CN102703560B

CN102703560B - 利用微生物转化制备睾内酯的方法

Info

Publication number: CN102703560B
Application number: CN201110112251.5A
Authority: CN
Inventors: 李维; 葛方兰; 陈贵英; 张光祥
Original assignee: Sichuan Normal University
Current assignee: Sichuan Normal University
Priority date: 2011-05-03
Filing date: 2011-05-03
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2031-05-03
Also published as: CN102703560A

Abstract

本发明公开了一种利用微生物转化制备睾内酯的方法，主要内容包括：将去氢表雄酮溶于增溶剂，加入到转化溶液制取转化底物溶液；将转化底物溶液置入转化反应设备，加入尖孢镰刀菌，在尖孢镰刀菌静息细胞转化作用下，通过Baeyer-Villiger氧化反应，转化为中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮，转化反应结束后再加入戈登氏菌，在戈登氏菌静息细胞作用下，中间产物转化反应为睾内酯。本发明制备睾内酯的方法，具有工艺路线简便，原料易得，辅料价格低廉，底物转化率高，副产物少，生产成本低等优点，克服了原有生产工艺的不足，可工业化生产。

Description

利用微生物转化制备睾内酯的方法

技术领域

本发明涉及一种利用微生物转化法将脱氢表雄酮制备成甾体原料药睾内酯的方法，属于生物技术领域。

技术背景

睾内酯（Testolactone，17α-氧代-D-扩环-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮)，也称去氢睾内酯，是一种内源性的甾体芳香酶抑制剂,能非竞争性地结合芳香酶,因而能有效地抑制雄激素转化为雌激素。睾内酯通常作为抗肿瘤药物使用,在临床上，主要用于治疗绝经后妇女某些类型的乳腺癌，此外，还可用于治疗女孩性早熟和男性特发性少精子症。

通过化学合成法和微生物转化法均可制备睾内酯。由于化学合成法采用的氧化剂有毒、易爆，对环境污染大（Zinczuk J.et al.An Efficient and EnvironmentallyBenign Chemical Synthesis of Testolactone，J.Braz.Chem.Soc.,Vol.14,970-974,2003），而微生物转化法制备睾内酯条件温和，又具有环境友好性，因而具有更大的应用前景。专利文献U.S Pat.No.283171描述了以镰刀菌（Fusarium）为菌种转化黄体酮及其衍生物制备睾内酯，其底物投料浓度为0.5g/l；专利文献U.SPat.No.292666描述了以镰刀菌Fusarium solani为菌种转化雄烯二酮为睾内酯，转化率为85%；专利文献G.B.Patent No.1220829描述了以镰刀菌（Fusarium sp.）为菌种，以双烯醇酮醋酸酯和16-妊娠双烯醇酮为底物，其底物投料浓度仅为0.5g/l。制备睾内酯的关键步骤是通过Baeyer-Villiger氧化反应使甾体化合物的D环转变形成内酯环，然后在A环的1,2位引入双键。尽管已有上述研究，并取得了相应的研究成果，但微生物转化法制备内睾酯存在副产物多的不足，仍需要探索利用不同菌种转化不同底物制备睾内酯的研究，从而提高投料浓度和转化率，以进一步降低生产成本，同时减少对环境的污染。

发明内容

本发明的目的是针对现有微生物转化制备睾内酯过程中存在的转化效率低、副产物较多等不足，旨在提供一种利用微生物转化制备内睾酯的新方法，以降低生产成本，同时减少对环境的污染。

本发明的发明人对转化所使用的微生物种类、起始化合物、转化条件等进行了长期研究，获得了简便的制备睾内酯的生物工艺路线。本发明的基本内容是选择去氢表雄酮作为起始物，以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和戈登氏菌为转化菌种，采用静息细胞转化法，分两个阶段将底物去氢表雄酮转化为睾内酯。

本发明公开的利用微生物转化制备睾内酯的方法,主要包括以下步骤：

（1）转化底物溶液配制：将起始底物去氢表雄酮溶于增溶剂，经超声波处理后加入到转化溶液，制得转化底物溶液；

（2）一次转化：步骤（1）制取的转化底物溶液置入转化反应设备，加入尖孢镰刀菌静息细胞，通过Baeyer-Villiger氧化反应，起始底物去氢表雄酮转化为中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮；

（3）二次转化：一次转化反应结束后加入戈登氏菌，中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮在戈登氏菌静息细胞作用下转化反应为睾内酯。

在上述技术方案中，所述转化溶液可选自pH为5.8～6.6的磷酸缓冲液和无菌水。转化溶液最好加入一定量的体积浓度为0.05～0.15%的吐温-80，能更有利于转化反应。其中作为转化溶液的磷酸缓冲液可由0.15～0.25mol/L的NaH₂PO₄溶液和0.15～0.25mol/L的Na₂HPO₄溶液按体积比（73.5～92.0）:（26.5～8.0）的比例配制。

在上述技术方案中，所述增溶剂选自体积浓度为0.05～0.15%的吐温-80、乙醇、甲醇和丙酮，优先选用吐温-80。

在上述技术方案中，步骤（2）所进行的一次转化，最好是于26～32℃、200～250rpm和有氧条件下进行转化反应，且转化反应最好进行至稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物条带时结束。

在上述技术方案中，步骤（3）所进行的二次转化，最好是于28～37℃、200～250rpm和有氧条件下进行转化反应,且转化反应至稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到中间产物条带时结束。在二次转化反应过程中，为了取得更好的技术效果可加入羟基化酶抑制剂。羟基化酶抑制剂可选自2,2’-联吡啶和8-羟喹啉。

在上述技术方案中，步骤（2）进行的一次转化反应和步骤（3）进行的二次转化反应，最好在同一制备容器中进行，即在底物经尖孢镰刀菌静息细胞转化结束后，直接在转化液中加入戈登氏菌细胞，进行第二次转化，且第一次转化反应的细胞残留物对第二次的转化无任何影响。

在上述技术方案中，尖孢镰刀菌菌株优先选用尖孢镰刀菌ATCC 10960或ATCC 16416。戈登氏菌菌株优先选用戈登氏菌Gordonia neofelifaecis。戈登氏菌静息细胞最好先在含固醇的培养液中诱导培养。

本发明公开的利用微生物转化制备睾内酯的方法，在利用尖孢镰刀菌将底物去氢表雄酮转化为中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮的过程，反应体系中细胞浓度（湿细胞）可在20-70g/L范围之间调整；在利用戈登氏菌将中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮转化为睾内酯的过程，反应体系中细胞浓度（湿细胞）可在20-100g/L范围之间调整。

本发明第一次转化所采用的尖孢镰刀菌，其细胞的培养过程如下：在固体培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6.0-6.5）上接种镰刀菌孢子，28-30℃培养5-7天，用无菌水洗下孢子，灭菌纱布过滤，制成孢子悬液，孢子浓度为10⁷个/mL，4℃下保存待用，一般此条件下可保存10天以内，不影响活性。以5%的接种量取浓度为1×10⁷个/ml孢子悬液接种于液体培养基（0.5%黄豆粉，0.5%酵母浸出粉，2%葡萄糖，0.5%NaCl，0.5%K₂HPO₄，pH=6.0-6.5）中，200rpm，28-30℃培养3天，离心收集细胞，即为用于转化的静息细胞。

用于增殖尖孢镰刀菌细胞培养的材料不限于以上所述种类，玉米浆、牛肉膏、鱼粉均等均可作为增殖尖孢镰刀菌细胞培养基的氮源和碳源；其中可作为培养基碳源的材料包括蔗糖、淀粉、糖蜜、甘油等。增殖细胞的培养体积，可以根据实验情况加以增减，可以对其种子进行二级甚至三级培养，以得到更多的静息细胞。

第二次转化反应所采用的戈登氏菌，其细胞的培养过程如下：在液体培养基中增殖戈登氏菌，接种一环戈登氏菌于液体培养基（酵母粉0.5%，固醇0.1%，吐温-80 0.1%，NH₄NO₃ 0.1%,KH₂PO₄ 0.02%5,MgSO₄·7H₂O 0.025%,FeSO₄ 0.0001%,pH 7.0）中，30℃,200rpm振荡培养24小时，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液清洗一次，即为戈登氏菌静息细胞。

用于戈登氏菌细胞的培养材料不限于以上所述种类，同样如前所述，可进行调整。具有活性的戈登氏菌静息细胞需要在含固醇的培养基中诱导培养。其中固醇选自胆固醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等。

本发明公开的利用微生物转化制备睾内酯的方法，睾内酯的合成路线如附图1所示。起始底物去氢表雄酮（I）首先在尖孢镰刀菌静息细胞转化作用下，通过Baeyer-Villiger氧化反应，其D环转变形成内酯环，形成中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮（II）；中间产物(II)再在戈登氏菌静息细胞的作用下，将中间产物(II)A环3位的羟基转变酮基，1、2和3、4位均引入了双键，从而制备形成睾内酯（III）。第一次转化所采用的微生物尖孢镰刀菌静息细胞，该菌在多个菌种保藏中心都能获得，第二次转化所采用的戈登氏菌为本发明的发明人研究室分离获得的菌株，并经分类鉴定为放线菌新种（Liu Y.,GeF.L.,Li W.Gordonia neofelifaecis sp.nov.,a cholesterol side-chaincleaving actinomycete isolated from the faeces of Neofelis nebulosa.IntJ Syst Evol Microbiol.2011，61,165-169），该菌种的菌株现保存于农业研究机构保藏中心（地址：美国，61604，伊利诺斯州皮奥里亚市大学北路1815号），编号为NRRL B-59395。

本发明公开的利用微生物转化制备睾内酯的方法，基于发明人分离获得的微生物戈登氏菌，第一次提出了分别以尖孢镰刀菌和戈登氏菌为转化菌、以去氢表雄酮为起始底物，通过两次转化反应制取睾内酯，丰富了微生物转化制备睾内酯的方法。本发明制备睾内酯的方法，具有工艺路线简便，原料易得，辅料价格低廉，底物转化率高，副产物少，生产成本低等优点，克服了原有生产工艺的不足，可工业化生产。

附图说明

附图1是本发明利用微生物转化制备睾内酯的合成路线图。

在合成路线图中，I-去氢表雄酮；II-3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮；III-睾内酯。

具体实施方式

下面通过实施例，对本发明进行进一步的具体说明，以便人们人们更加容易地理解本发明。

在下述各实施例中，各类培养基的各种组分含量百分比，除特别说明之外，均为重量百分比。

实施例1

1）尖孢镰刀菌细胞的培养。在固体培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6.0）上接种镰刀菌孢子，30℃左右培养约5天，用无菌水洗下孢子，灭菌纱布过滤，制成孢子悬液，孢子浓度为10⁷个/mL。以5%的接种量取浓度为1×10⁷个/ml孢子悬液接种于500ml液体培养基（0.5%黄豆粉，0.5%酵母浸出粉，2%葡萄糖，0.5%NaCl，0.5%K₂HPO₄，pH=6.0-6.5）中，200rpm，28-30℃培养3天，离心收集细胞，即为用于转化的静息细胞。

2）转化溶液的配制。转化溶液为磷酸缓冲液，其pH值为6.0。配制如下：分别配制浓度为0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄母液，根据需要，二者按87.7:12.3的比例混合即成浓度为0.2mol/L、pH值为6.0的磷酸盐缓冲液。底物浓度为10g/L，称取一定量的去氢表雄酮溶于质量浓度0.1%的吐温-80中，超声波破碎25min，加入到200ml经灭菌处理的转化溶液中，制取起始底物转化溶液。

3）将尖孢镰刀菌静息细胞接种于上述含有去氢表雄酮的转化溶液中（培养基体积为1L），细胞浓度为50g/L，在28-30℃条件下，转速为200rpm，转化6天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析（TLC:青岛海洋化工的硅胶薄层层析板GF₂₅₄，薄板在105℃活化备用），室温下展开，自然干燥后,用稀硫酸显色，观察底物的转化情况，转化产物为化合物II。当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物的条带时，即可结束第一阶段的转化。经121℃灭菌处理后，待用。

4）戈登氏菌Gordonia neofelifaecis的增殖。接种一环戈登氏菌于液体培养基（酵母粉0.5%，胆固醇0.1%，吐温-80 0.1%，NH₄NO₃ 0.1%,KH₂PO₄ 0.02%5,MgSO₄·7H₂O 0.025%,FeSO₄ 0.0001%,pH 7.0）中30℃,200rpm振荡培养24小时，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液清洗一次，即为戈登氏菌静息细胞。

5）戈登氏菌静息细胞转化中间产物化合物II制备睾内酯。将戈登氏菌静息细胞直接接种于第一阶段转化液中，细胞浓度为50g/L，0.05g/L 2,2’-联吡啶作为羟基化酶抑制剂，在30℃条件下，转速为200rpm，转化5天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开,自然干燥后,直接于254nm的紫外灯下观察睾内酯的产生情况，再用稀硫酸显色，观察化合物II残留的情况；当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到中间产物化合物II的条带时，结束第二阶段的转化，即制得所需的睾内酯。

实施例2

1）尖孢镰刀菌细胞的培养。在固体培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6.0）上接种镰刀菌孢子，28℃培养6天，用无菌水洗下孢子，灭菌纱布过滤，制成孢子悬液，孢子浓度为10⁷个/mL。以5%的接种量取浓度为1×10⁷个/ml孢子悬液接种于500ml液体培养基（1%玉米浆，2%葡萄糖，0.5%NaCl，0.5%K₂HPO₄，pH6.5）中，200rpm，28-30℃培养3天，离心收集细胞，即为用于转化的静息细胞。

2）转化溶液的配制。转化溶液为无菌水，自然pH值。取一定量的去氢表雄酮溶于0.1%吐温-80中，超声波破碎25min。加入到200ml灭菌处理的转化溶液中，底物浓度为10g/L。

3）将尖孢镰刀菌静息细胞接种于上述含有去氢表雄酮转化溶液中（培养基体积为500mL），细胞浓度为25g/L，在30℃条件下，转速为250rpm，转化6天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开，自然干燥后,用稀硫酸显色，观察底物的转化情况，转化产物为化合物II。当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物的条带时，可结束第一阶段的转化。

4）戈登氏菌Gordonia neofelifaecis的增殖。接种一环戈登氏菌于液体培养基（蛋白胨0.5%，谷甾醇0.1%，吐温-80 0.1%，NH₄NO₃ 0.1%,KH₂PO₄ 0.02%5,MgSO₄·7H₂O 0.025%,FeSO₄ 0.0001%,0.0005% NaCl,pH 7.2）中30℃,200rpm振荡培养36小时，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液清洗一次，即为戈登氏菌静息细胞。

5）戈登氏菌静息细胞转化化合物II制备睾内酯。将戈登氏菌静息细胞直接接种于第一阶段转化液中，细胞浓度为25g/L，0.05g/L 2,2’-联吡啶作为羟基化酶抑制剂，在32℃条件下，转速为200rpm，转化3-4天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开,自然干燥后,直接于254nm的紫外灯下观察睾内酯的产生情况，再用稀硫酸显色，观察化合物II残留的情况；当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到化合物II的条带时，结束第二阶段的转化。

实施例3

1）尖孢镰刀菌细胞的培养。在固体培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6.0-6.5）上接种镰刀菌孢子，30℃培养7天，用无菌水洗下孢子，灭菌纱布过滤，制成孢子悬液，孢子浓度为10⁷个/mL。以5%的接种量取浓度为1×10⁷个/ml孢子悬液接种于1L液体培养基（0.5%黄豆粉，0.5%酵母浸出粉，2%葡萄糖，0.5%NaCl，0.5%K₂HPO₄，pH=6.0-6.5）中，200rpm，30℃培养3天，离心收集细胞，即为用于转化的静息细胞。

2）转化溶液的配置。转化溶液为磷酸缓冲液，其pH值为5.5。配置如下：分别配制浓度为0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄母液，二者按92:8的比例混合即成浓度为0.2mol/L、pH值为5.5的磷酸盐缓冲液。取一定量的去氢表雄酮溶于甲醇。加入到200ml灭菌处理的转化溶液中，底物浓度为10g/L。

3）将尖孢镰刀菌静息细胞接种于上述含有去氢表雄酮转化溶液中（培养基体积为1L），细胞浓度为40g/L，在30℃条件下，转速为200rpm，转化6天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开，自然干燥后,用稀硫酸显色，观察底物的转化情况，转化产物为化合物II。当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物的条带时，即可结束第一阶段的转化。经121℃灭菌处理后，待用。

4）戈登氏菌Gordonia neofelifaecis的增殖。接种一环戈登氏菌于液体LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L）中培养24小时，以10%的接种量转接至10只分别装有500ml新鲜液体培养基（酵母粉0.5%，豆甾醇0.1%，吐温-80 0.1%，NH₄NO₃ 0.1%,KH₂PO₄ 0.02%5,MgSO₄·7H₂O 0.025%,FeSO₄0.0001%,pH 7.0）的三角瓶中30℃,200rpm振荡培养24小时，离心收集细胞，用磷酸盐缓冲液清洗一次，即为戈登氏菌静息细胞。

5）戈登氏菌静息细胞转化化合物II制备睾内酯。将戈登氏菌静息细胞直接接种于第一阶段转化液中，细胞浓度为40g/L，0.05g/L 8-羟基喹啉作为羟基化酶抑制剂，在30℃条件下，转速为200rpm，转化4天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开,自然干燥后,直接于254nm的紫外灯下观察睾内酯的产生情况，再用稀硫酸显色，观察化合物II残留的情况；当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到化合物II的条带时，结束第二阶段的转化。

实施例4

1）尖孢镰刀菌细胞的培养。在固体培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6.0）上接种镰刀菌孢子，30℃培养7天，用无菌水洗下孢子，灭菌纱布过滤，制成孢子悬液，孢子浓度为10⁷个/mL。以5%的接种量取浓度为1×10⁷个/ml孢子悬液接种于1L液体培养基（土豆20%，葡萄糖2%，pH 6.0）中，200rpm，30℃培养3天，离心收集细胞，即为用于转化的静息细胞。

2）转化溶液的配置。转化溶液为磷酸缓冲液，其pH值为6.3。配置如下：分别配制浓度为0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄母液，二者按77.5:22.5的比例混合即成浓度为0.2mol/L、pH值为6.3的磷酸盐缓冲液。取一定量的去氢表雄酮溶于乙醇。加入到200ml灭菌处理的转化溶液中，底物浓度为10g/L。

3）将尖孢镰刀菌静息细胞接种于上述含有去氢表雄酮转化溶液中（培养基体积为500ml），细胞浓度为60g/L，在30℃条件下，转速为250rpm，转化6天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开，自然干燥后,用稀硫酸显色，观察底物的转化情况，转化产物为化合物II。当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物的条带时，即可结束第一阶段的转化。经121℃灭菌处理后，待用。

4）戈登氏菌Gordonia neofelifaecis的增殖。接种一环戈登氏菌于液体LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0）中培养24小时，以10%的接种量转接至5只分别装有500ml新鲜液体培养基（菜油甾醇0.1%，吐温-80 0.1%，NH₄NO₃ 0.1%,KH₂PO₄ 0.02%5,MgSO₄·7H₂O 0.025%,FeSO₄0.0001%,pH 7.0）的三角瓶中30℃,200rpm振荡培养24小时，离心收集细胞，即为戈登氏菌静息细胞。

5）戈登氏菌静息细胞转化化合物II制备睾内酯。将戈登氏菌静息细胞直接接种于第一阶段转化液中，细胞浓度为60g/L，0.05g/L 2,2’-联吡啶作为羟基化酶抑制剂，在30℃条件下，转速为250rpm，转化4天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开,自然干燥后,直接于254nm的紫外灯下观察睾内酯的产生情况，再用稀硫酸显色，观察化合物II残留的情况；当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到化合物II的条带时，结束第二阶段的转化。

实施例5

1）尖孢镰刀菌细胞的培养。在固体培养基（土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH 6.0）上接种镰刀菌孢子，30℃培养6天，用无菌水洗下孢子，灭菌纱布过滤，制成孢子悬液，孢子浓度为10⁷个/mL。以10%的接种量取浓度为1×10⁷个/ml孢子悬液接种于1L液体培养基（0.5%鱼粉，0.5%酵母浸出粉，2%葡萄糖，0.5%NaCl，0.5%K₂HPO₄，pH=6.0-6.5）中，200rpm，30℃培养3天，离心收集细胞。

2）转化溶液的配置。转化溶液为磷酸缓冲液，其pH值为6.5。配置如下：分别配制浓度为0.2mol/L的NaH₂PO₄和0.2mol/L的Na₂HPO₄母液，二者按68.5:31.5的比例混合即成浓度为0.2mol/L、pH值为6.3的磷酸盐缓冲液。取一定量的去氢表雄酮溶于丙酮。加入到200ml灭菌处理的转化溶液中，底物浓度为10g/L。

3）将尖孢镰刀菌静息细胞接种于上述含有去氢表雄酮转化溶液中（培养基体积为500ml），细胞浓度为30g/L，在30℃条件下，转速为250rpm，转化6天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开，自然干燥后,用稀硫酸显色，观察底物的转化情况，转化产物为化合物II。当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物的条带时，即可结束第一阶段的转化。将转化液的pH值调整至7.0，再经121℃灭菌处理后，待用。

4）戈登氏菌Gordonia neofelifaecis的增殖。接种一环戈登氏菌于液体LB培养基（糖蜜10g/L，胰蛋白胨5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0）中培养24小时，以10%的接种量转接至5只分别装有500ml新鲜液体培养基（酵母粉0.1%，胆固醇0.1%，吐温-80 0.1%，NH₄NO₃ 0.1%,KH₂PO₄ 0.02%5,MgSO₄·7H₂O 0.025%,FeSO₄ 0.0001%,pH 7.0）的三角瓶中30℃,200rpm振荡培养36小时，离心收集细胞，即为静息细胞。

5）戈登氏菌静息细胞转化化合物II制备睾内酯。将戈登氏菌静息细胞直接接种于第一阶段转化液中，细胞浓度为30g/L，0.05g/L 8-羟基喹啉作为羟基化酶抑制剂，在36℃条件下，转速为250rpm，转化3天，取0.5ml转化液，加入等体积的醋酸乙酯混匀后，取上层萃取液，在GF₂₅₄硅胶薄板上点样分析，室温下展开,自然干燥后,直接于254nm的紫外灯下观察睾内酯的产生情况，再用稀硫酸显色，观察化合物II残留的情况；当在稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到化合物II的条带时，结束第二阶段的转化。

Claims

1.一种利用微生物转化制备睾内酯的方法,其特征在于包括以下步骤：

(1)转化底物溶液配制：将起始底物去氢表雄酮溶于增溶剂，经超声波处理，加入到转化溶液，制得转化底物溶液，所述增溶剂选自体积浓度为0.05～0.15％的吐温-80、乙醇、甲醇和丙酮，所述转化溶液选自pH为5.8～6.6的磷酸缓冲液和无菌水；

(2)一次转化：步骤(1)制取的转化底物溶液置入转化反应设备，加入尖孢镰刀菌静息细胞，通过Baeyer-Villiger氧化反应，起始底物去氢表雄酮转化为中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮，转化于26～32℃、200～250rpm和有氧条件下进行，转化反应至稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到底物条带时结束，所述尖孢镰刀菌菌株选用尖孢镰刀菌ATCC10960或ATCC16416；

(3)二次转化：一次转化反应结束后加入戈登氏菌静息细胞和羟基化酶抑制剂进行转化反应，中间产物3β-羟基-17α-氧代-D-扩环-雄甾-5-烯-17-酮在戈登氏菌静息细胞作用下转化反应为睾内酯，转化于28～37℃、200～250rpm和有氧条件下进行，转化反应至稀硫酸显色的硅胶薄板上看不到中间产物条带时结束，所述戈登氏菌菌株选用戈登氏菌Gordonia neofelifaecisNRRLB-59395。

2.根据权利要求1所述的利用微生物转化制备睾内酯的方法,其特征在于所述转化溶液加入有体积浓度为0.05～0.15％的吐温-80。

3.根据权利要求1或2所述的利用微生物转化制备睾内酯的方法,其特征在于作为转化溶液的磷酸缓冲液由0.15～0.25mol/L的NaH₂PO₄溶液和0.15～0.25mol/L的Na₂HPO₄溶液按体积比(73.5～92.0):(26.5～8.0)的比例配制。

4.根据权利要求1或2所述的利用微生物转化制备睾内酯的方法,其特征在于步骤(3)二次转化与步骤(2)一次转化在同一反应容器内进行，且在一次转化反应结束后直接加入戈登氏菌静息细胞进行二次转化反应。

5.根据权利要求3所述的利用微生物转化制备睾内酯的方法,其特征在于步骤(3)二次转化与步骤(2)一次转化在同一反应容器内进行，且在一次转化反应结束后直接加入戈登氏菌静息细胞进行二次转化反应。