CN109674802A - 甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途 - Google Patents

甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药制药领域，具体涉及甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途，本发明应用现代药理筛选技术，采取活性导向分离方法，从吉祥草（Reineckia carnea(Andr.)Kunth）醇提物的乙酸乙酯部位和正丁醇部位中分离得到两个甾体类化合物（化合物1和化合物2），经体外抗炎活性的试验发现化合物1和化合物2均有较强的抗炎活性，在浓度均为0.1umo/L的情况下，化合物1和化合物2对NO的抑制率分别为35.6%和19.4%，同时，通过炎症小鼠的体内抗炎实验发现，化合物1和化合物2对二甲苯引起的小鼠耳朵肿胀炎症具有显著的抗炎疗效，可应用于制备抗炎药物，不仅高效，而且副作用小。

Description

甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途
技术领域
本发明涉及中药制药领域，具体涉及甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途。
背景技术
炎症是机体对各种致炎因素引起的局部损伤所产生的具有防御意义的应答性反应，是十分常见而又非常重要的基本病理过程，可以发生于机体的任何部位和任何组织，人类的大多数疾病都与炎症过程有关，除了常见的脑炎、风湿、痢疾和外伤感染等炎症疾患，炎症与发病率较高危害较大的肿瘤、冠心病和老年性痴呆的发生也有非常密切的关系， 因此，有效控制炎症的发生对于防治多种临床疾患具有十分重要的意义。然而现今的抗炎药如非甾体抗炎药阿司匹林及激素等，具有显著的副作用。现代药理研究表明，传统的清热解毒类中药，可通过抑制炎症早期的毛细血管通透性、渗出、水肿等机制来治疗炎症性疾病，且副作用相对较少，因此，从中药中寻找高效、低毒的抗炎成分具有针对性性及应用性。
吉祥草（Reineckia carnea (Andr.) Kunth.）是百合科（Liliaceae）吉祥草属植物吉祥草的干燥全草，又名观音草，小叶万年青等。吉祥草应用历史悠久，具有润肺止咳，解毒利咽，接骨续筋，凉血止血等功效，可用于治疗咳嗽、哮喘、跌打损伤等。目前，吉祥草已经被开发应用。例如以吉祥草为君药的“咳速停糖浆”和“复方吉祥草含片”等。前者具有补气养阴、润肺止咳、益胃生津的功效，可用于感冒及急、慢性支气管炎引起的咳嗽、干咳、气喘等症，其处方来源为苗药验方，由吉祥草、黄精等数味药组成；“复方吉祥草含片”具有宣肺平喘、清热润燥、止咳化痰的功效，可用于治疗急慢性支气管炎、肺气肿等，其处方由吉祥草、紫菀、鱼腥草、罂粟壳、麻黄等九味中药组成。
现代药理研究表明，吉祥草具有良好的止咳、化痰作用，且皂苷及苷元类成分是其发挥药理活性的主要物质基础，我们推测其发挥药理作用可能与炎症的抑制有关。因此，我们采取活性导向分离方法，从吉祥草中分离得到2个甾体类化合物，具有较好的抗炎活性。
发明内容
本发明的目的是提供吉祥草中新的具有抗炎活性的化合物，具体涉及甾体类化合物，包括化合物1：(17,20-S-trans)-5β-pregn-16-en-1β,3β-diol-20-one1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-fucopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranoside｛(17,20-S-反向)-5β-孕甾-16-烯-1β,3β-二羟基-20-酮-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖甙｝和化合物2：lβ,3β-dihydroxy-5β-pregn-16-en-20-one（lβ,3β-二羟基-5β-孕甾-16-烯-20-酮）。
本发明进一步的目的是提供上述甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途。
本发明应用现代药理筛选技术，采取活性导向分离方法，从吉祥草醇提物的乙酸乙酯部位和正丁醇部位中分别分离得到上述化合物1和化合物2，并对得到的化合物1和化合物2进行抗炎活性评价，发现化合物1和化合物2均有较强的抗炎活性，在浓度均为0.1umo/L的情况下，化合物1和化合物2对NO的抑制率分别为35.6%和19.4%。所述的化合物1和化合物2具有以下结构通式：
当R1=Fuc-Rha，R2=Rha，该甾体类化合物为化合物1：(17,20-S-trans)-5β-pregn-16-en-1β,3β-diol-20-one1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-fucopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranoside；Fuc和Rha的结构式分别如下：
当R1=H（氢元素），R2=H（氢元素），该甾体类化合物为化合物2：lβ,3β-dihydroxy-5β-pregn-16-en-20-one；
化合物1和化合物2的结构式分别如下：
本发明所述的甾体类化合物通过下述方法制备：
取一定量吉祥草全草药材，用体积分数为80%的乙醇加热回流提取3次，3次回流提取的时间分别为2h、2h和1h，合并三次提取液，滤过后减压浓缩至无醇味，所得浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇进行多次萃取，回收每次萃取的萃取液，并对各萃取液进行减压浓缩和干燥处理，分别得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏；
取乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇（二氯甲烷与甲醇的体积比分别为1:0、100:1、50:1、20:1、10:1、2:1、0:1）梯度洗脱，得到7个流份E-1~E-7，用MCI柱（小孔树脂凝胶柱）对流份E-6进行色谱分离，用体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%的甲醇梯度洗脱，将体积分数为80%的甲醇的洗脱部位添加到Sephadex LH-20柱（羟丙基葡聚糖凝胶柱）上，用体积分数为80%的甲醇等度洗脱，洗脱液再经过制备型HPLC（High PerformanceLiquid Chromatography，高效液相色谱法）分离纯化后制备得到化合物1：(17,20-S-trans)-5β-pregn-16-en-1β,3β-diol-20-one1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-fucopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranoside；
用蒸馏水将正丁醇部位浸膏溶解后通过HP20大孔吸附树脂对其进行吸附，并依次用体积分数分别为30%、60%、95%的乙醇洗脱，回收每次洗脱的洗脱液，各洗脱液经浓缩和干燥后分别得到30%乙醇洗脱部位浸膏、60%乙醇洗脱部位浸膏和95%乙醇洗脱部位浸膏，取60%乙醇洗脱部位浸膏进行硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇-水（二氯甲烷、甲醇和水的体积比分别为20:1:0.1、10:1:0.1、5:1:0.1、2:1:0.1、1:1:0.1、0:1:0）梯度洗脱，得到6个流份B-60%-1~B-60%-6，用ODS（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料）柱对流份B-60%-5色谱分离，用体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%的甲醇梯度洗脱，将体积分数为80%的甲醇的洗脱部位添加到Sephadex LH-20柱（羟丙基葡聚糖凝胶柱）上，用体积分数为80%的甲醇等度洗脱，洗脱液再经过制备型HPLC分离纯化后制备得到化合物2：lβ,3β-dihydroxy-5β-pregn-16-en-20-one。
化合物1：白色粉末，ESI-MS m/z 769.4 [M-H]-，分子式为C39H62O15。
1H-NMR (C5D5N，600 MHz) δH: 4.03 (1H，m，H-1)，4.23 (1H，m，H-3)，0.96 (3H，s，H-18)，1.29 (3H，s，H-19)，2.24 (3H，s，H-21)，5.01 (1H，d，J = 7.7 Hz，1-O-Fuc-H-1')，1.47 (3H，d，J = 6.4 Hz，1-O-Fuc-H-6')，6.44 (1H，br.s，2'-O-Rha-H-1'' )，1.75(3H，d，J = 6.2 Hz，2'-O-Rha-H-6'')，5.45 (1H，br.s，3-O-Rha-H-1''')，1.67 ( 3H，d，J= 6.2 Hz，3-O-Rha-H-6''')；
13C-NMR (C5D5N，150 MHz) δC: 78.2 (C-1)，30.0 (C-2)，70.4 (C-3)，31.1 (C-4)，34.8 (C-5)，26.8 (C-6)，26.8 (C-7)，33.6 (C-8)，47.0 (C-9)，39.8 (C-10)，22.2 (C-11)，35.6 (C-12)，46.5 (C-13)，56.9 (C-14)，32.4 (C-15)，144.6 (C-16)，155.7 (C-17)，16.3 (C-18)，16.8 (C-19)，196.3 (C-20)，27.2 (C-21)，99.7 (1-O-Fuc-C-1')，77.2(C-2')，75.1 (C-3')，74.4 (C-4')，71.4 (C-5')，17.1 (C-6')，101.6 (2'-O-Rha-C-1'')，72.5 (C-2'')，72.5 (C-3'')，74.2 (C-4'')，70.0 (C-5'')，19.0 (C-6'')，99.6(3-O-Rha-C-1''')，72.4 (C-2''')，72.8 (C-3''')，73.5 (C-4''')，69.2 (C-5''')，18.8(C-6''')。
化合物 2，白色粉末，ESI-MS m/z：333.2 [M+H]+，分子式为C21H32O3。
1H-NMR (C5D5N，600 MHz) δ H: 4.00 (1H，m，H-1)，4.39 (1H，m，H-3)，1.33 (3H，s，H-19)，0.95 (3H，s，H-18)，2.26 (3H，s ，H-21), 6.63 (1H，dd，J = 1.6，3.0 Hz，H-16)；
13C-NMR (C5D5N，150 MHz)，δ C：73.1 (C-1)，34.4 (C-2)，68.1 (C-3)，34.4 (C-4)，31.3 (C-5)，26.2 (C-6)，27.0 (C-7)，32.8 (C-8)，42.5 (C-9)，40.4 (C-10)，20.9 (C-11)，35.4 (C-12)，46.3 (C-13)，56.2 (C-14)，32.2 (C-15)，144.6 (C-16)，155.3 (C-17)，16.1 (C-18)，19.2 (C-19)，196.2 (C-20)，26.6 (C-21)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采取活性导向分离方法，从吉祥草醇提物的乙酸乙酯部位和正丁醇部位中分离得到两个甾体类化合物，分别是化合物1：(17,20-S-trans)-5β-pregn-16-en-1β,3β-diol-20-one1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-fucopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranoside和化合物2：lβ,3β-dihydroxy-5β-pregn-16-en-20-one，经体外抗炎活性的试验发现化合物1和化合物2均有较强的抗炎活性，在浓度均为0.1umo/L的情况下，化合物1和化合物2对NO的抑制率分别为35.6%和19.4%；同时，通过炎症小鼠的体内抗炎实验发现，化合物1和化合物2对二甲苯引起的小鼠耳朵肿胀炎症具有显著的抗炎疗效，可应用于制备抗炎药物，不仅高效，而且副作用小。
附图说明
图1为本发明的吉祥草中甾体类化合物的提取分离流程图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1. 甾体类化合物的制备：
按照图1所示的流程图从吉祥草中提取甾体类化合物，具体步骤如下：
取20kg吉祥草全草药材，用体积分数为80%的乙醇加热回流提取3次，3次回流提取的时间分别为2h、2h和1h，合并三次提取液，滤过后减压浓缩至无醇味，得到15L浓缩液，所得浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇进行多次萃取，回收每次萃取的萃取液，并对各萃取液进行减压浓缩和干燥处理，分别得到石油醚部位浸膏28g、乙酸乙酯部位浸膏305g和正丁醇部位浸膏780g；
取305g乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇（二氯甲烷与甲醇的体积比分别为1:0、100:1、50:1、20:1、10:1、2:1、0:1）梯度洗脱，得到7个流份E-1~E-7，其中，1:0的二氯甲烷-甲醇洗脱后得到流份E-1、100:1的二氯甲烷-甲醇洗脱后得到流份E-2、50:1的二氯甲烷-甲醇洗脱后得到流份E-3、20:1的二氯甲烷-甲醇洗脱后得到流份E-4、10:1的二氯甲烷-甲醇洗脱后得到流份E-5、2:1的二氯甲烷-甲醇洗脱后得到流份E-6、0:1的二氯甲烷-甲醇洗脱后得到流份E-7，用MCI柱对流份E-6进行色谱分离，用体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%的甲醇梯度洗脱，将体积分数为80%的甲醇的洗脱部位添加到SephadexLH-20柱上，用体积分数为80%的甲醇等度洗脱，洗脱液再经过制备型HPLC（以体积分数为34%的乙腈作为流动相）分离纯化后制备得到10.0mg化合物1：(17,20-S-trans)-5β-pregn-16-en-1β,3β-diol-20-one1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-fucopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranoside；
用蒸馏水将780g正丁醇部位浸膏溶解后通过HP20大孔吸附树脂对其进行吸附，并依次用体积分数分别为30%、60%、95%的乙醇洗脱，回收每次洗脱的洗脱液，各洗脱液经浓缩和干燥后分别得到30%乙醇洗脱部位浸膏、60%乙醇洗脱部位浸膏和95%乙醇洗脱部位浸膏，取60%乙醇洗脱部位浸膏（241g）进行硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇-水（二氯甲烷、甲醇和水的体积比分别为20:1:0.1、10:1:0.1、5:1:0.1、2:1:0.1、1:1:0.1、0:1:0）梯度洗脱，得到6个流份B-60%-1~B-60%-6，其中，20:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水洗脱后得到流份B-60%-1、10:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水洗脱后得到流份B-60%-2、5:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水洗脱后得到流份B-60%-3、2:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水洗脱后得到流份B-60%-4、1:1:0.1的二氯甲烷-甲醇-水洗脱后得到流份B-60%-5、0:1:0的二氯甲烷-甲醇-水洗脱后得到流份B-60%-6，用ODS柱对流份B-60%-5色谱分离，用体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%的甲醇梯度洗脱，将体积分数为80%的甲醇的洗脱部位添加到Sephadex LH-20柱上，用体积分数为80%的甲醇等度洗脱，洗脱液再经过制备型HPLC（以体积分数为34%的乙腈作为流动相）分离纯化后制备得到11.6mg化合物2：lβ,3β-dihydroxy-5β-pregn-16-en-20-one。
实施例2. MTT法体外抗炎活性的试验：
1、实验原理：LPS（脂多糖）激活巨噬细胞模型被广泛用于评价各种化学物质的抗炎作用．当RAW264.7细胞（来源于小鼠巨噬细胞系）受到LPS刺激时，释放大量炎症因子(NO，PGE2，TNF-α，IL-6等) ，若药物能抑制炎性介质或抑制产生炎症因子的酶活性(COX-2，iNOS等) ，就具有抗炎作用。NO作为炎症反应中的重要信使分子，既是炎症反应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子，它由一氧化氮合酶（iNOS）催化而成，参与多种炎症信号传导，并与多种炎症因子相互作用，产生于炎症反应的每一阶段，故可以通过测定NO含量来评价某一抗炎药物的抗炎活性（杨光忠, 崔圆圆, 王德彬. 石松属植物化学成分抗炎活性的筛选[J]. 中南民族大学学报: 自然科学版, 2015, 34(2): 52-56.）。
本试验通过体外培养RAW264.7巨噬细胞，以LPS（脂多糖，使用前使用PBS磷酸缓冲液将其配制成体积分数为20ng/ml的LPS溶液）为刺激剂，刺激24h激活巨噬细胞系RAW264.7的TLR4受体，引发下游的炎症反应，给予化合物1和化合物2干预后，检测特异性指标NO的表达水平变化来评价这两个化合物在LPS诱导下其抑制炎症方面的能力强弱。
2、实验过程：
（1）化合物1和化合物2的处理：分别称取1mg化合物1，置于不同的试管中，在紫外下照射2h，然后各加入10ul二甲基亚砜（DMSO）完全溶解样品，最后用DMEM培养液将化合物1配制成浓度分别为1mg/ml、200ug/ml和40ug/ml的溶液；化合物2的处理方式与化合物1相同；
（2）测定化合物1和化合物2对细胞活力的影响：将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞用DMEM培养液在37℃，5%CO2培养箱中培养，然后取对数生长期的RAW264.7细胞，按2×105/ml的密度将RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板内，每板总细胞数约为4×106个，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁良好后，往不同细胞培养板中分别加入不同浓度的化合物1和化合物2（100ul/孔），并设置对照组，对照组加入等量的DMEM培养液，每组设置4个复孔，37℃，5%CO2培养箱中培养48h后，弃去培养基，并加入含0.5mg/mL MTT（四唑盐）的无血清DMEM培养液孵育4h后，弃上清液，每孔加入100μL DMSO，在酶标仪上于492nm处检测各实验组的A值，按以下公式计算各组的细胞活力，并确定化合物1和化合物2影响细胞活力的有效浓度范围：
细胞活力=(A给药组/A对照组)×100%
（3）化合物1和化合物2对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放的测定：取对数生长期的RAW264.7细胞，按2×105/ml的密度将RAW264.7细胞接种于96孔细胞培养板内，每板总细胞数约为4×106个，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁良好后，将细胞
分为五组，每组四个复孔：
（a）空白对照组：不加LPS溶液和药液；
（b）LPS对照组：加LPS溶液，并且使LPS的终浓度为10μg/mL；
（c）阳性对照组：加地塞米松（DEX）和LPS溶液，并且使DEX的终浓度为10μM， LPS的终浓度为10μg/mL；
（d）化合物1组：加化合物1和LPS溶液，并且根据（2）中化合物1影响细胞活力的有效浓度范围设置4个浓度梯度，并且保证每个浓度梯度下LPS的终浓度均为10μg/mL；
（e）化合物2组：加化合物2和LPS溶液，并且根据（2）中化合物2影响细胞活力的有效浓度范围设置4个浓度梯度，并且保证每个浓度梯度下LPS的终浓度均为10μg/mL。
然后将处理好后的细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养，48h后收集各孔中的细胞培养上清，用NO检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）按照说明书的操作说明检测上清中的NO含量，并计算各组的NO抑制率。
（4）测量结果：由表1的测量结果可以发现，化合物1和化合物2在浓度均为0.1umo/L的情况下，对NO的抑制率分别为35.6%和19.4%，与阳性药地塞米松（20.7%）相当。可见，化合物1和化合物2均有较强的抗炎活性，可应用于制备抗炎药物。
表1. 化合物1和化合物2对NO分泌的抑制作用（Mean±SD）
实施例3. 化合物1和化合物2对炎症小鼠的体内抗炎疗效：
（1）实验仪器和材料：
酶标仪（Thermo公司），7140肢体肿胀测量仪（意大利UGO公司），二甲苯和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购于国药试剂公司，均为分析纯，阳性地塞米松（5mg/片）松购于山东齐鲁制药。TNF-α和IL-lβ ELISA试剂盒购于碧云天生物科技有限公司，SPF级小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠加工饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。
（2）实验方法：
为进一步验证化合物1和化合物2的抗炎效果，以SPF级小鼠为实验对象，构建小鼠耳廓肿胀模型，然后分别测定化合物1和2对小鼠耳朵肿胀度以及对小鼠耳朵肿胀组织中炎症介质TNF-a和IL-lβ的影响，以评价化合物1和化合物2对小鼠非感染性炎症的疗效。
实验时，将小鼠（体重20-25g）随机分成4组，即对照组，地塞米松组，化合物1组和化合物2组，每组25只，然后用20uL二甲苯分别滴于每只小鼠的右耳两面，左耳不涂作为对照，小鼠在实验期间以小鼠加工饲料作为营养食料，以自由食用的方式进行喂养。
致炎后，开始对小鼠进行灌胃给药，每天给药1次，给药时，先取0.5mg CMC-Na用100mL蒸馏水配制成CMC-Na溶液，然后将相应的药物溶解于CMC-Na溶液中，最后取1mL配制好后的药物对每只小鼠进行灌胃给药，其中，地塞米松组的小鼠在上述CMC-Na溶液中添加重量比为10mg/kg的地塞米松后灌胃喂食；化合物1组的小鼠在上述CMC-Na溶液中添加重量比为10mg/kg的化合物1后灌胃喂食；化合物2组的小鼠在上述CMC-Na溶液中添加重量比为10mg/kg的化合物2后灌胃喂食；对照组的小鼠则在上述CMC-Na溶液中添加重量比为10mg/kg的生理盐水后灌胃喂食。
连续灌胃给药4天后计算每组小鼠的死亡率，并在末次给药1 h后，处死动物，沿耳廓基线剪下耳朵，用测量仪进行精密称重，计算小鼠的耳朵肿胀度，并比较各组间的差异。同时，将剪下的肿胀耳朵进行组织匀浆处理，用TNF-α和IL-lβ ELISA试剂盒分别测定炎症因子TNF-α和IL-lβ的生成量，测量结果均以均数±标准差（Mean±SD）的形式表示。
（3）实验结果：
通过炎症小鼠的疗效实验结果（表2）可以看出，口服给药化合物1和化合物2对二甲苯致小鼠耳朵肿胀具有显著的抑制作用，且优于地塞米松组；同时，经ELASA试剂盒测定小鼠耳朵肿胀组织的炎症因子TNF-α和IL-lβ，发现口服化合物1和化合物2的小鼠，其炎症因子TNF-α和IL-lβ的生成量显著低于对照组，且低于地塞米松组，此外，对炎症引发的死亡率来说，口服化合物1与化合物2均能降低耳朵肿胀炎小鼠的死亡率，且效果优于地塞米松组，说明化合物1和化合物2的体内抗炎活性显著，值得进一步研究开发为抗炎药。
表2. 化合物1和化合物2对小鼠非感染性炎症的疗效（Mean±SD）
与对照组相比*p<0.05, **p<0.01
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途，其特征在于：该甾体类化合物具有以下结构通式：
当R1=Fuc-Rha，R2=Rha，该甾体类化合物为化合物1；所述Fuc和Rha的结构式分别如下：
当R1=H，R2=H，该甾体类化合物为化合物2；
所述化合物1和化合物2的结构式分别如下：
。
2.根据权利要求1所述的甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途，其特征在于：所述的甾体类化合物通过下述方法制备：
取一定量吉祥草全草药材，用体积分数为80%的乙醇加热回流提取3次，合并三次提取液，滤过后减压浓缩至无醇味，所得浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇进行多次萃取，回收每次萃取的萃取液，并对各萃取液进行减压浓缩和干燥处理，分别得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏；
取乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱色谱，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得到7个流份E-1~E-7，用MCI柱对流份E-6进行色谱分离，用体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%的甲醇梯度洗脱，将体积分数为80%的甲醇的洗脱部位添加到Sephadex LH-20柱上，用体积分数为80%的甲醇等度洗脱，洗脱液再经过制备型HPLC分离纯化后制备得到化合物1；
用蒸馏水将正丁醇部位浸膏溶解后通过HP20大孔吸附树脂对其进行吸附，并依次用体积分数分别为30%、60%、95%的乙醇洗脱，回收每次洗脱的洗脱液，各洗脱液经浓缩和干燥后分别得到30%乙醇洗脱部位浸膏、60%乙醇洗脱部位浸膏和95%乙醇洗脱部位浸膏，取60%乙醇洗脱部位浸膏进行硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱，得到6个流份B-60%-1~B-60%-6，用ODS柱对流份B-60%-5色谱分离，用体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%的甲醇梯度洗脱，将体积分数为80%的甲醇的洗脱部位添加到Sephadex LH-20柱上，用体积分数为80%的甲醇等度洗脱，洗脱液再经过制备型HPLC分离纯化后制备得到化合物2。
3.根据权利要求2所述的甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途，其特征在于：所述的3次回流提取的时间分别为2h、2h和1h。
4.根据权利要求2所述的甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途，其特征在于：所述的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱的浓度分别为：二氯甲烷与甲醇的体积比分别为1:0、100:1、50:1、20:1、10:1、2:1、0:1。
5.根据权利要求2所述的甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途，其特征在于：所述的二氯甲烷-甲醇-水梯度洗脱的浓度分别为：二氯甲烷、甲醇和水的体积比分别为20:1:0.1、10:1:0.1、5:1:0.1、2:1:0.1、1:1:0.1、0:1:0。
6.根据权利要求1所述的甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途，其特征在于：所述的化合物1和化合物2均具有抗炎活性。
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