CN111349584B - 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用 - Google Patents

一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111349584B
CN111349584B CN202010177312.5A CN202010177312A CN111349584B CN 111349584 B CN111349584 B CN 111349584B CN 202010177312 A CN202010177312 A CN 202010177312A CN 111349584 B CN111349584 B CN 111349584B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alpha
pregn
hydroxymethyl
hydroxy
gas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010177312.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111349584A (zh
Inventor
林钦鹏
林汉标
林智德
陈斯涛
陈�峰
吴婷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bekind Bioengineering Inc Co Gd
Original Assignee
Bekind Bioengineering Inc Co Gd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bekind Bioengineering Inc Co Gd filed Critical Bekind Bioengineering Inc Co Gd
Priority to CN202010177312.5A priority Critical patent/CN111349584B/zh
Publication of CN111349584A publication Critical patent/CN111349584A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111349584B publication Critical patent/CN111349584B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种新金分枝杆菌及其在制备9α‑羟基‑20α‑羟甲基‑孕甾‑4‑烯‑3酮中的应用。新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，分类命名为Mycobacterium neoaurum BK076，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM20191115。该菌株是经过诱变筛选后得到的新菌株，能够高效转化甾醇类物质生产9α‑羟基‑20α‑羟甲基‑孕甾‑4‑烯‑3‑酮，底物植物甾醇转化率达到90％以上，发酵液中9α‑羟基‑20α‑羟甲基‑孕甾‑4‑烯‑3酮的浓度可以达到36g/L以上，转化率高达85％以上。

Description

一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4- 烯-3酮中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用。
背景技术
甾体类药物是一种临床上必不可少的药物，其指的是类固醇类物质，通常包括肾上腺皮素、雄激素、雌激素等，其可以对机体起到非常重要的调节作用，如肾上腺皮质激素具有抗炎症、抗过敏、抗休克、抗变态反应等功效，被广泛用于治疗类风湿性关节炎、支气管哮喘和湿疹等皮肤病，可治疗和缓解胶原性疾病、过敏性休克等难治或危险性疾病，也是治疗爱迪森氏等内分泌疾病的不可缺少的药物。总的来说，甾体激素类药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等重要作用，因此常常被誉为“生命的钥匙”。
不同的甾体药物分子结构均由甾体类药物中间体衍生而来。其中，9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮，英文名称pregn-4-en-3-one,9,21-dihydroxy-20methyl(简称9OH-BA，CAS号：69155-84-6)，是一种关键的甾体类药物中间体，在甾体工业化生产中起着重要作用。利用9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮为前体物可以合成多种甾体激素原料药，如高效含卤(氟、氯)糖皮质激素，地塞米松、倍他米松、康酸莫米松等，氢化可的松、17α-OH黄体酮、依普利酮、β米松、可的松等多种甾体原料药，且以9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮为前体物合成甾体类原料药在工艺路线上及成本上更具优势，因此9OH-BA具有重要的商业价值。
故提供一种能够快速高效生产9OH-BA的方法是目前的研究重点。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的9OA-BA不能快速高效的生产的缺陷，从而提供一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，分类命名为Mycobacteriumneoaurum BK076，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 20191115。
上述的新金分枝杆菌在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮中的应用。
一种9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的制备方法，包括使用上述的新金分枝杆菌将甾醇类物质转化为9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的步骤。
进一步的，所述甾醇类物质包括植物甾醇、动物甾醇、木甾醇和胆固醇中的至少一种。
进一步的，所述新金分枝杆菌的种子在含有甾醇类物质的转化培养基中发酵培养的条件为：种子接种量为5-15％(V/V)，培养温度为30-34℃，转化培养基的pH值为6.5-8.5，通气量为0.05-1.5vvm，搅拌速率为200-400r/min，发酵时间为100-150h。
进一步的，所述转化培养基包括以下组分：甾醇类物质30-50g/L、碳源15-50g/L、氮源20-80g/L、聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷混合物40-100g/L、无机盐2-30g/L、乳化剂5-15g/L和泡敌5-10g/L。
进一步的，
所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、红糖、甘油、麦芽糖、糖蜜和淀粉中的至少一种；和/或，
所述氮源包括蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、鱼粉、豆粕粉、玉米浆、玉米浆干粉和棉籽粉中的至少一种；和/或，
所述无机盐包括磷酸氢二铵、硝酸钠、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、柠檬酸铵、柠檬酸铁铵、七水合硫酸镁和硫酸亚铁中的至少一种；和/或，
所述聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷混合物包括：聚乙二醇20-80g/L以及聚二甲基硅氧烷20-80g/L，所述聚乙二醇为PEG2000-4000，所述聚二甲基硅氧烷粘度等级为350-10000mm2/s；和/或，
所述乳化剂包括自乳化单甘脂、聚氧乙烯单月桂酸酯、吐温-80和油酸钠中的至少一种。
进一步的，所述新金分枝杆菌的种子按照以下步骤制备得到：
将所述新金枝杆菌接种于种子培养基中，在转速150-200r/min、通气量0.05-0.5vvm、30-34℃下培养36-48h。
进一步的，所述种子培养基包括以下组分：
碳源5-20g/L、氮源5-30g/L以及无机盐2-15g/L。
进一步的，所述种子培养基的pH值为7.0-7.5。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的新金分枝杆菌，使用该菌株可将甾醇类物质转化为9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮，且能有效的减少或消除其他结构类似物如AD、ADD、TS等杂质的形成，极大地提高了发酵液中9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的含量，减少了分离提取步骤并可有效提高产品纯度。
2.本发明提供的生产9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的方法，通过利用发明人自行采集的的新金分枝杆菌，采用微生物发酵转化法转化甾醇类物质发酵生产9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮，具有产品生产周期短、收率高、产品纯度高的优点。该方法可以转化底物植物甾醇转化率达到90％以上，发酵液中9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的浓度可以达到36g/L以上，转化率高达85％以上。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明是为了克服现有技术中的9OA-BA不能快速高效的生产的缺陷，提供了一种新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，分类命名为Mycobacterium neoaurum BK076，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年12月26日，保藏号为CCTCC M 20191115。
本发明还提供了上述的新金分枝杆菌在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮中的应用。
本发明还提供了一种9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的制备方法，该制备方法包括使用本发明提供的新金分枝杆菌将甾醇类物质转化为9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的步骤。
其中，9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的英文名称为：pregn-4-en-3-one,9,21-dihydroxy-20methyl(简称9OH-BA，CAS号：69155-84-6)，化学结构式如下：
Figure BDA0002411247220000051
其中，甾醇类物质包括植物甾醇、动物甾醇、木甾醇、胆固醇中的至少一种。
新金分枝杆菌的种子在含有甾醇类物质的转化培养基中发酵培养的条件为：种子接种量为5-15％(V/V)，培养温度为30-34℃，转化培养基的pH值为6.5-8.5，通气量为0.05-1.5vvm，搅拌速率为200-400r/min。发酵时间优选为100-150h。
优选的，新金分枝杆菌的种子在含有甾醇类物质的转化培养基中发酵培养的条件为：种子接种量为8-15％(V/V)，培养温度为30-34℃，转化培养基的pH值为7.5-8.0，通气量为0.8-1.5vvm，搅拌速率为200-400r/min。
具体的，转化培养基包括以下组分：甾醇类物质50g/L、碳源15-50g/L、氮源20-80g/L、聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷混合物40-100g/L、无机盐2-30g/L、乳化剂5-15g/L、泡敌5-10g/L。
其中，在转化培养基中，碳源包括葡萄糖、蔗糖、红糖、甘油、麦芽糖、糖蜜、淀粉中的至少一种；氮源包括蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、鱼粉、豆粕粉、玉米浆、玉米浆干粉、棉籽粉中的至少一种；无机盐包括磷酸氢二铵、硝酸钠、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、柠檬酸铵、柠檬酸铁铵、七水合硫酸镁、硫酸亚铁中的至少一种；聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷混合物包括：聚乙二醇20-80g/L，以及聚二甲基硅氧烷20-80g/L，聚乙二醇为PEG2000-4000，聚二甲基硅氧烷粘度等级为350-10000mm2/s；乳化剂包括自乳化单甘脂、聚氧乙烯单月桂酸酯、吐温-80、油酸钠中的至少一种。
优选的，转化培养基包括以下组分：葡萄糖10-20g/L、蔗糖10-20g/L、蛋白胨10-20g/L、玉米浆30-50g/L、豆粕粉20g/L、磷酸二氢钾5-10g/L、柠檬酸铵5-10g/L、七水合硫酸镁2-5g/L、硫酸亚铁2-5g/L、聚乙二醇PEG4000 20-60g/L、聚二甲基硅氧烷5000mm2/s 20-40g/L、自乳化单甘脂5-10g/L、油酸钠5-10g/L、吐温-80 0-10g/L、甾醇类物质40-50g/L。
具体的，新金分枝杆菌的种子按照以下步骤制备得到：将新金枝杆菌接种于种子培养基中，在转速150-200r/min、通气量0.05-0.5vvm、30-34℃下培养36-48h。
其中，种子培养基包括以下组分：碳源5-20g/L、氮源5-30g/L以及无机盐2-15g/L。
其中，种子培养基中，碳源选自葡萄糖、麦芽糖、甘油、淀粉中的至少一种；氮源选自酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆粕粉中的至少一种；无机盐选自磷酸氢二铵、硝酸钠、柠檬酸铵、七水合硫酸镁、硫酸亚铁中的至少一种。
种子培养基的pH值优选为7.0-7.5。
本发明涉及的转化培养基中的甾醇类物质的分析方法采用GC方法，具体分析方法如下：
供试品溶液制备：称取培养后得到的发酵液样品0.2g(精确至0.0001g)于50ml量瓶中，加入胆固醇内标液适量，密塞，超声使溶解，继续用内标液定容至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液进行检测。
采用岛津GCMS-QP2020气相色谱-质谱联用仪进行GC分析。检测器为FID检测器，色谱柱为二甲基聚硅氧烷柱DB-1(30mx0.25mmx0.25μm)，进样口温度为300℃，柱温箱为220℃，FID检测器温度为300℃，载气为氦气，色谱柱压力为60PSI，柱流量为1ml/min，氢气流量为40ml/min，空气流量为400ml/min，进样体积为1μL，分流比1：10。
本发明涉及的转化产物分析方法采用HPLC法，具体分析方法如下：
供试品溶液制备：称取培养后得到的发酵液样品0.3～0.4g(精确至0.0001g)置于50ml量瓶中，加乙醇适量，超声波振荡使溶解，定容，取出，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液进行检测。
采用C18反相色谱柱(Agilent Zorbax Eclipse Plus C18，100mm*4.6m*0.35μm)；流动相为甲醇：水-70:30(v/v)等度洗脱，流速为1.0ml/min；柱温为32℃；紫外检测波长为254nm；进样体积为10μl；色谱分析20min，目标产物保留时间4.9min。
以下通过不同具体实例对本发明做进一步描述，但本发明的内容不仅限于此。
实施例1
本实施例涉及一种9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的生产方法，包括以下步骤：
(1)种子培养
将Mycobacterium neoaurum BK076从茄子瓶固体斜面接种于种子培养基中，在200r/min转速下，32培养40h，即得适于接种的种子。
种子培养基包括以下组分(g/L)：酵母粉10、葡萄糖10、磷酸氢二铵5、七水合硫酸镁3，余量为水，调pH为7.5。
(2)微生物转化生成9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮
将步骤(1)中得到的种子液接种于10L发酵罐中进行转化培养，种子接种量为10％(V/V)，转化培养基的pH值为6.7，转化温度为32℃，通气量0.5vvm，搅拌转速250r/min，转化130h后发酵结束。
转化培养基包括以下组分(g/L)：葡萄糖10、甘油10、酵母粉5、蛋白胨3、玉米浆30、磷酸二氢钾4、柠檬酸铵4、七水合硫酸镁2、聚乙二醇(PEG2000)30、底物植物甾醇30、自乳化单甘脂5、聚氧乙烯单月桂酸酯5、泡敌5。
(3)产物检测
取步骤(2)得到的发酵液，按供试品溶液制备方法进行制备后用于HPLC和GC分析检测，每个样品经三次平行处理。经检测，发酵液中9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的含量达到19.2g/L，转化率77.1％，底物甾醇的转化率达到90％以上
注：底物甾醇转化率＝(发酵液初始甾醇浓度-发酵液转化结束甾醇浓度)/发酵液初始甾醇浓度*100％
转化率＝发酵液转化结束9OH-BA浓度/(发酵液初始甾醇浓度*0.83)*100％，其中，0.83是甾醇转化为9OH-BA的理论转化摩尔比。
实施例2
本实施例涉及一种9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的生产方法，包括以下步骤：
(1)种子培养
将Mycobacterium neoaurum BK076从茄子瓶固体斜面接种于种子培养基中，在200r/min转速下，32℃培养40h，即得适于接种的种子。
种子培养基包括以下组分(g/L)：蛋白胨10、葡萄糖10、甘油5、磷酸氢二铵5、七水合硫酸镁3，余量为水，调pH为7.5。
(2)微生物转化生成9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮
将步骤(1)中得到的种子液接种于10L发酵罐中进行转化培养，种子接种量为10％(V/V)，转化培养基的pH值为6.7，转化温度为32℃，通气量0.8vvm，搅拌转速250r/min，转化100h后发酵结束。
转化培养基包括以下组分(g/L)：葡萄糖10、蔗糖10、玉米浆30、蛋白胨10、豆粕粉20、磷酸二氢钾5、柠檬酸铵5、七水合硫酸镁2、硫酸亚铁2、聚乙二醇(PEG3000)40、聚二甲基硅氧烷(5000mm2/s)30、植物甾醇30、自乳化单甘脂7、油酸钠5、吐温-80 10、泡敌5。
(3)产物检测
取步骤(2)得到的发酵液，按供试品溶液制备方法进行制备后用于HPLC和GC分析检测，每个样品经三次平行处理。经检测，发酵液中9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的含量达到20.8g/L，转化率83.5％，底物甾醇的转化率达到95％以上。
实施例3
本实施例涉及一种9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的生产方法，包括以下步骤：
(1)种子培养
将Mycobacterium neoaurum BK076从茄子瓶固体斜面接种于种子培养基中，在200r/min转速下，32℃培养40h，即得适于接种的种子。
种子培养基包括以下组分(g/L)：蛋白胨10、葡萄糖10、甘油5、磷酸氢二铵5、七水合硫酸镁3，余量为水，调pH为7.5。
(2)微生物转化生成9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮
将步骤(1)中得到的种子液接种于1000L发酵罐中进行转化培养，种子接种量为12％(V/V)，转化培养基的pH值为7.7，转化温度为33℃，通气量1.0vvm，搅拌转速300r/min，转化100h后发酵结束。
转化培养基包括以下组分(g/L)：葡萄糖10、蔗糖10、玉米浆40、蛋白胨10、豆粕粉20、磷酸二氢钾5、柠檬酸铵5、七水合硫酸镁2、硫酸亚铁2、聚乙二醇(PEG3000)40、聚二甲基硅氧烷(5000mm2/s)30、植物甾醇30、自乳化单甘脂7、油酸钠5、吐温-80 10、泡敌5。
(3)产物检测
取步骤(2)得到的发酵液，按供试品溶液制备方法进行制备后用于HPLC和GC分析检测，每个样品经三次平行处理。经检测，发酵液中9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的含量达到21.8g/L，转化率87.6％，底物甾醇的转化率达到95％以上。
实施例4
本实施例涉及一种9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的生产方法，包括以下步骤：
(1)种子培养
将Mycobacterium neoaurum BK076从茄子瓶固体斜面接种于种子培养基中，在200r/min转速下，32℃培养40h，即得适于接种的种子。
种子培养基包括以下组分(g/L)：蛋白胨10、甘油5、磷酸氢二铵5、七水合硫酸镁3，余量为水，调pH为7.5。
(2)微生物转化生成9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮
将步骤(1)中得到的种子液接种于1000L发酵罐中进行转化培养，种子接种量为12％(V/V)，转化培养基的pH值为7.8，转化温度为33℃，通气量1.2vvm，搅拌转速300r/min，转化140h后发酵结束。
转化培养基包括以下组分(g/L)：葡萄糖12、蔗糖12、玉米浆40、蛋白胨12、豆粕粉20、磷酸二氢钾5、柠檬酸铵5、七水合硫酸镁2、硫酸亚铁2、聚乙二醇(PEG3000)50、聚二甲基硅氧烷(5000mm2/s)30、植物甾醇50、自乳化单甘脂7、油酸钠5、吐温-80 10、泡敌8。
(3)产物检测
取步骤(2)得到的发酵液，按供试品溶液制备方法进行制备后用于HPLC和GC分析检测，每个样品经三次平行处理。经检测，发酵液中9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮的含量36.2g/L，转化率87.2％，底物甾醇的转化率达到90％以上。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种新金分枝杆菌，分类命名为Mycobacterium neoaurum BK076，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.M 20191115。
2.根据权利要求1所述的新金分枝杆菌在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮中的应用。
3.一种9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的制备方法，其特征在于，包括使用如权利要求1所述的新金分枝杆菌将甾醇类物质转化为9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的步骤。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述甾醇类物质为植物甾醇。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述新金分枝杆菌的种子在含有甾醇类物质的转化培养基中发酵培养的条件为：种子接种量为5-15%（V/V），培养温度为30-34℃，转化培养基的pH值为6.5-8.5，通气量为0.05-1.5vvm，搅拌速率为200-400r/min，发酵时间为100-150h。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述转化培养基包括以下组分：甾醇类物质30-50g/L、碳源 15-50g/L、氮源 20-80 g/L、聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷混合物40-100 g/L、无机盐 2-30 g/L、乳化剂 5-15 g/L和泡敌5-10 g/L。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、红糖、甘油、麦芽糖、糖蜜和淀粉中的至少一种；和/或，
所述氮源包括蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、鱼粉、豆粕粉、玉米浆、玉米浆干粉和棉籽粉中的至少一种；和/或，
所述无机盐包括磷酸氢二铵、硝酸钠、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、柠檬酸铵、柠檬酸铁铵、七水合硫酸镁和硫酸亚铁中的至少一种；和/或，
所述聚乙二醇和聚二甲基硅氧烷混合物包括：聚乙二醇 20-80g/L以及聚二甲基硅氧烷 20-80g/L，所述聚乙二醇为PEG2000-4000，所述聚二甲基硅氧烷粘度等级为350-10000mm2/s；和/或，
所述乳化剂包括自乳化单甘脂、聚氧乙烯单月桂酸酯、吐温-80和油酸钠中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述新金分枝杆菌的种子按照以下步骤制备得到：
将所述新金枝杆菌接种于种子培养基中，在转速150-200 r/min、通气量0.05-0.5vvm、30-34℃下培养36-48h。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下组分：
碳源 5-20g/L、氮源 5-30 g/L以及无机盐2-15 g/L。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基的pH值为7.0-7.5。
CN202010177312.5A 2020-03-13 2020-03-13 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用 Active CN111349584B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010177312.5A CN111349584B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010177312.5A CN111349584B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111349584A CN111349584A (zh) 2020-06-30
CN111349584B true CN111349584B (zh) 2022-09-27

Family

ID=71192906

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010177312.5A Active CN111349584B (zh) 2020-03-13 2020-03-13 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111349584B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343155A (zh) * 2013-06-26 2013-10-09 山西祖源工贸有限公司 一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法
CN105734105A (zh) * 2014-12-10 2016-07-06 天津金耀集团有限公司 分支杆菌促进植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮的方法
CN105838633A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海市农药研究所有限公司 一种偶发分枝杆菌及其应用
CN106854630A (zh) * 2017-02-21 2017-06-16 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株生物合成20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮的分枝杆菌及合成方法
CN109251870A (zh) * 2018-07-09 2019-01-22 沈阳旺宁生物科技有限公司 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
CN109674802A (zh) * 2019-03-19 2019-04-26 江西本草天工科技有限责任公司 甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途
CN110564652A (zh) * 2019-10-01 2019-12-13 江苏佳尔科药业集团股份有限公司 分枝杆菌及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343155A (zh) * 2013-06-26 2013-10-09 山西祖源工贸有限公司 一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法
CN105734105A (zh) * 2014-12-10 2016-07-06 天津金耀集团有限公司 分支杆菌促进植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮的方法
CN105838633A (zh) * 2015-01-13 2016-08-10 上海市农药研究所有限公司 一种偶发分枝杆菌及其应用
CN106854630A (zh) * 2017-02-21 2017-06-16 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株生物合成20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮的分枝杆菌及合成方法
CN109251870A (zh) * 2018-07-09 2019-01-22 沈阳旺宁生物科技有限公司 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
CN109674802A (zh) * 2019-03-19 2019-04-26 江西本草天工科技有限责任公司 甾体类化合物在制备抗炎药物中的用途
CN110564652A (zh) * 2019-10-01 2019-12-13 江苏佳尔科药业集团股份有限公司 分枝杆菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mycobacterium sp. BFZ304转化植物甾醇产9α-羟基雄烯二酮培养基的响应面优化;柳相鹤等;《食品工业科技》;20160510(第16期);162-167 *
高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的分枝杆菌诱变选育及工艺优化;马洋等;《生物工程学报》(第07期);143-151 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111349584A (zh) 2020-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101659928A (zh) 一种新型的微生物培养基
WO2003064674A2 (en) Process for fermentation of phytosterols to androstadienedione
AU2003240010A1 (en) Process for fermentation of phytosterols to androstadienedione
CN103215335B (zh) 霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的方法
CN102321678A (zh) 一种微生物转化制造1α-羟基维生素D的方法
CN111349584B (zh) 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用
CN109251870B (zh) 一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备hip的应用
CN104694609A (zh) 一种植物甾醇转化为雄烯二酮转化效率的提高方法
CN110527650A (zh) 一种假诺卡氏菌及其应用
CN110628860A (zh) 植物甾醇转化分离9α-OH-AD和甲酯物的方法
CN103266161B (zh) 重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis产ADD的发酵策略
CN109673393A (zh) 一种蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的生产方法
CN107058452A (zh) 一种醋酸泼尼松及其中间体的制备方法
CN107267419B (zh) 一种生产4-hp的菌株及高产量4-hp的制备方法
CN108707553B (zh) 能够高效转化4ad特异性合成睾内酯酮和add的菌株及其应用
CN113136358A (zh) 一种提高人参皂苷产量的好氧共培养益生菌发酵工艺
CN104419646B (zh) 一株能生物合成1,2‑二氢睾内酯(testololactone)的简单青霉及合成方法
CN114395494B (zh) 一株塞伯林德纳氏酵母t52及其应用
CN105483028B (zh) 一种利用赤霉菌合成11α,15α-diOH-沃氏氧化物的方法
CN110041401B (zh) 肯塔森纳霉素及其制备方法和应用
CN106916872B (zh) 一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法
CN113817795B (zh) 一种醋酸泼尼松的发酵方法
CN106591155A (zh) 尖孢镰刀菌株及其在制备3β，7α，15α‑三羟基雄甾‑5‑烯‑17‑酮中的应用
CN105734105A (zh) 分支杆菌促进植物甾醇转化为9α-羟基雄烯二酮的方法
CN111500498B (zh) 一种新金分枝杆菌及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant