CN106854630A - 一株生物合成20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮的分枝杆菌及合成方法 - Google Patents

一株生物合成20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮的分枝杆菌及合成方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106854630A
CN106854630A CN201611054020.2A CN201611054020A CN106854630A CN 106854630 A CN106854630 A CN 106854630A CN 201611054020 A CN201611054020 A CN 201611054020A CN 106854630 A CN106854630 A CN 106854630A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alkene
dinorchola
ketone
hydroxyl
seed culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611054020.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106854630B (zh
Inventor
王玉
李雪梅
冯进辉
吴洽庆
朱敦明
马延和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Xianju Junye Pharmaceutical Co ltd
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201611054020.2A priority Critical patent/CN106854630B/zh
Publication of CN106854630A publication Critical patent/CN106854630A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106854630B publication Critical patent/CN106854630B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株分枝杆菌FJH0105‑16及用该菌发酵植物甾醇生产20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮的方法。该菌株在2016年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.13234。生产方法为：采用分枝杆菌（Mycobacterium sp.）FJH0105‑16为菌种，经过斜面种子培养、一级种子培养及发酵罐发酵转化，加入乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮粗品，摩尔收率不低于71%，重结晶后得到产品，目标产物纯度>95%。

Description

一株生物合成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌 及合成方法
技术领域
本发明涉及一种生产甾体激素的菌株和制备方法，具体是一株生物合成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮(22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one)的分枝杆菌及其合成方法。
背景技术
20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，英文名为22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one，化学式为C22H34O2，分子量为330.25。20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮可以作为合成许多甾体激素药物的中间体，如肾上腺皮质激素，孕激素，蛋白同化激素等。
二十世纪70年代，研究学者在考察利用分枝杆菌转化甾醇为C19甾体化合物(雄甾-4-烯-3,17-二酮，雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮)时，20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮做为一种副产物被发现并且鉴定出来，产量仅为40μg/ml，与主产物雄甾-4-烯-3,17-二酮的比例不到1/10(Marsheck W J,Karychy S,Muir R D.Microbial degradation ofsterols.Applied Microbiology,1972,23:72-77；US Pat.No.3759791)。为了提高20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的产量，研究学者通过诱变选育或基因改造的手段去改造菌种，取得了相应的研究成果。US Pat.No.4223091报道了用紫外诱变的方法得到一株分枝杆菌Mycobacterium parafortuitum complex MCI0617，转化胆固醇得到的主产物为20-羟基-23,24-二降胆-1,4-二烯-3-酮，副产物为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，产量为0.44g/l。Xu等报道了用基因改造的手段得到的分枝杆菌，利用大量静息细胞转化植物甾醇，底物投料浓度为40g/l，转化144h，底物转化率仅60％，得到的主产物为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，摩尔产率为47％，反应中还包含其它副产物，不适合大规模工业生产(Xu L Q,Liu Y J,Yao K,et al.Unraveling and engineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism,2016,6:21928)。
综上所述，目前由甾醇制备20-羟基-23,24-二降胆-1,4-二烯-3-酮的方法，还存在转化效率低，副产物多，转化时间长等问题，仍需要探索利用新的菌种转化甾醇制备20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的研究，从而提高投料浓度、产率和产品纯度，以进一步降低生产成本，同时减少对环境的污染。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株发酵植物甾醇生产20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16，并提供了使用该分枝杆菌生物合成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下：
本发明提供一株发酵植物甾醇生产20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16，该菌株已于2016年11月3日在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Mycobacterium sp.，保藏编号为CGMCC NO.13234。分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16通过自行分离得到的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)1229-3诱变选育得到。原始菌株为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)1229-3，该菌株转化植物甾醇得到主产物雄甾-4-烯-3,17-二酮，副产物20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，两者的比例为2∶1。该菌株于天津益海嘉里油脂公司的土壤中筛选得到。
所述分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16的主要特征如下：革兰氏染色阳性，细胞为杆状，菌落圆形，规则，表面光滑，边缘整齐，质地粘状，菌落颜色为黄色。其16SrDNA具有如序列表中所示的核苷酸序列，序列长度为1422bp。
本发明的发酵反应方程式可为：
利用上述的菌株发酵生产20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，该方法包括如下步骤：
(1)斜面种子培养：将Mycobacterium sp.FJH0105-16接种于斜面种子培养基，28～32℃培养3-4天，所述斜面培养基配方为，马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，自然pH值；
(2)一级种子培养：将上述斜面种子培养的菌落接入液体种子培养基中，28～32℃，180～220r/min培养2-4天，得到种子液，所述液体种子培养基的配方为，葡萄糖6g/l，酵母提取物10g/l，Na2HPO4 4.5g/l，KH2PO4 3.4g/l，0.2％吐温80，pH 7.0；
(3)发酵罐发酵转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮：将步骤(2)得到的种子液体按照接种量10-15％，在28～32℃，转速为400～600rpm，通气比0.2～0.4vvm条件下转化120～192小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆40～60g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油50～200g/l，植物甾醇5～40g/l，pH 7.0。
(4)产物的分离提取：加入等体积乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮粗品，重结晶后得到产品。
本发明的有益效果：本发明所提供的菌株发酵制备20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，摩尔收率不低于71％，得到的产品纯度高，大于95％，易于分离纯化，降低了生产成本，同时减少对环境的污染。相对于现有技术具有明显的进步。
附图说明
图1所示的是20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮标样的HPLC图；
图2所示的是实施例中转化产品20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的HPLC图；
图3所示的是实施例制得的20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的1H-NMR图。
具体实施方式
实施例1：诱变获得菌株Mycobacterium sp.FJH0105-16
1.1原生质体制备
原始菌株为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)1229-3，该菌株转化植物甾醇得到主产物雄甾-4-烯-3,17-二酮，副产物20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，两者的比例为2∶1。该菌株于天津益海嘉里油脂公司的土壤中筛选得到。将保藏的原始菌株甘油管融化后以2％的接种量接种于种子培养基中，30℃，200rpm培养36h，将种子液以5％接种量转接到含12.5g/l甘氨酸的种子培养基中，培养24h，6000rpm，10min收集菌体。用高渗缓冲液(加0.2％吐温80)洗涤菌体两遍。将菌体重悬到高渗酶解液中，溶菌酶浓度50mg/ml，酶解3h，8000rpm，20min离心去除上清酶液，再用高渗缓冲液将沉淀重悬，即得原生质体悬液。
种子培养基：酵母提取物10g/l，Na2HPO4 4.5g/l，KH2PO4 3.4g/l，0.2％吐温80，pH7.0。
高渗缓冲液：蔗糖171g/l，马来酸2.32g/l，六水氯化镁4.06g/l，pH 6.5。
1.2原生质体诱变
将得到的原生质体悬液，分别加入不同浓度的MNNG(0.1-2.0mg/ml),于30℃，85rpm避光振荡1h。诱变后的原生质体悬液稀释不同倍数涂布于高渗再生固体培养基上，培养4-6天以获得单菌落。
高渗再生固体培养基：蔗糖103g/l，硫酸钾0.25g/l，六水氯化镁10.12g/l，葡萄糖10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸二氢钾0.05g/l，二水氯化钙2.22g/l，Tris乙磺酸5.73g/l，琼脂15g/l。
1.3菌株筛选
挑取高渗再生固体培养基上的菌落接种到初筛培养基中，凡是在初筛培养基中能快速生长的菌株，再进行摇瓶转化测试。
初筛培养基：醋酸铵1.5g/l，磷酸二氢钾0.8g/l，磷酸氢二钾0.4g/l，七水硫酸镁0.2g/l，七水硫酸亚铁0.005g/l，七水硫酸锌0.002g/l，七水氯化锰0.0005g/l，植物甾醇0.8g/l，琼脂15g/l，pH 7.0。
1.4菌种摇瓶转化测试
诱变后的菌株在液体种子培养基中，30℃，200rpm培养3天，以10％的接种量转接到转化培养基中，30℃，200rpm，转化3天，转化样品用三倍体积的乙酸乙酯萃取，取上清进行高效液相色谱(HPLC)分析，根据液相结果确定目标菌株优劣。
高效液相色谱测定方法：色谱柱：Agilent C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇∶水＝80∶20，柱温30℃，等梯度洗脱，流速为1.0ml/min，进样量2μl，检测波长254nm。
液体种子培养基：葡萄糖6g/l，酵母提取物10g/l，Na2HPO4 4.5g/l，KH2PO4 3.4g/l，0.2％吐温80，pH 7.0。
转化培养基：甘油5g/l，硫酸铵3g/l，七水硫酸镁0.2g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，七水硫酸锌0.002g/l，植物甾醇5g/l，0.05M磷酸缓冲液，pH 7.0。
通过上述方法筛选得到一株优秀的变异菌株，将之命名为分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，即分枝杆菌(Mycobacterium sp.)CGMCC NO.13234。
实施例2：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法
2.1斜面种子培养
将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCCNO.13234，30℃培养3天。所述斜面培养基配方为，马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，pH值自然。
2.2一级种子培养
将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，200rpm培养2天，得到种子液。所述液体种子培养基的配方为，葡萄糖6g/l，酵母提取物10g/l，Na2HPO44.5g/l，KH2PO43.4g/l，0.2％吐温80，pH 7.0。
2.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮
将步骤2.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量10％，转化温度30℃，转速400rpm，通气比0.2vvm，转化时间72小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆40g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油50g/l，植物甾醇5g/l，pH 7.0。
2.4产物的分离提取
植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。
实施例3：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法
3.1斜面种子培养
将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCCNO.13234，30℃培养3天。所述培养基组分如实施例2所示。
3.2一级种子培养
将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，200rpm培养2天，得到种子液。所述液体种子培养基的组分如实施例2所示。
3.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮
将步骤3.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量10％，转化温度30℃，转速400rpm，通气比0.3vvm，转化时间108小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆50g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油75g/l，植物甾醇10g/l，pH7.0。
3.4产物的分离提取
植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。
实施例4：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23，24-二降胆-4- 烯-3-酮的方法
4.1斜面种子培养
将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCCNO.13234，30℃培养3天。所述培养基组分如实施例2所示。
4.2一级种子培养
将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，200rpm培养3天，得到种子液。所述液体种子培养基的组分如实施例2所示。
4.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮
将步骤4.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量12％，转化温度30℃，转速500rpm，通气比0.4vvm，转化时间156小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆50g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油125g/l，植物甾醇20g/l，pH7.0。
4.4产物的分离提取
植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。
实施例5：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法
5.1斜面种子培养
将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCCNO.13234，30℃培养3天。所述培养基组分如实施例2所示。
5.2一级种子培养
将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，220rpm培养3天，得到种子液。所述液体种子培养基的组分如实施例2所示。
5.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮
将步骤5.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量15％，转化温度30℃，转速600rpm，通气比0.35vvm，转化时间192小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆60g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油200g/l，植物甾醇40g/l，pH7.0。
5.4产物的分离提取
植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一株生物合成20-羟基-23
,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌及合成方法
<130> Xu L Q, Liu Y J, Yao K, et al. Unraveling and engineering the
production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism,
2016, 6: 21928
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> Mycobacterium sp. FJH0105-16
<400> 1
ggcaaggggg cagcttacca tgcagtcgaa cggaaaggcc cttcggggta ctcgagtggc 60
gaacgggtga gtaacacgtg ggtgatctgc cctgcacttt gggataagcc tgggaaactg 120
ggtctaatac cgaatatgat catcggcttc atggtcggtg gtggaaagct tttgcggtgt 180
gggatgggcc cgcggcctat cagcttgttg gtggggtaat ggcctaccaa ggcgacgacg 240
ggtagccggc ctgagagggt gaccggccac actgggactg agatacggcc cagactccta 300
cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag cgacgccgcg 360
tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcagca cagacgaagc gcaagtgacg 420
gtatgtgcag aagaaggacc ggccaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtc 480
cgagcgttgt ccggaattac tgggcgtaaa gagctcgtag gtggtttgtc gcgttgttcg 540
tgaaaactca cagcttaact gtgggcgtgc gggcgatacg ggcagactag agtactgcag 600
gggagactgg aattcctggt gtagcggtgg aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg 660
gcgaaggcgg gtctctgggc agtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca 720
ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacggtgggt actaggtgtg ggtttccttc 780
cttgggatcc gtgccgtagc taacgcatta agtaccccgc ctggggagta cggccgcaag 840
gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggattaattc 900
gatgcaacgc gaagaacctt acctgggttt gacatgcaca ggacgctggt agagatatca 960
gttcccttgt ggcctgtgtg caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcctatg ttgccagcgg gttatgccgg 1080
ggactcgtag gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140
atgcccctta tgtccagggc ttcacacatg ctacaatggc cggtacaaag ggctgcgatg 1200
ccgtgaggtg gagcgaatcc tttcaaagcc ggtctcagtt cggatcgggg tctgcaactc 1260
gaccccgtga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg tgaatacgtt 1320
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt catgaaagtc ggtaacaccc gaagccggtg 1380
gcctaacccc ttgtgggagg agccgtcgaa ggtgatcgcg gt 1422

Claims (3)

1.一株能生物合成20-羟基-23, 24-二降胆-4-烯-3-酮的菌株，其名称为分枝杆菌（Mycobacterium sp.）FJH0105-16，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No. 13234。
2.由权利要求1所述的菌株能转化植物甾醇为20-羟基-23, 24-二降胆-4-烯-3-酮。
3.一种制备权利要求2所述的20-羟基-23, 24-二降胆-4-烯-3-酮的方法，其包括如下步骤：
（1）斜面种子培养：将Mycobacterium sp.FJH0105-16接种于斜面种子培养基，28~32℃培养3-4天，所述斜面培养基配方为，马铃薯200 g/l，葡萄糖20 g/l，琼脂15 g/l，自然pH值；
（2）一级种子培养：将上述斜面种子培养的菌落接入液体种子培养基中，28~32℃，180~220 r/min培养2-4天，得到种子液，所述液体种子培养基的配方为，葡萄糖6 g/l，酵母提取物 10 g/l，Na2HPO4 4.5 g/l，KH2PO4 3.4 g/l，0.2%吐温80，pH 7.0；
（3）发酵罐发酵转化生成20-羟基-23, 24-二降胆-4-烯-3-酮：将步骤（2）得到的种子液体按照接种量10~15%，在28~32℃，转速为400~600 rpm，通气比0.2~0.4 vvm条件下转化120~192小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆40~60 g/l，磷酸氢二钾 2 g/l，七水硫酸镁1 g/l，硝酸钠 2 g/l，豆油50~200 g/l，植物甾醇5~40 g/l，pH 7.0；
（4）产物的分离提取：加入等体积乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到20-羟基-23, 24-二降胆-4-烯-3-酮粗品，重结晶后得到产品。
CN201611054020.2A 2017-02-21 2017-02-21 一株生物合成22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌及合成方法 Active CN106854630B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611054020.2A CN106854630B (zh) 2017-02-21 2017-02-21 一株生物合成22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌及合成方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611054020.2A CN106854630B (zh) 2017-02-21 2017-02-21 一株生物合成22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌及合成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106854630A true CN106854630A (zh) 2017-06-16
CN106854630B CN106854630B (zh) 2020-11-27

Family

ID=59125642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611054020.2A Active CN106854630B (zh) 2017-02-21 2017-02-21 一株生物合成22-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌及合成方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106854630B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111349584A (zh) * 2020-03-13 2020-06-30 广东本科生物工程股份有限公司 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用
CN112029701A (zh) * 2020-11-05 2020-12-04 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用
CN112094797A (zh) * 2020-11-05 2020-12-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 基因工程菌及其制备9α,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的应用
WO2021120127A1 (zh) * 2019-12-19 2021-06-24 湖南科瑞生物制药股份有限公司 制备胆固醇、其衍生物及类似物的方法
RU2767610C2 (ru) * 2019-12-10 2022-03-18 Общество с ограниченной ответственностью "Фарминс" (ООО "Фарминс") Рекомбинантные микобактериальные штаммы-продуценты и их использование для получения 22-функционализированных стероидов

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0001622A1 (en) * 1977-10-14 1979-05-02 Mitsubishi Kasei Corporation A process for producing steroidal alcohols
KR820001188B1 (ko) * 1978-10-10 1982-06-29 스즈끼 에이지 스테로이드 알코올의 제조방법
KR100432054B1 (ko) * 2001-05-11 2004-05-17 (주)유진사이언스 스테롤로부터 4-안드로스텐-3,17-디온/안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온으로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물 및 이의 제조방법
CN104195209A (zh) * 2014-09-02 2014-12-10 常州大学 一种植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法
CN104694609A (zh) * 2013-12-09 2015-06-10 天津金耀集团有限公司 一种植物甾醇转化为雄烯二酮转化效率的提高方法
CN105886418A (zh) * 2014-12-01 2016-08-24 陈美华 偶发分枝杆菌在发酵生产表博醇中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0001622A1 (en) * 1977-10-14 1979-05-02 Mitsubishi Kasei Corporation A process for producing steroidal alcohols
KR820001188B1 (ko) * 1978-10-10 1982-06-29 스즈끼 에이지 스테로이드 알코올의 제조방법
KR100432054B1 (ko) * 2001-05-11 2004-05-17 (주)유진사이언스 스테롤로부터 4-안드로스텐-3,17-디온/안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온으로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물 및 이의 제조방법
CN104694609A (zh) * 2013-12-09 2015-06-10 天津金耀集团有限公司 一种植物甾醇转化为雄烯二酮转化效率的提高方法
CN104195209A (zh) * 2014-09-02 2014-12-10 常州大学 一种植物甾醇制备4-雄烯二酮的方法
CN105886418A (zh) * 2014-12-01 2016-08-24 陈美华 偶发分枝杆菌在发酵生产表博醇中的应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI-QIN XU等: ""Unraveling and engineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
VLAIMIR SCHWARZ等: ""Biodegradation of cholesterol by a mutant of the Mycobacterium species"", 《COLLECTION OF CZECHOSLOVAK CHEMICAL COMMUNICATIONS》 *
徐玲霞等: ""雄烯二酮高产菌新分枝杆菌MN4的全基因组测序及序列分析"", 《微生物学报》 *
杨英等: ""双液相系统中生物降解植物甾醇制备雄烯二酮工艺"", 《农业机械学报》 *
柏挺: ""双液相系统中分枝杆菌降解植物甾醇为雄烯二酮的工艺优化"", 《科技与企业》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2767610C2 (ru) * 2019-12-10 2022-03-18 Общество с ограниченной ответственностью "Фарминс" (ООО "Фарминс") Рекомбинантные микобактериальные штаммы-продуценты и их использование для получения 22-функционализированных стероидов
WO2021120127A1 (zh) * 2019-12-19 2021-06-24 湖南科瑞生物制药股份有限公司 制备胆固醇、其衍生物及类似物的方法
CN111349584A (zh) * 2020-03-13 2020-06-30 广东本科生物工程股份有限公司 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用
CN111349584B (zh) * 2020-03-13 2022-09-27 广东本科生物工程股份有限公司 一种新金分枝杆菌及其在制备9α-羟基-20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3酮中的应用
CN112029701A (zh) * 2020-11-05 2020-12-04 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种基因工程菌及其在制备22-羟基-23，24-双降胆甾-4-烯-3-酮中的应用
CN112094797A (zh) * 2020-11-05 2020-12-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 基因工程菌及其制备9α,22-二羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106854630B (zh) 2020-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106854630A (zh) 一株生物合成20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮的分枝杆菌及合成方法
CN102586139B (zh) 一种高产ad/add的菌株及高效生产ad/add的方法
CN103898004A (zh) 假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法
CN111621448A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌sn-1及其发酵生产胞外多糖的方法
CN111154673A (zh) 一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用
Huang et al. Production of androstenones from phytosterol by mutants of Mycobacterium sp.
US8148133B2 (en) Fossil fuel-free process of lignocellulosic pretreatment with biological hydrogen production
CN111471603A (zh) 一种产β-葡萄糖苷酶的生香季也蒙毕赤酵母菌与应用
CN103468606B (zh) 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用
CN112280701A (zh) 一株假小链双歧杆菌及其应用
CN103740598A (zh) 一株产油内生真菌Salicorn5及其应用
Hu et al. Identification and a phased pH control strategy of diosgenin bio-synthesized by an endogenous Bacillus licheniformis Syt1 derived from Dioscorea zingiberensis CH Wright
CN101402928B (zh) 微生物转化植物甾醇为单产雄甾二烯二酮的菌株
US20210317489A1 (en) Strain of serratia liquefaciens and a method of producing heliotropin with the same strain
CN100564515C (zh) 一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用
Ranadive et al. Strain improvement of Sporidiobolus johnsonii ATCC 20490 for biotechnological production of Coenzyme Q10
CN112694994A (zh) 贝莱斯芽孢杆菌及联产维生素k2和伊枯草菌素a的方法
CN116179400B (zh) 一株产重排甾体化合物的黏细菌及其应用
CN104403974A (zh) 一株高产雄甾-4-烯-3,17-二酮的植物甾醇转化菌株的选育
CN113249248B (zh) 一种暗红戈登氏菌、用途及生产色素的方法
CN116836883B (zh) 一株帕姆酒耐热梭菌及其应用
CN113215064B (zh) 一株产美沙达唑类化合物的黏细菌及其应用
CN114426928B (zh) 一种抑制杂菌的微藻培养方法
CN101993869B (zh) 真菌次级代谢功能改造相关实验技术及其用途
CN115873657B (zh) 一种无需使用有机溶剂的裂殖壶菌脂质提取方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220920

Address after: No.32, Xiqi Road, Airport Economic Zone, Binhai New Area, Tianjin 300308

Patentee after: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

Patentee after: ZHEJIANG XIANJU JUNYE PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: No.32, Xiqi Road, Airport Economic Zone, Dongli District, Tianjin

Patentee before: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES