CN101402928B - 微生物转化植物甾醇为单产雄甾二烯二酮的菌株 - Google Patents
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Abstract
微生物转化植物甾醇为单产雄甾二烯二酮的菌株，属于生物工程中发酵技术领域。本发明筛选的菌株，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloiquefaciens.)ST06-95，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208135。以从自然界采样，分离进行初步筛选，斜面保藏，以此野生菌株ST06作为出发菌株；经紫外诱变后筛选得到主要产雄甾烯酮的菌株ST06-95，显示在温度30℃、pH7.0、220r/min培养60h达到对数生长期，将生长期的菌体以12％(V/V)的接种量接入发酵培养基，在30℃、pH7.0、220r/min发酵6-7d，对发酵产物进行定量检测，产物ADD含量超过1500mg/L，ADD占到AD与ADD总和的98％。为微生物转化甾体药物的工业化提供了基础。
Description
技术领域
用微生物转化植物甾醇生产甾体药物关键中间体雄甾二烯二酮，属于生物工程中发酵技术领域。
背景技术
1949年，Hench等发现可的松对风湿性关节炎具有突出疗效，而且证实可的松和氢化可的松都属于肾上腺皮质激素，使甾体皮质激素成为具有高疗效和高经济价值的药物。由于激素在动物体内含量极低，因而不能依靠直接从动物原料提取的方法大量制备。目前多用半合成的方法，即从动植物体内获得具有甾体母核环戊烷多氢菲的原料，然后通过酶转化和化学法改造的方法制备。制备甾体药物的起始原料甾醇最初源自动物，但来源少、成本高而远不能满足人们的需要。后来人们找到可供合成可的松和避孕药的植物来源原料，加快了甾体药物工业的发展。如墨西哥从薯蓣和剑麻生产薯蓣皂甙配基和剑麻皂甙配基，产量分别占世界第一和第二位。国际上目前主要依赖墨西哥薯蓣皂甙配基为原料的西方国家的甾体生产，但由于受墨西哥政府采取的资源保护政策影响而使成本大幅度增加。另外，自然界还有另外丰富的动植物资源可供开发利用，如：洗羊毛废水或鱼油中所含胆固醇，大豆油、菜油、棉籽油的残渣，甘蔗渣，造纸废液中含有的谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等植物甾醇。过去人们曾用化学方法切断这些甾醇的边链使之成为制备甾体药物的中间体，但因收率低、成本高而难以应用于工业生产。
国外八十年代以来，将微生物转化技术应用于甾体药物中间体雄甾烯二酮(androst-4-ene-3，17-dione，4AD)和雄甾二烯二酮(androsta-1，4-diene-3，17-dione，ADD)的制备取得了突破性进展。美国利用本国产的大豆农副产品—豆甾醇为原料，经微生物转化获得甾体药物制备的关键中间体4AD和ADD，以此合成甾体药物，不仅解决了国内薯蓣植物有限而造成的原料瓶颈问题，而且大大地降低了制造成本并减少了环境污染，这是甾体药物领域的一次重大革命。同样，Upjohn公司以豆甾醇为原料，经过生物转化得到的关键中间体来生产皮质激素，其产量约占世界市场的50％。甾体药物的生产取得突飞猛进的发展，这一革命性的变化归功于筛选到了能够将谷甾醇、豆甾醇和胆甾醇等动植物甾醇转化为关键中间体4AD和ADD的微生物菌种，以及研究开发了能用于大规模工业化生产的转化技术。通过微生物转化得到4AD和ADD，以此合成甾体药物不仅可以大大简化甾体药物的生产工艺，降低生产成本，提高产品收率和质量，而且能进行综合利用，减少“三废”污染。从已有的有关信息和资料分析，可认为世界先进国家目前甾体药物制备，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到4AD和ADD后，再进一步制备。
在甾体激素的生产过程中AD(androst-4-ene-3，17-dione，雄甾烯二酮)和ADD(androsta-1，4-diene-3，17-dione，雄甾二烯二酮)是重要的中间体，它们可用于合成矿质皮质激素(螺内酯)、氢化可的松、雄激素(睾酮、甲基睾酮)、甲基雄甾烷醇酮、卵泡激素(乙炔雌二醇、乙炔雌二醇甲酯、雌二醇、雌三醇)、蛋白同化激素、黄体激素等十几种甾体药物。
本发明筛选到高效转化植物甾醇为雄甾二烯二酮的菌株，对该菌进行了鉴定，对其发酵条件进行了初步研究，为微生物转化甾体药物工业化提供了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供：从自然界中筛选到转化植物甾醇为甾体药物中间体雄甾二烯二酮(androsta-1，4-diene-3，17-dione，ADD)和雄甾烯二酮(androst-4-ene-3，17-dione，4AD)的菌株，经紫外诱变后筛选得到主要生产雄甾二烯二酮的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为Bacillus sp ST06-95。对转化产物雄甾二烯二酮进行了鉴定。对发酵条件进行了研究，得到了较高的转化效率。为微生物甾体药物转化的工业化提供了有益的指导。
本发明的技术方案：一株转化植物甾醇为单产雄甾二烯二酮ADD的菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens.)ST06-95，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208135。
目的菌株的鉴定：采用16S rDNA测序，与数据库对照后将该菌命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloiquefaciens。
转化菌株的筛选从自然界采样，分离进行初步筛选，斜面保藏。把培养好的斜面种子用适量无菌的0.5％吐温80水溶液洗下，以2％的接种量接种于种子培养基中，在30℃，220r·min-1的恒温摇床中培养40h，然后以10％的接种量接于发酵培养基中，发酵转化7d。对发酵液进行分析，将转化率高的留下进一步实验。复筛得到转化效果最好的菌株，进一步经紫外诱变筛选得到一株主要生产ADD的菌株，并对其进行鉴定，确定该菌的分子水平的生物学地位。对其进行形态观察与生理生化实验。
所述菌株ST06-95的诱变选育方法，步骤为：
(1)转化菌株的筛选从自然界采样，分离进行初步筛选，斜面保藏，以此野生菌株ST06作为出发菌株；
(2)出发菌株生长曲线与紫外致死率曲线的制定：诱变培养菌悬液置于紫外处照射0、15s、30s、45s、60s、75s、90s，制定致死率曲线，选择致死率在70％-90％的时间诱变；
(3)出发菌株经25W紫外灯下30cm处照射45s，诱变后涂布平板培养基暗室内培养48h，适当稀释涂布于以甾醇为唯一碳源的培养基SM1上暗室培养48h；
(4)从平板中挑取单菌落克隆分别接种到以雄甾烯二酮AD唯一碳源的培养基SM2、雄甾二烯二酮ADD唯一碳源的培养基SM3两种固体培养基中，30℃培养48h；选择在SM2上长势良好，SM3上不长或长势缓慢的菌落进行摇瓶发酵复筛，挑选转化率提高及产物中ADD所占比例提高的菌株；
所述培养基组成：
基本培养基SM以g/L计为：CH3COONH41.5g，MgSO4·7H2O0.2g，K2HPO40.4g，KH2PO40.8g，FeSO4·7H2O5mg，ZnSO4·7H2O2mg，MnCl2·4H2O0.5mg；以去离子水定容至1L；
培养基SM1：在SM基础上，以甾醇为唯一碳源，含量为1g/L；甾醇成分重量百分为：豆甾醇28.70％、β-谷甾醇42.26％、菜油甾醇24.48％、其它甾醇4.56％；
培养基SM2：在SM基础上，以AD为唯一碳源，含量为1g/L。
培养基SM3：在SM基础上，以ADD为唯一碳源，含量为1g/L。
发酵培养基：在SM基础上，添加10g/L的葡萄糖，1g/L的蛋白胨，5g/L甾醇，助溶剂吐温804mL/L；
发酵条件：初始pH7.0，30℃，220r/min发酵6-7天，接种量12％。
用所述ST06-95菌株发酵产雄甾二烯二酮的方法，ST06-95在固体培养基以g/L计：牛肉膏0.3，蛋白胨0.5，NaCl1.5，琼脂2.0，pH7.0，培养48h，然后转入种子培养基以g/L计：牛肉膏0.3，蛋白胨1.0，NaCl1.5，甘油1.5，酵母膏0.3，pH7.0，培养45h，按12％接种量接种于发酵培养基以g/L计：植物甾醇0.8，葡萄糖1，柠檬酸0.2，甘油0.25，柠檬酸亚铁铵0.05，K2H PO40.05，MgSO40.05，(NH4)2HPO41.0，Tween800.3，pH7.0，发酵6-7天。
产物的分离提纯：取出一定的发酵液，用3倍体积的乙酸乙酯萃取，剧烈振荡2～3min后，3500r·min-1离心10min，取上层有机相。
液质联用对产物进行鉴定：将萃取处理后的发酵产物进行检测，确定产物的分子量，确定产物为雄甾烯二酮及雄甾二烯二酮。
薄层层析(TCL)定性分析：用处理好的样品点样于GF254薄板，展开相为石油醚∶乙酸乙酯＝6∶4，饱和30min，展层30min后，自然风干薄板，喷涂50％的H2SO4，在100℃下烘烤20min，然后缓慢降至室温。
紫外比色定量：将上述样品用乙酸乙酯稀释适当的倍数，用U3000型紫外分光光度计测其吸光值，与标准品对照，检测波长为254nm和298nm。
高效液相色谱定量：采用高效液相对产物进行定量测定，确定该菌的转化得率。
本发明的有益效果：从自然界采样，分离进行初步筛选，斜面保藏，以此野生菌株ST 06作为出发菌株；经紫外诱变后筛选得到主要产雄甾烯酮的菌株ST06-95，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，对该菌的生长条件进行了摸索，结果显示在温度30℃、pH 7.0、220r/min培养60h达到对数生长期，将生长期的菌体以12％(V/V)的接种量接入发酵培养基，在30℃、pH 7.0、220r/min发酵6-7d，对发酵产物进行定量检测，产物ADD含量超过1500mg/L，ADD占到AD与ADD总和的98％。为微生物转化甾体药物的工业化提供了基础。
转化所用底物为生产其它药物的下脚料——混合甾醇(其主要含谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等)，或毛纺工业和油脂工业的废水和下脚料，实现废弃物的综合再利用，成本低廉。产品纯度高，转化率高，菌株稳定性好，传代五代转化率不下降。技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如抗生素、维生素、氨基酸生产车间)即可进行生产，不需购置特殊设备和仪器，易于推广应用。目前国内众多抗生素发酵车间因产品年需求或销路问题，年开机生产时间不足半年，在此间隙生产甾体激素关键性中间体，可提高设备的利用率，产生良好的经济效益。
附图说明
图1菌株Bacillus sp.ST 06-95细胞形态；
图2ADD、AD标样的HPLC图谱；
图3发酵产物的HPLC图谱；
生物材料样品保藏
一株转化植物甾醇为单产雄甾二烯二酮ADD的菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens.)ST 06-95，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2008年9月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 208135。
实施例1：有效转化植物甾醇为雄甾烯二酮和雄甾二烯二酮的菌株筛选
具体实施方式
在蚌埠一家炼油厂附近采集的土样，称10g土样与100mL带玻璃珠的三角瓶中摇匀打散，静置2h，取上清液过滤，吸取少量清液与以植物甾醇为唯一碳源的液体培养基(加抑霉菌素)中富集能转化植物甾醇的菌体。取少许富集液适当稀释涂布于以植物甾醇为唯一碳源的固体培养基上培养。挑取长势良好的单菌落200株斜面保存。
培养基组成：CH3COONH41.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.4g，KH2PO40.8g，FeSO4·7H2O 5mg，ZnSO4·7H2O 2mg，MnCl2·4H2O 0.5mg。
底物：豆甾醇28.70％、β-谷甾醇42.26％、菜油甾醇24.48％、其它甾醇4.56％。
把分离纯化后的菌株分批次接种于发酵培养基中，用薄层层析法初步检测发酵液中产物ADD、AD的生成情况，初步筛选20株能有效转化植物甾醇生成雄甾烯二酮和雄甾二烯二酮的菌株，进一步摇瓶发酵，结合紫外与可见分光光度计和高效液相色谱定量检测发酵液中产物ADD、AD的含量，选择主要积累ADD的菌株，并进行传代稳定性验证确定目的菌株。
实施例2：单产雄甾二烯二酮菌株的紫外诱变筛选
以实施例1中得到的菌株为出发菌株，制定其生长曲线、紫外致死率曲线，诱变后稀释适当梯度涂布于以植物甾醇为唯一碳源的固体培养基中暗室48h。从菌落生长状况差异较大的平板中挑取单菌落克隆接种到SM1(SM+植物甾醇)、SM2(SM+AD)、SM3(SM+ADD)三种固体培养基中，30℃培养48h，进行初筛。选择在SM1、SM2上长势良好，SM3上不长或长势缓慢的菌落进行摇瓶发酵复筛，挑选转化率提高，ADD所占产物比例提高的菌株。菌落经鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus sp ST06-95。
实施例3：突变菌株的转化能力的研究
将实施例2中筛选得到的菌株ST06-95在固体培养基(牛肉膏0.3，蛋白胨0.5，NaCl1.5，琼脂2.0，pH7.0)上培养48h，然后转入种子培养基(牛肉膏0.3，蛋白胨1.0，NaCl1.5，甘油1.5，酵母膏0.3，pH7.0)培养45h，按12％接种量接种于发酵培养基(植物甾醇0.8，葡萄糖1，柠檬酸0.2，甘油0.25，柠檬酸亚铁铵0.05，K2HPO40.05，MgSO40.05，(NH4)2HPO41.0，Tween800.3，pH7.0)中发酵7天。乙酸乙酯抽提发酵液，用HPLC分析该溶液中AD、ADD的含量。如图3所示，标样AD对应的出峰时间为9.7min，标样ADD对应的出峰时间为11.1min，诱变后的菌株发酵后，发酵液中的AD含量明显降低。从植物甾醇到AD、AD到ADD的过程均由摩尔生成率来表示。
由表中可以看出菌株诱变后转化能力提高了50％，ADD所占比例提高了20％。
实施例4：5L发酵罐的转化
用实施例3相同的方法制备在100mL/500mL的培养液中培养的种子按12％的接种量接种于2L的无菌培养基(pH7.2)的5L发酵罐中，于1.2vvm，30℃，300rpm震荡培养7天，分析产物的生成情况，以摩尔生成率表示。
从表中可看出ADD在两产物AD与ADD中所占的比例明显提高，同时其菌株转化能力也同时提高。
Claims (2)
1.一株转化植物甾醇为单产雄甾二烯二酮ADD的菌株，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloiquefaciens.)ST 06-95，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 208135。
2.用权利要求1所述ST 06-95菌株发酵产雄甾二烯二酮的方法，其特征是ST 06-95在固体培养基以g/L计：牛肉膏0.3，蛋白胨0.5，NaCl 1.5，琼脂2.0，pH 7.0，培养48h，然后转入种子培养基以g/L计：牛肉膏0.3，蛋白胨1.0，NaCl1.5，甘油1.5，酵母膏0.3，pH 7.0，培养45h，按体积比为12％接种量接种于发酵培养基，发酵培养基以g/L计：植物甾醇0.8，葡萄糖1，柠檬酸0.2，甘油0.25，柠檬酸亚铁铵0.05，K2HPO4 0.05，MgSO4 0.05，(NH4)2HPO4 1.0，Tween80 0.3，pH 7.0，发酵6-7天。
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