CN101012474A - 一种微生物转化法制备薯蓣皂素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物法将薯蓣类皂苷转化为薯蓣皂素的方法，属于天然产物的生物转化和提取技术领域。包括如下步骤：加入碳源和氮源制成种子培养基和发酵培养基；接种米曲霉，通气搅拌发酵；微波辅助提取发酵液，得率比相应的酸水解法提高1.8～2.2倍。本发明的效果和益处是直接将原料粉末进行发酵，提高薯蓣皂素收率，避免酸水解工艺，为原料中淀粉纤维素的综合利用提供了可能性，并且减少了对环境的污染，降低了生产成本。克服了现有工艺酸水解浪费原料，污染严重，投资成本高的缺点。
Description
技术领域
本发明属于天然产物的生物转化和提取技术领域，特别涉及到用微生物将植物中的薯蓣类皂苷转化为薯蓣皂素的方法。
背景技术
薯蓣皂素(式1)，属异螺旋甾烯烷的衍生物，为薯蓣科薯蓣属植物根茎中薯蓣皂苷配基，其配糖体通常为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等。薯蓣皂素具有雌激素作用，可降低胆固醇、止咳、祛痰、脱敏、恢复病变组织以及刺激肝素细胞与胆汁分泌。它是合成多种甾体激素和甾体避孕药比较理想的前体。
薯蓣类皂苷广泛地存在与自然界的植物中，尤其以薯蓣科含量最多。其中分布较广的有盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis wright)、穿山龙薯蓣(D.nipponicaMakino)、小花薯蓣(D.parviflora Ting Sp.Nov)、黄山药(D.Panthaica Prainet.Burk)、柴黄姜(D.nipponica Makno subsp.Deltoidea Wall)及其变种等，各种植物中薯蓣类皂苷的含量因种类不同，在1.1～16.5％之间，且同种植物的含量因不同产地等原因皂苷含量差别较大(张永忠等，中药材，2003，5，376)。
薯蓣皂素的获得方法主要有化学法和生物法。目前工业上应用的薯蓣皂素传统提取方法或改进的提取工艺主要是通过化学法即酸水解法，使用的酸是硫酸或盐酸。处理过程中，大量的水溶性皂苷流失，薯蓣皂素回收率低。酸水解后，原料中含有的大量淀粉成分水解后会导致滤液中的生化需氧量(BOD)、化学需氧量(COD)增高，颜色深，严重污染环境，酸废水处理费用也给企业带来很大的经济负担。
式1
近年来，改进的薯蓣皂素的化学制备方法包括乙醇结晶法(CN1188425C)，超(近)临界水水解法(CN1896093)，汽化酸酸解(CN1709904)，以及采用新的装置设备(CN1182152C)进行生产，但这些方法均无法摆脱酸水解工艺，虽然也有薯蓣皂素的无废水生产方法(CN1850852)和无污染生产方法(CN1850853)的专利的公开，但废水和污染物的处理成本巨大，无疑会增加生产成本。中国专利CN1240791公开了的超临界流体萃取法未使用酸水解工艺，但设备和运行费用昂贵，制约其在生产中的应用。
生物法主要包括自然发酵法、酶解法和微生物法。自然发酵法可以提高产量，主要是通过将薯蓣片泼水加湿，利用环境或药材中存在的酶的酶解作用，该方法虽然简单，但因为空气中存在的各种微生物均会对发酵的效果产生影响，往往使发酵过程难以控制，造成产品质量的不合格，甚至产生有毒有害物质，而且气候条件的变化的影响也很大。
在酶解法的研究方面，中国专利CN1483834介绍了酶法水解薯蓣类皂苷糖基制备低糖基薯蓣类皂苷的方法，通过该方法可以得到低糖基薯蓣类皂苷，但该方法得到的薯蓣皂素较少，无法用于薯蓣皂素的生产中，且成本较高。前苏联633,528号专利介绍了用黑曲霉BKMt-33制取的酶制剂处理蒺藜子地上部分的干粉，然后再进行酸水解，制备薯蓣皂素的方法，比直接酸水解法提高1～1.5倍；中国专利CN1786015公开了酶水解-超临界CO2流体萃取法制备薯蓣皂素的方法，但以上两种方法也无法摆脱酸水解工艺。
微生物转化法是利用微生物的酶系进行催化的化学反应，具有条件温和、反应专一、污染小等特点，更重要的是如果通过适当的微生物和合理的工艺开发研究，可以使用植物粉末直接发酵，在得到收率较高的目标产物的同时综合利用植物粉末中的其他有效成分，大大节省原料，降低产品成本，做到了植物药材有效成分的综合利用。He等的研究表明呋喃甾烷类皂苷在微生物酶系的作用下，可以转化为螺旋甾烷类皂苷(XJ，He et al，Enzyme and Microbial Technology，2006，38，400)，证实了微生物中的酶系具有将薯蓣类皂苷中两类最主要成分转化为薯蓣皂素能力。中国专利CN85108564B介绍了用黑曲霉发酵联产柠檬酸和薯蓣皂素的方法，该方法先将盾叶薯蓣经黑曲霉发酵，再进行酸水解和溶剂提取，薯蓣皂素的收率可达4％，但该专利未能摆脱酸水解工艺，废水处理投入巨大，且未公开黑曲霉发酵法和酸水解法对比效果，无法在不同产地盾叶薯蓣含量差异较大的情况下，正确评定该微生物转化的效率。
目前，生产薯蓣皂素的企业迫切需要的工艺是在充分提取薯蓣皂素的同时，最大程度地降低酸液的排放量，降低生产厂家的生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种米曲霉的微生物发酵原料，再进行溶剂提取，转化薯蓣类皂苷为薯蓣皂素的制备方法，该方法不经过酸水解，简化了生产流程，提高薯蓣皂素的收率，比相应的酸水解法提高1.8～2.2倍，并能够综合利用原料中的淀粉和纤维素。
本发明采用微生物进行薯蓣皂素制备时，发酵所用菌种为米曲霉(Aspergillus oryzae)，购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为CICC 2436。
本发明采用米曲霉(Aspergillus oryzae)进行薯蓣皂素制备时，可以选用底物为含有薯蓣类皂苷的植物，其配糖体通常为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等，优选为盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis wright)，穿山龙薯蓣(D.nipponica Makino)，小花薯蓣(D.parviflora Ting Sp.Nov)，黄山药(D.Panthaica Prain et.Burk)，柴黄姜(D.nipponica Makno subsp.Deltoidea Wall)及其变种，纤细薯蓣(D.gracillima Miq.)，蜀葵叶(D.althacoides Knuth)和粉背薯蓣(D.hypoglauca Palib)等。
本发明采用米曲霉菌株进行薯蓣皂素制备时，其培养基中可利用的碳源选自薯蓣类皂苷或含有薯蓣类皂苷的植物粉末、糊精、柠檬酸盐、甘油、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉，含量0.1～6.0％；氮源可选自酵母粉、复合氨基酸、蛋白胨、玉米浆、尿素、硝酸盐、铵盐、含量0.1～6.0％；转化中可添加磷酸盐、镁盐、钠盐等微量元素，有利于转化率提高。
本发明采用米曲霉菌株进行薯蓣皂素制备时，优化的转化培养基：碳源为麸皮浸出液(10g麸皮加100ml自来水煮沸20min，过滤，滤液加水定容于100ml)10～100％，转化底物0.1～10％。氮源为0.1～3g/L的尿素。
采用本发明菌株进行薯蓣皂素制备时，优化的培养条件为：接种量为5％～15％，摇床转速为100～350rpm，温度为20～40℃，培养时间为18～72小时。发酵进行18～72小时后，改变培养温度为35～70℃，继续培养1～8小时。
本发明采用米曲霉菌株进行薯蓣皂素制备时，优化的分离纯化方法为：发酵液加入一倍体积的20～100％的乙醇或甲醇进行微波辅助提取，脱色并蒸干后，以50～100％的乙醇或甲醇进行反复结晶。
本发明的效果和益处是能够高效转化含薯蓣类皂苷植物中的薯蓣类皂苷为薯蓣皂素，直接将原料粉末进行发酵，提高薯蓣皂素收率的同时，减少了原料浪费，充分利用了原料中的有效成分，为原料中淀粉纤维素的综合利用提供了可能性，并且不采用酸水解，减少了对环境的污染，降低了生产成本。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例，但所举实施例并非理解成对本发明范围的任何限制。
实施例1
培养基：A.种子培养基：麸皮浸出液(10g麸皮加100mL自来水煮沸20min，过滤，滤液加水定容于100mL)30mL。B.发酵培养基：盾叶薯蓣粉末0.9g(60目)，尿素0.1g，KH2PO4 0.03g，麸皮浸出液30mL，121℃灭菌20min。
由米曲霉CICC 2436斜面接种于种子培养基于25℃，24小时培养，发酵培养在250mL摇瓶中进行，实际装液量为30mL，接种量为10％，转速控制为150rpm，温度控制在30℃。发酵进行48小时后，改变培养温度为50℃，继续培养2小时。
培养结束后，加入一倍于发酵液体积的95％乙醇，微波辅助提取，加入1％的医用活性碳进行脱色，蒸去乙醇，用适量的120号汽油浸提至净，浓缩，用适量90％乙醇反复结晶，制得薯蓣皂素的纯品，产品得率3.3％，熔点201～203℃。
取与发酵相同量的盾叶薯蓣0.9g(60目)，按照1∶6的比例加入8％的硫酸，浸泡过夜，高压锅加压水解1小时后(121℃，压力101.3～141.8KPa)，碳酸钠中和至pH7，离心后将残渣于65～70℃干燥，加入60mL的50％乙醇微波提取，加入1％的医用活性碳进行脱色，蒸去乙醇，用适量的120号汽油浸提至净，浓缩，用适量90％乙醇反复结晶，制得薯蓣皂素的纯品，产品得率1.5％，熔点201～203℃。将微生物转化法和酸水解法分离得到的薯蓣皂素进行HPLC分析(流动相：95％甲醇，流速1.0ml/min，检测波长208nm)，制备得到的薯蓣皂素和标准品具保留时间相同，含量分别为95.1和93.2％，质谱显示分子量为414，可以确定为薯蓣皂素。
实施例2
培养基：A.种子培养基：麸皮浸出液30mL。B.发酵培养基：转化底物穿山龙粉末0.9克(60目)，尿素0.08g，KH2PO4 0.03g，麸皮浸出液30mL，121℃灭菌20min。
由米曲霉CICC 2436斜面接种于种子培养基于25℃，24小时培养，发酵培养在250mL摇瓶中进行，实际装液量为30mL，接种量为8％，转速控制为220rpm，温度控制在25℃，发酵进行60小时后，改变培养温度为60℃，继续培养3小时。
培养结束后，加入一倍于发酵液体积的80％甲醇，微波辅助提取，加入1％的医用活性碳进行脱色，蒸去乙醇，用适量的120号汽油浸提至净，浓缩，用适量90％乙醇反复结晶，制得薯蓣皂素的纯品，产品得率2.16％，熔点200～203℃。
取与发酵相同量的盾叶薯蓣0.9g(60目)，按照1∶6的比例加入8％的硫酸，浸泡过夜，高压锅加压水解(121℃，压力101.3～141.8KPa)1小时后，碳酸钠中和至pH7，离心后将残渣于65～70℃干燥，加入60mL的50％乙醇微波提取，加入1％的医用活性碳进行脱色，蒸去乙醇，用适量的120号汽油浸提至净，浓缩，用适量90％乙醇反复结晶，制得薯蓣皂素的纯品，产品得率1.2％，熔点199～202℃。将微生物转化法和酸水解法分离得到的薯蓣皂素进行HPLC分析，含量分别为97.2和93.8％。
实施例3
培养基：A.种子培养基：麸皮浸出液。B.发酵培养基：麸皮浸出液2500mL，转化底物盾叶薯蓣75g，尿素7.5g，KH2PO4 3g，121℃灭菌20min。
由米曲霉CICC 2436斜面接种于种子培养基于种子培养基，装液量为30mL，摇床转速为220rpm，培养温度为30℃，培养时间为24小时；发酵培养在5L发酵罐中进行，实际装液量为2.5L，接种量为10％，转速控制为250rpm，通入空气量1vvm，温度控制在30℃。发酵进行60小时后，改变培养温度为50℃，继续培养2小时。
发酵结束后，加入1倍于发酵液体积的95％乙醇，微波辅助提取。加入1.5％的医用活性碳进行脱色，蒸去乙醇，用适量的120号汽油浸提至净，浓缩，用适量80％甲醇反复结晶，制得薯蓣皂素的纯品，产品得率3.1％，熔点201～203℃。HPLC含量95.2％。
Claims (5)
1.一种微生物转化法制备薯蓣皂素的方法，其特征在于工艺步骤包括：
1)将原料粉碎，加入碳源和氮源，配制种子培养基和发酵培养基；
2)接种米曲霉；
3)搅拌发酵；
4)微波辅助提取发酵液，溶剂提取后结晶。
2.根据权利要求1所述的一种微生物转化法制备薯蓣皂素的方法，其特征在于选用的转化底物为盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis wright)，穿山龙薯蓣(D.nipponica Makino)，小花薯蓣(D.parviflora Ting)，黄山药(D.PanthaicaPrain et.Burk)，柴黄姜(D.nipponica Makno subsp.
Deltoidea Wall)及其变种，纤细薯蓣(D.gracillima Miq.)，蜀葵叶(D.althacoides Knuth)或粉背薯蓣(D.hypoglauca Palib)。
3.根据权利要求1所述的一种微生物转化法制备薯蓣皂素的方法，其特征在于接种米曲霉为Aspergillus oryzae(CICC 2436)，为食品级微生物。
4.根据权利要求1所述的一种微生物转化法制备薯蓣皂素的方法，其特征在于其中转化培养基为：碳源：麸皮浸出液10～100％(麸皮浸出液为10g麸皮加100ml自来水煮沸20min，过滤，滤液加水定容于100ml)或0.1～10％的转化底物；氮源：0.1～3g/L的尿素；优化的培养条件为接种量为5～15％，摇床转速为100～350rpm，温度为20～40℃，发酵8～72小时后，改变培养温度为35～70℃，继续培养1～8小时。
5.根据权利要求1所述的一种微生物转化法制备薯蓣皂素的方法，其特征在于微波辅助提取发酵液，所用溶剂为20～100％的乙醇或甲醇，脱色并蒸干，汽油提取后，用50～100％的乙醇或甲醇反复结晶。
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