CN110025717B - 知母皂苷酶解转化物在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了知母皂苷酶解转化物在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用。本发明所提供的应用中，所述知母皂苷酶转化物的制备包括：将知母提取物以β‑葡萄糖苷酶酶解转化，得到知母皂苷酶转化物。本发明中，以知母皂苷酶解转化物为抑制皮肤浅表真菌的活性药物成分，其对于真菌的最低抑菌浓度为4μg/ml，抑菌能力明显优于知母总皂苷，在治疗皮肤浅表真菌疾病方面具有一定的应用前景。

Description

知母皂苷酶解转化物在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及知母皂苷酶解转化物及知母皂苷AⅢ在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用。

背景技术

浅部真菌病是由致病真菌或条件致病真菌感染人体毛发、皮肤、指甲和趾甲等浅表组织而引起的一组疾病。据报道，在国内人群中，浅部真菌病的患病率达20％～25％，发病率呈逐年增加趋势。临床常见的致病性或条件性真菌主要有红色毛癣菌、须癣毛癣菌、紫毛毛癣菌、白色念珠菌、新生隐球菌、石膏样小孢子菌、着色芽生菌等，可引起甲癣、手癣、足癣、头癣、体癣、股癣、甲真菌病等疾病，这些疾病病程长、容易复发或再感染，对患者的健康、工作、社交及日常生活造成了非常大的影响，大部分患者因为瘙痒等症状严重影响睡眠或工作及生活。

目前，临床上对皮肤浅表真菌感染疾病的防治主要是采用西药制剂，包括以霉唑、益康唑、咪康唑、酮康唑为代表的咪唑类药物和以萘替芬、特比萘芬和布替萘芬为代表的丙烯胺类抗真菌药物。但因疗程长或涂药局部不适等因素易造成患者依从性差等问题，还可因局部药物渗透性差等因素导致疗效不佳及复发率高等问题。随着抗真菌药物的广泛应用，真菌的耐药问题日益凸显，抗真菌病药物的需求急速增长，发现新型、高效低毒、选择性好的抗浅部真菌感染药物成为医药界十分紧迫的课题。

我国拥有种类繁多，资源丰富的中草药，中医药在预防皮肤病方面有其特有的优势，能够发挥其重要意义。知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根茎，味苦，性寒，归肺、胃、肾经，具有清热泻火，滋阴润燥的功效。知母中富含甾体皂苷、双苯吡酮类、黄酮类、木脂素类、多糖类、有机酸类及微量元素等成分。其中，甾体皂苷类为主要成分，其在根茎中的量约为6％，且种类繁多。

现代药理对知母甾体皂苷类进行了大量的研究，发现知母具有改善记忆力、抑制血小板聚集、抗氧化和降血糖等药理作用。此外，现有技术(例如CN1768823A等)中，也报道了知母总皂苷具有较好的抗皮肤真菌作用。然而，知母总皂苷对三种皮肤癣菌(石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌和絮状表皮癣菌)的最低抑菌浓度(MIC)分别为97.7、781.3和781.3μg/ml，抑菌效果仍难以达到令人满意的水平。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种知母皂苷酶解转化物在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

知母皂苷酶解转化物在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用，其中，所述知母皂苷酶转化物的制备包括：将知母提取物以β-葡萄糖苷酶酶解转化，得到知母皂苷酶转化物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中，以知母皂苷酶解转化物为抑制皮肤浅表真菌的活性药物成分，其对于真菌的最低抑菌浓度为4μg/ml，抑菌能力明显优于知母总皂苷，在治疗皮肤浅表真菌疾病方面具有一定的应用前景。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于知母皂苷在抑菌方面所存在的潜在应用前景，以及知母总皂苷在抑菌性能上所存在的不足之处，本发明特提供了一种以知母皂苷酶解转化物为有效物质，制备抑制皮肤浅表真菌药物的应用方法，有望实现对于浅部真菌病的低剂量治疗。

本发明一方面提供了知母皂苷酶解转化物在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用，其中，所述知母皂苷酶转化物的制备包括：将知母提取物以β-葡萄糖苷酶酶解转化，得到知母皂苷酶转化物。

知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ是知母中两种重要的甾体皂苷，其中知母皂苷BⅡ作为知母中主要有效成分，含量高达10％，而知母皂苷AⅢ在知母中含量很低，仅为知母皂苷BⅡ的1/20左右。知母皂苷BⅡ体内代谢过程研究表明，知母皂苷BⅡ在体内可脱去一分子糖转化成知母皂苷AⅢ。基于此，本发明中采用体外生物酶解技术对知母皂苷提取物进行酶解转化，得到以知母皂苷AⅢ为主要成分的酶解转化物，其抑菌效果明显优于知母皂苷提取物和现有技术中所用知母总皂苷，具有良好的应用前景，同时这也为皮肤浅表真菌疾病的治疗提供更多的选择性。

在本发明的一些实施方式中，所述知母提取物的制备主要包括：将知母以溶剂提取，得到知母提取物；

优选的，所述知母包括：知母药材以及知母饮片中的一种或两种；

优选的，知母提取所用溶剂包括：乙醇，乙醇(水)溶液以及水等常规提取溶剂。

在本发明更优选的一些实施方式中，还包括：将知母以溶剂提取后所得提取液进行浓缩和干燥，以得到以浸膏或者干燥粉形式存在的知母提取物的步骤。

在本发明的一些实施方式中，知母提取物以β-葡萄糖苷酶酶解转化的步骤包括：

将知母提取物与β-葡萄糖苷酶在溶液中孵育，得到知母皂苷酶转化物；

优选的，β-葡萄糖苷酶的酶活力为：10-100U/mg。

在本发明优选的一些实施方式中，孵育所用溶液为缓冲溶液；

优选的，孵育所用溶液包括：醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

更优选的，所述缓冲溶液的pH为3.79-4.95(例如，但不限于4.0,4.2,4.5,4.7等)。

在本发明优选的一些实施方式中，所述孵育的温度为35-55℃(例如可以为，但不限于40,45,50℃等)，孵育的时间为1-3h(例如可以为，但不限于2h等)。

在本发明优选的一些实施方式中，所述知母皂苷酶解转化物中，知母皂苷AIII的含量为40％以上。

在本发明更优选的一些实施方式中，知母提取物以β-葡萄糖苷酶酶解转化的步骤包括：

将知母提取物与β-葡萄糖苷酶在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中孵育，所得酶解产物干燥后得到知母皂苷酶转化物；

在该实施方式中，所得到的是以知母皂苷AIII为有效成分的知母皂苷酶解转化物，知母皂苷酶解转化物中，知母皂苷AIII的占比在40％左右，知母皂苷BII的含量低于1％。

在本发明优选的一些实施方式中，所述的知母皂苷酶解转化物能够用于抑制白色念珠菌，新生隐球菌，红色毛癣菌，须癣毛癣菌，以及石膏样小孢子菌中的一种或几种皮肤浅表真菌，可以进一步作为活性成分，制备抑制皮肤浅表真菌药物，并用于甲癣，手癣，足癣，头癣，体癣，股癣，甲真菌病等浅部真菌病的治疗。

在本发明优选的一些实施方式中，可以将所述的知母皂苷酶解转化物作为活性成分，与助剂混合，以得到对应的洗剂，搽剂，软膏剂以及涂膜剂等药用剂型。

实施例1：知母皂苷酶解转化物的制备

(1)知母乙醇提取物的制备：

称取知母药材(或者饮片)60g，加入6倍量50％乙醇，加热回流，保持沸腾状态，提取时间为每次2h，提取2次。随后过滤，合并提取液，减压旋转蒸发，回收乙醇，水浴蒸干后转移至真空干燥箱，于60℃减压干燥过夜，获得知母皂苷乙醇提取物。

(2)知母皂苷酶酶转化物的制备：

称取4g知母乙醇提取物(相当于知母药材6g)，β-葡萄糖苷酶4g(50U/mg)，置于具塞锥形瓶中，加入200mL pH为4.0醋酸-醋酸钠缓冲液，置于气浴恒温振荡器中振摇2h。置真空干燥箱中，于60℃减压干燥，得到知母皂苷酶解转化物。

(3)知母皂苷酶解产物中知母皂苷AIII的含量测定：

色谱条件：色谱柱为Platisil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0min，25％A；8min，25％A；9min，75％A；15min，75％A；16min，25％A；20min，25％A)；流速：1mL/min；进样量为20μL；柱温：30℃；蒸发光散射检测器温度为60℃，雾化气体流速为1.5L/min。

称取知母皂苷AⅢ对照品10.00mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，甲醇充分溶解，定容至刻度线，混匀，分别得到浓度为1.00mg/mL知母皂苷AⅢ对照品储备液。配置知母皂苷AⅢ浓度为49.35、98.70、246.8、493.5、789.6、987.0μg/mL的对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪。以知母皂苷AⅢ对照品浓度的常用对数为横坐标(X)，以各自相应峰面积的对数值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，并计算回归方程。精密称定酶解产物10mg，置于25mL容量瓶中，甲醇定容，超声溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，注入液相色谱仪进行含量测定。

结果显示，知母皂苷酶解转化物中知母皂苷AⅢ的含量为52.47％±0.32％(RSD＝0.5％)。

以实施例1所制备知母皂苷酶解转化物为原料，制备如下含有知母酶解转化物的制剂1-4：

制备例1：知母皂苷酶解转化物的软膏剂

称取白凡士林15g、羊毛脂1.5g搅拌混匀后，加入0.2g知母皂苷酶解转化物(其中含知母皂苷AⅢ0.1g，相当于知母药材4.06g)，搅拌均匀，得到知母皂苷酶解转化物的软膏制剂。

制备例2：知母皂苷酶解转化物的涂膜剂

称取0.2g知母皂苷酶解转化物(相当于知母药材4.06g)，加入10ml甘油，超声使溶解，另取6g聚乙烯醇，加入60ml水于90℃溶胀，将以上两种溶液混匀，加水至100ml，高压灭菌，得到知母皂苷酶解转化物的涂膜剂，知母皂苷酶解转化物浓度为2mg/ml(其中含知母皂苷AⅢ1mg/ml)。

制备例3：知母皂苷酶解转化物洗剂

将0.2g知母皂苷酶解转化物(相当于知母药材4.06g)置于研钵中，加入甘油与适量蒸馏水，研磨至糊状，逐渐加水至知母皂苷酶解转化物浓度为2mg/ml(其中含知母皂苷AⅢ1mg/ml)，混匀得到知母皂苷酶解转化物洗剂。

制备例4：知母皂苷酶解转化物搽剂

向0.2g知母皂苷酶解转化物(相当于知母药材4.06g)中，加入乙醇中搅拌溶解，加入适量月桂氮卓酮和甘油，加乙醇至1 00ml，混匀得到知母皂苷酶解转化物搽剂，知母皂苷酶解转化物浓度为2mg/ml(其中含知母皂苷AⅢ1mg/ml)。

对照制备例1：知母皂苷AⅢ的涂膜剂

称取1g壳聚糖，加入20ml含5％冰醋酸的水溶胀，另取1g聚乙烯醇，加入10ml水于90℃溶胀，按1：1比例分别取以上壳聚糖和聚乙烯醇混匀，高压灭菌后备用。

精密称取知母皂苷AIII 10.00mg，置5mL容量瓶中，甲醇定容，配制成2mg/mL的甲醇溶液。分别精密称取DSPC、DSPE-PEG2000 100.00mg，置1mL容量瓶中，氯仿定容，分别配成100mg/mL的DSPC氯仿溶液和DSPE-PEG2000氯仿溶液。按DSPC:DSPE-PEG2000:TAIII为8:2:1的比例分别取适量以上溶液，置于蛋形瓶中，混匀，60℃减压旋转蒸干，使其在蛋形瓶壁内形成一层均匀的薄膜，置干燥器中抽真空过夜。次日取出，加入5ml蒸馏水，60℃水化1h，水浴超声至透光，即得，置4℃冰箱保存。

取知母皂苷AIII脂质体5ml与等量的壳聚糖和聚乙烯醇混合物混匀，即得知母皂苷AⅢ的涂膜剂，知母皂苷AⅢ浓度为1mg/ml。

对照制备例2：知母皂苷AⅢ的软膏剂

称取白凡士林15g、羊毛脂1.5g搅拌混匀后，加入0.1g知母皂苷AⅢ(其中含知母皂苷AⅢ0.1g，相当于知母药材4.06g)，搅拌均匀，得到知母皂苷酶解转化物的软膏制剂。

对照制备例3：知母乙醇提取物软膏剂

称取白凡士林15g、羊毛脂1.5g搅拌混匀后，加入2.7g知母乙醇提取物(相当于知母药材4.06g)(实施例1方法得到)，搅拌均匀，得到知母皂苷酶解转化物的软膏制剂。

实验例1知母皂苷酶解转化物体外抗真菌作用研究

(1)菌悬液的制备

取少量新生隐球菌、白色念珠菌等球状菌，以YEPD培养液活化后，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×10³～5×10³CFU/mL。

将红色毛癣菌、石膏样小孢子菌、须癣毛癣菌用沙堡葡萄糖琼脂培养基活化后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至1×10³～5×10³CFU/mL。

(2)抑菌药物供试溶液

取知母乙醇提取物(实施例1方法得到)，以磷酸盐缓冲液调整其浓度，配制浓度为320mg/mL、64mg/mL、32mg/mL，6.4mg/mL的供试溶液；

取知母皂苷酶解转化物(实施例1方法得到)，以磷酸盐缓冲液调整浓度，配置浓度为27mg/mL、13.5mg/mL、1.35mg/mL的供试溶液；

将知母皂苷AⅢ用磷酸盐缓冲液调整浓度，配制浓度为1.5mg/mL、150μg/mL的供试溶液。

(3)知母皂苷酶解转化物对白色念珠菌的抑制作用

吸取5μL白色念珠菌菌液(菌液浓度为1×10⁴CFU/mL)，以无菌涂布棒均匀涂布在培养基表面，在每个培养平板上间隔20mm轻放两个无菌牛津杯，每个牛津杯中注入150μL供试药品，由于药物在水中溶解性低，溶剂采用DMSO和甲醇助溶，因此，对照组加入等量的50％DMSO、5％DMSO、50％甲醇、5％甲醇溶液。

将各抑菌平板置于生化培养箱中，30℃培养48h，测量抑菌圈直径。结果表明，知母乙醇提取物在较高浓度(320mg/mL)下对白色念珠菌有一定的抑制作用，抑菌圈直径为6mm；经过酶催化水解后，知母皂苷酶解转化物的白色念珠菌的抑制效果有大幅提高，在27mg/mL与13.5mg/mL浓度下，抑菌圈直径分别为16mm、12mm。由此可见，知母皂苷酶解转化物对白色念珠菌的抑制作用明显强于酶解前的乙醇提取物。

(5)知母乙醇提取物与知母皂苷酶解转化物对5种常见真菌的抑制作用本实验采用美国临床和实验室标准协会、中国药典推荐的微量液基稀释法检测知母乙醇提取物以及知母皂苷酶解转化物对五种常见致病真菌的最小抑菌浓度，并以氟康唑作为阳性对照药物。

具体实验方法参考如下：将白色念珠菌、新生隐球菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌分别种于96孔板，加入不同浓度的药物培养，使药物终浓度分别为64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L，不加药物的孔作为阳性对照，白色念珠菌35℃静置培养24小时，新隐球菌35℃静置培养72小时，红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样毛癣菌30℃培养7天，以酶标仪测量各孔于波长630nm下的OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC₈₀，即真菌生长80％被抑制时的药物浓度。当药物的MIC₈₀值高于最高浓度64mg/L时，计为“>64mg/L”。

抑菌实验结果显示，知母皂苷AⅢ对丝状皮肤真菌红色毛癣菌、石膏状小孢子菌、须癣菌的活性较好，MIC达4mg·L^-1。知母乙醇提取物、知母皂苷酶解转化物对以上5种真菌于体外均表现不同的抑制活性，知母乙醇提取物经酶催化水解后，抑菌活性显著增强，MIC达4mg·L^-1(见表1)。

表1知母乙醇提取物与酶转化物对5种真菌的体外抑菌活性(MIC，mg/L)

实验例2:知母皂苷酶解转化物体内抗真菌作用研究

(1)菌悬液的制备

实验用标准菌株在实验前接种至沙活化2次(白色念珠菌、新生隐球菌于35℃培养一周；须癣毛癣菌、红色毛癣菌、石膏样小孢菌于26℃培养一周)，以保证菌落的纯化和活力。实验前，以磷酸盐缓冲液调整白色念珠菌和新生隐球菌菌液浓度至1×10⁴～1×10⁵CFU/mL；其他浅部真菌，加适量磷酸盐缓冲液于沙氏葡萄糖琼脂斜面，以无菌玻璃棒轻轻摩擦菌落，使孢子和断裂菌丝游离在缓冲液中。以血细胞计数板计数，包括孢子和菌丝(以菌丝分隔处或一个孢子为1个CFU)，加缓冲液调浓度至1×10⁴～1×10⁵CFU/mL。以磷酸盐缓冲液调整须癣毛癣菌菌液浓度至(1～5)×10⁶CFU/mL。

(2)动物造模

取健康小鼠，以手术剪刀剪去在背部脊柱两侧长毛，再以电动剃须刀制备光滑无毛区，每只小鼠背侧面感染区剃毛4cm×5cm，24小时后，以75％酒精棉球消毒脱毛区，待残余酒精挥发，脱毛区干燥，用细砂纸轻轻打磨皮肤，制备出有轻微出血的粗糙面，将已经制备好的真菌悬液用棉签均匀涂在上面，用力涂擦。将创面暴露于空气中，每天观察一次，3-5天后，局部感染明显形成，经真菌学检查(直接镜检及培养)阳性后，确定感染成功。

(3)动物分组及给药

小鼠局部皮肤酒精消毒，刮刀灼烧消毒后冷却，在背部刮取少许鳞屑分别放置沙堡氏培养管和清洁载玻片上，在玻片上加一滴10％KOH，盖上盖玻片，再于火焰上微加温，使载玻片的标本处刚刚出现气泡为止，再轻压一下盖玻片，即可在光学显微镜下观察菌丝，培养管放26℃温箱培养一周。

小鼠接种菌种14天后，将感染成功的小鼠随机分5组，知母皂苷乙醇提取物软膏组，知母皂苷酶解转化物软膏组，知母皂苷AⅢ软膏组，软膏基质组，阳性对照组(硝酸咪康唑乳膏，别名：达克宁乳膏)，每10只，20个感染区(所用各软膏为如上制备例或对照制备例产品)。

每感染处用药量0.2g，2次/天，连续2周，每2天进行一次真菌学镜检和皮损观察。疗效评价标准为2级：皮损消退、真菌镜检连续2次阴性记为治愈；皮损未消退、真菌镜检阳性为无效。

知母皂苷酶解转化物软膏组、知母皂苷AⅢ软膏组和达克宁组给药5天时，鳞屑边缘丘疹、红斑逐渐消退，颜色逐渐变淡；给药1周时，部分小鼠的鳞屑脱落，水肿消失，脱落部位皮肤修复良好，恢复平整，光滑状；给药2周时小鼠病变部位皮肤接近正常皮肤，并出现新生鼠毛。知母乙醇提取物软膏组给药2周后，仅部分小鼠病变皮肤修复良好，恢复光滑。软膏基质对照组在观察期间，病变部位创面均未得到改善。

各组治疗效果如下表2所示：

表2知母皂苷酶解转化物软膏对小鼠感染须癣毛癣菌的治疗效果

**表示与软膏基质组比较，P<0.01；##表示与知母提取物软膏组比较，P<0.01

由如上表2结果可知，知母皂苷酶解转化物软膏组、知母皂苷AⅢ软膏组小鼠须癣毛癣菌局部皮肤感染的2周治愈率为90％和85％；达克宁组2周治愈率为85％，两组结果经统计学处理无显著性差异(P＞0.05)。

知母提取物软膏组2周治愈率为30％，显著低于知母皂苷酶解转化物软膏组、知母皂苷AⅢ软膏组(P<0.01)。表明知母皂苷酶解转化物软膏和知母皂苷AⅢ软膏在皮肤癣病治疗效果上与达克宁相近，与知母乙醇提取物相比，在抗皮肤浅表真菌病药物开发与应用中更具优势。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (2)

1.知母皂苷酶解转化物在制备抑制皮肤浅表真菌药物中的应用，其特征在于，所述知母皂苷酶转化物的制备包括：将知母提取物以β-葡萄糖苷酶酶解转化，得到知母皂苷酶转化物；

所述知母提取物的制备包括：将知母以溶剂提取，得到知母提取物；

所述知母为：知母药材；

所述溶剂为：50%乙醇；

所述将知母提取物以β-葡萄糖苷酶酶解转化包括：

将知母提取物与β-葡萄糖苷酶在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中孵育，得到知母皂苷酶转化物；

所述醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH为3.79-4.95；

所述孵育的温度为35-55℃，孵育的时间为1-3h；

所得知母皂苷酶转化物中，主要成分为知母皂苷AⅢ，含量为40%以上；

所述皮肤浅表真菌为：白色念珠菌，新生隐球菌，红色毛癣菌，须癣毛癣菌，以及石膏样小孢子菌中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制皮肤浅表真菌药物的剂型为：洗剂，搽剂，软膏剂以及涂膜剂中的一种。