLC-ELSD法测定原生总皂苷和次生总皂苷中知母皂苷BII和AIII的含量为54.1％和62.3％。取43g原生总皂苷和90g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。分别用HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII、BII的含量和用紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量。BII为17.3％，AIII为42.7％，总皂苷为83.4％。

实施例13.本发明药物组合物的制备

知母新鲜根茎9Kg，切薄片，加入40％丙酮24L，浸泡2小时，超声波振荡器超声提取0.5h，过滤；药渣再加40％丙酮18L同样超声提取2次。合并提取液，回收丙酮，减压浓缩至10L。将预先处理好的大孔吸附树脂D-101(天津农药厂)装柱(12L)，水平衡。提取浓缩液通入色谱柱，依次用4BV的水、4BV的15％丙酮、4BV的70％丙酮洗脱，收集70％的丙酮部分，回收溶剂，浓缩至3000mL。取500mL冷冻干燥得原生总皂苷46g。剩余2500mL稀释到11000mL，加入54mL的β-葡聚糖酶(NCB-10)，混匀后放在50℃水浴中保温转化20h。转化后溶液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘干，得次生总皂苷163g。HPLC-ELSD法测定原生总皂苷中知母皂苷BII的含量为56.2％，次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量为63.5％。取40g原生总皂苷和160g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为51.3％和11.2％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为87.5％。

实施例14.本发明药物组合物的制备

知母须根12Kg，切咀，加入水48L，浸泡1小时，超声波振荡器超声提取0.5h，过滤；药渣再加入水36L同样超声提取2次，过滤，合并滤液，减压浓缩20L，加乙醇至浓度为30％，静置备用。将预先处理好的大孔吸附树脂D-101(天津农药厂)装柱(8L)，30％乙醇平衡。上述备用提取液离心，上清液通入平衡好的树脂柱，依次用4BV的30％乙醇、3BV的80％乙醇和3BV的95％乙醇洗脱，收集80％乙醇部分浓缩至2000mL。取400mL冷冻干燥得原生总皂苷21g，剩余1600mL加入黑曲霉培养液2000mL，混匀后放在37℃水浴中保温转化20h。转化后溶液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘干，得次生总皂苷63g。HPLC-ELSD法测定原生总皂苷中知母皂苷BII 44.3％，次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量为52.3％。取20g原生总皂苷和60g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为39.5％和11.2％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为71.8％。

实施例15.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加水48L，浸泡1小时，加热煎煮1小时，过滤；药渣加水再同样煎煮2次。合并提取液，减压浓缩至30L，加乙醇至浓度为35％，摇匀后放置过夜，离心，上清液备用，沉淀干燥另收。将预先处理好的大孔吸附树脂HP20(日本三菱公司)装柱(18L)，35％乙醇平衡。备用上清液通入平衡好的HP20树脂柱，先用4BV的35％乙醇除去杂质，再用4BV的85％乙醇洗脱，最后用3BV的95％乙醇再生色谱柱。收集85％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩至3000mL。取浓缩液600mL冷冻干燥得原生总皂苷52g。将另外2400mL溶液加1000mL醋酸盐缓冲盐(pH＝4)，混匀后放在37℃摇床中，以120转/分钟，转化24h。转化后溶液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘干，得次生总皂苷166g。HPLC-ELSD法测定原生总皂苷中BII的含量为50.2％，次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量为57.1％。取40g原生总皂苷和165g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为46.1％和10.4％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为81.5％。

实施例16.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加水48L，浸泡1小时，加热煎煮1小时，过滤；药渣加水再同样煎煮2次。合并提取液，减压浓缩至30L，加丙酮至浓度为15％，摇匀后放置过夜，离心，上清液备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP825(日本三菱公司)装柱(18L)，15％丙酮平衡。备用上清液通入平衡好的SP825树脂柱，15％丙酮洗4倍柱体积(4BV)除去杂质，再用4BV的70％丙酮洗脱。收集70％丙酮洗脱液，回收乙醇，浓缩至5000mL。将浓缩液取出1500mL冷冻干燥得粗BII为87g。将另外3500mL溶液，加入硫酸，调pH至2-3，混匀后水解转化2h。转化液离心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱内80℃烘干，得次生总皂苷113g。HPLC-ELSD法测定原生总皂苷中知母皂苷BII的含量为55.6％，次生总皂苷中知母皂苷AIII的含量为46.3％。原生总皂苷和次生总皂苷混匀，得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定知母皂苷AIII和BII的含量为26.7％和24.3％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为73.7％。

实施例17.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片2Kg，适当粉碎，加50％乙醇16L，浸泡1小时，回流提取1小时，过滤；药渣再加50％乙醇12L同样回流提取2次。合并醇提液，回收乙醇，减压浓缩至10L，上清液备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP700(日本三菱公司)装柱(8L)，水平衡。备用上清液通入平衡好的SP700树脂柱，水洗4BV，再用30％乙醇洗4BV除去杂质，再用3BV的50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩至约1500mL。浓缩液反复通入C18柱色谱，以55％甲醇恒定比例洗脱，最后得BII(百分面积法含量大于95％)32g。知母新鲜根茎24Kg，切薄片，加水48L，与37℃水浴保温72h自然发酵。过滤，滤液舍去，药渣用48L甲醇回流提取1小时，过滤，药渣再用48L甲醇同样回流提取两次。合并甲醇提取液，回收部分溶剂，析出沉淀，沉淀用甲醇反复重结晶，得AIII纯品(百分面积法含量大于95％)181g。(或者将甲醇提取液通过硅胶柱色谱，氯仿-甲醇-水系统洗脱得到AIII纯品)。取20g BII和180g AIII混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定本发明的药物组合物中知母皂苷AIII和BII的含量为83.7％和9.2％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为99.4％。

实施例18.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加40％乙醇48L，浸泡1小时，加热回流1小时，过滤；药渣再加40％乙醇36L同样回流2次。合并提取液，减压回收乙醇浓缩至6L，再加乙醇至20％，摇匀后放置过夜，离心，上清液备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP700(日本三菱公司)装柱(8L)，20％平衡。备用上清液通入平衡好的SP700树脂柱，20％乙醇洗4BV除去杂质，再用3BV的90％乙醇洗脱，收集90％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩至约1500mL。冷冻干燥得样品498g。即为本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定其中知母皂苷AIII和BII的含量25.3％和12.5％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为56.4％。

实施例19.本发明药物组合物的制备

中药知母饮片6Kg，适当粉碎，加40％乙醇48L，浸泡1小时，加热回流1小时，过滤；药渣再加40％乙醇36L同样回流2次。合并提取液，减压回收乙醇浓缩至6L，再加乙醇至25％，摇匀后放置过夜，离心，上清液备用。将预先处理好的大孔吸附树脂SP700(日本三菱公司)装柱(8L)，20％平衡。备用上清液通入平衡好的SP700树脂柱，25％乙醇洗4BV除去杂质，再用3BV的50％乙醇和85％乙醇洗脱，收集50％和85％乙醇洗脱液，回收乙醇，减压浓缩分别冷冻干燥得原生总皂苷152g和次生总皂苷316g。取150g原生总皂苷和300g次生总皂苷混合均匀即得本发明的药物组合物。HPLC-ELSD外标两点法测定本发明的药物组合物中知母皂苷AIII和BII的含量为27.6％和13.5％，紫外分光光度法测定知母总皂苷的含量为60.3％。

Claims (13)

1.用于预防或治疗血栓性疾病的药物组合物，其包含有效量的知母皂苷AIII和知母皂苷BII，以及一种或多种药用辅料，其特征在于其中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量

知母皂苷AIII    知母皂苷BII。

2.用于预防或治疗血栓性疾病的药物组合物，其包含有效量的知母皂苷AIII和知母皂苷BII，该知母皂苷AIII和知母皂苷BII以知母皂苷提取物形式用于该药物组合物中，其特征在于其中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。

3.根据权利要求1或2的药物组合物，其中知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为1∶1至10∶1。

4.根据权利要求1或2的药物组合物，其中知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为2∶1至5∶1。

5.根据权利要求1或2的药物组合物，其中知母皂苷AIII和知母皂苷BII的重量比为3∶1。

6.根据权利要求1或2的药物组合物，其中该药物组合物被制成胶囊、片剂、颗粒剂或注射剂。

7.知母皂苷AIII和知母皂苷BII在制备用于预防或治疗血栓性疾病和血栓相关性疾病的药物中的用途，其特征在于在所制备的药物中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。

8.根据权利要求7的用途，其中知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为1∶1至10∶1。

9.根据权利要求6的用途，其中知母皂苷AIII与知母皂苷BII的重量比为2∶1至5∶1。

10.根据权利要求6的用途，其中知母皂苷AIII和知母皂苷BII的重量比为3∶1。

11.根据权利要求6至8任意一项的用途，其中所述血栓性疾病选自冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑卒中、脑血栓、脑梗塞、肺栓塞、糖尿病和脉管炎。

12.一种制备权利要求1至6任意一项的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

使用40～70％的C₁-C₄醇或40～70％丙酮提取知母饮片、新鲜根茎或须根，将提取液过滤，收集滤液并离心，然后将上清液注入大孔吸附树脂柱，用选自水、20～90％的C₁-C₄醇和10～80％丙酮的溶剂梯度洗脱，收集50～90％C₁-C₄醇组分或35～80％丙酮组分，得到所述知母原生总皂苷；

使用选自β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、纤维素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的一种或几种酶或微生物转化所述组分足够长的时间，将转化溶液离心后得到知母次生总皂苷；

以及将一定比例的上述知母原生总皂苷和次生总皂苷混合得到本发明的药物组合物。

13.根据权利要求12的方法，它包括如下步骤：

用40～70％的乙醇提取知母饮片、新鲜根茎或须根，将提取液过滤并收集滤液，减压浓缩后加入90～100％乙醇，离心，然后将上清液装入大孔吸附树脂柱，用20～95％乙醇梯度洗脱，收集50～90％乙醇组分，得到所述知母原生总皂苷；

使用选自β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、纤维素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的一种或几种酶或微生物转化所述组分至少1小时，将转化溶液离心后得到知母次生总皂苷；

以及将一定比例的上述知母原生总皂苷和次生总皂苷混合得到本发明的药物组合物。

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