CN101565687B - 一种液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵应用技术领域，具体涉及一种液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法。具体为将活化后的小克银汉霉的种子按质量百分比为10～30％接入到液体发酵培养基中，在25～30℃下振动发酵2～3天，在将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体分离，小克银汉霉菌丝体洗涤2～4次，而后将其粉碎，粉碎后的菌丝体与固体发酵培养基按重量比为1∶6～10混合，在30～35℃、湿度60～80％条件下进行固相发酵3～5天以产生孢子。采用本发明方法可以大量生产小克银汉霉孢子，产量达到2～6×109个/100克培养料，且孢子易与菌丝体和培养料分离，生产出的孢子可以直接用于发酵生产和研究。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵应用技术领域，具体涉及一种液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法。
背景技术
小克银汉霉(Cunninghamellaceae)是一类丝状真菌，小克银汉霉因具有与哺乳动物相似的细胞色素P450酶系，因此小克银汉霉在药物发酵转化和药物代谢研究和应用中具有十分广泛的用途。此外，小克银汉霉还被用来作为生产γ-亚麻酸的菌种，在工业发酵生产中用途也很广泛。应用小克银汉霉孢子作为发酵的初始种子可以提高发酵的产率和效率，便于控制菌体生长的周期，但一般获得小克银汉霉孢子都是以固体发酵生产方式进行的，这种方法需要较大的生产面积，生产周期也较长，孢子产量也很低。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用性好，工艺简单，可以规模化生产的液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法：将活化后的小克银汉霉的种子按质量百分比为10～30％接入到液体发酵培养基中在25～30℃下振动发酵2～3天，再将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体分离，小克银汉霉菌丝体洗涤2～4次，而后将其粉碎，粉碎后的菌丝体与固体发酵培养基按重量比为1∶6～10混合，在30～35℃、湿度60～80％条件下进行固相发酵3～5天以产生孢子；所述液体发酵培养基的组成为马铃薯150～200克，葡萄糖或蔗糖15～20克，磷酸二氢钾1～2克，硫酸镁0.5～1克，酵母膏0～0.5g，蛋白胨0～0.5g，氯化钠0～0.5g，水1000mL，pH6.0～7.5；固体发酵培养基的组成为红薯粉10％～30％，玉米粉5％～20％，麸皮5％～10％，磷酸二氢钾0.01％～0.2％，硫酸镁0.01％～0.2％，水40％～60％；
将小克银汉霉活化采用PDA斜面培养基或玉米粉琼脂斜面培养基进行活化，活化时间为5～7天；所述液体发酵振动发酵的速度为150～200r/min。所述在将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体采用离心或过滤收集菌丝体，其离心速度为2000～3000转/分，时间为10～20分钟。所述小克银汉霉菌丝体用无菌水或无菌生理盐水洗涤；所述小克银汉霉菌丝体粉碎采用电磨机将菌丝体粉碎成长度在500um～800um。所述粉碎好的菌丝体与固体发酵培养基混合后，摊开高度为1～3cm；所述固相发酵时培养基上覆盖无菌滤纸或无菌玻璃纸。所述无菌滤纸的厚度为0.20-2.30mm，含水量为10％～70％，无菌玻璃纸的厚度为0.03-0.60mm，含水量为10％～70％。所述液体发酵培养基起始pH为5.5～7.5。
本发明的优点在于：
1.本发明将液固双相用来发酵生产小克银汉霉孢子，液相发酵菌丝体生长速度快，固相发酵时培养基质疏松度良好，易于传热传质，有利于固相发酵中过程控制和孢子的产生。
2.本发明可以规模化生产小克银汉霉孢子，生产出的孢子易与菌丝体和培养料分离，生产出的孢子可以直接用于工业化规模发酵生产和研究。
3.本发明适用性好，生产工艺简单，设备条件要求不高，易于掌握。
4.本发明发酵方法可以大量生产小克银汉霉孢子，产量达到2～6×109个/100克培养料。
具体实施方式
实施例1
刺孢小克银汉霉菌种的活化：将刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)接入PDA斜面培养基，置于28℃恒温培养5～6天，用10ml无菌生理盐水反复冲洗活化好的菌株斜面，使小克银汉霉孢子充分地散落在生理盐水中；PDA斜面培养基组成为土豆200克，切成小块加水1000ml煮沸20分钟，纱布过滤，加入葡萄糖20克，琼脂20克，定容至1000ml。
液固双相发酵生产刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)孢子：取5ml活化好的孢子悬液接入到液体培养基中，摇瓶装液量50ml/250ml，在28℃下转速170r/min振动发酵3天，再将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体用纱布过滤液体培养基，使其分离得到的菌丝体，小克银汉霉菌丝体用无菌生理盐水洗涤2～3次，而后通过电磨机将洗涤好的菌丝体粉碎成长度在600um～700um的片段，粉碎后的菌丝体与固体发酵培养基按重量比为1∶10混合，在发酵容器中摊开，高度为3cm。然后在培养基上面覆盖一层厚度为0.05mm，含水量为40％无菌滤纸进行固相发酵。在温度为30℃，湿度为60％的条件下培养4天即得到大量刺孢小克银汉霉孢子。
所述，液体发酵培养基的组成为马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.8克，蛋白胨0.5g，水1000mL，pH6.5，液体发酵培养基起始pH为5.5～7.5，培养基于121℃，1.05MPa灭菌30min后使用；固体发酵培养基的组成为红薯粉30％，玉米粉20％，麸皮10％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.05％，其余为水。固体发酵培养基混合后于121℃，1.05MPa灭菌30min后使用。
实施例2
布氏小克银汉霉菌种的活化：将布氏小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)接入玉米粉琼脂斜面培养基，置于28℃恒温培养6～7天。用10ml无菌生理盐水反复冲洗活化好的菌株斜面，使小克银汉霉孢子充分地散落在生理盐水中；玉米粉琼脂斜面培养基组成为：玉米粉60克，加水1000ml文火煮沸1小时，纱布过滤，加入琼脂20克，定容至1000ml。
液固双相发酵生产布氏小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana)孢子：取布氏小克银汉霉的孢子悬液按质量百分比为10％接入到液体发酵培养基中，摇瓶装液量70ml/250ml，转速150～180r/min，30℃恒温培养2天。在将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体在3000转/分条件下用离心机离心10分钟，沉淀即为菌丝体，小克银汉霉菌丝体用无菌生理盐水洗涤3～4次，而后通过电磨机将洗涤好的菌丝体粉碎成长度在500um～800um的片段，粉碎后的菌丝体与固体发酵培养基按重量比为1∶7混合在发酵容器中摊开，高度为2cm。然后在培养基上面覆盖一层厚度为0.25mm，含水量为50％无菌玻璃纸进行固相发酵。在温度为32℃，湿度为65％的条件下培养4天即得到大量刺孢小克银汉霉孢子。
所述液体发酵培养基的组成为马铃薯150克，蔗糖15克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，酵母膏0.2g，水1000mL，液体发酵培养基起始pH为5.5～7.5，培养基于121℃，1.05MPa灭菌20min后使用。固体发酵培养基的组成为红薯粉10％，玉米粉5％，麸皮5％，磷酸二氢钾0.01％，硫酸镁0.01％，其余为水。固体发酵培养基混合后于121℃，1.05MPa灭菌30min后使用。
实施例3
雅致小克银汉霉菌种的活化：将雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)接入PDA斜面培养基，置于28℃恒温培养5～7天。用10ml无菌生理盐水反复冲洗活化好的菌株斜面，使小克银汉霉孢子充分地散落在生理盐水中。
液固双相发酵生产雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)孢子：取雅致小克银汉霉的孢子悬液按质量百分比为15％接入到液体发酵培养基中，摇瓶装液量30ml/250ml，转速180～200r/min，25℃恒温培养3天。再将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体在2000转/分条件下用离心机离心15分钟，沉淀即为菌丝体，小克银汉霉菌丝体用无菌生理盐水洗涤1～3次，而后通过电磨机将洗涤好的菌丝体粉碎成长度在500um～600um的片段，粉碎后的菌丝体与固体发酵培养基按重量比为1∶8混合在发酵容器中摊开，高度为1cm。然后在培养基上面覆盖一层厚度为0.3mm，含水量为30％无菌滤纸进行固相发酵。在温度为33℃，湿度为55％的条件下培养5天即得到大量刺孢小克银汉霉孢子。
所述液体发酵培养基的组成为马铃薯180克，葡萄糖18克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁1克，酵母膏0.5g，蛋白胨0.2g，水1000mL，液体发酵培养基起始pH为5.5～7.5，培养基于121℃，1.05MPa灭菌20min后使用。固体发酵培养基的组成为红薯粉20％，玉米粉15％，麸皮10％，磷酸二氢钾0.03％，硫酸镁0.02％，其余为水。固体发酵培养基混合后于121℃，1.05MPa灭菌30min后使用。
实施例4
与实施例1不同之处在于：所述液体发酵培养基的组成为马铃薯170克，葡萄糖或蔗糖19克，磷酸二氢钾1.6克，硫酸镁0.7克，酵母膏0.35g，蛋白胨0.4g，氯化钠0.5g，水1000mL；固体发酵培养基的组成为红薯粉15％，玉米粉10％，麸皮8％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.05％，余量为水。
实施例5
与实施例1不同之处在于：所述液体发酵培养基的组成为马铃薯190克，葡萄糖或蔗糖16克，磷酸二氢钾1.8克，硫酸镁0.6克，蛋白胨0.3g，氯化钠0.2g，水1000mL；固体发酵培养基的组成为红薯粉25％，玉米粉15％，麸皮6％，磷酸二氢钾0.08％，硫酸镁0.15％，余量为水。
Claims (7)
1.一种液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法，其特征在于：将活化后的小克银汉霉的种子按质量百分比为10～30％接入到液体发酵培养基中在25～30℃下振动发酵2～3天，再将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体分离，小克银汉霉菌丝体洗涤2～4次，而后将其粉碎，粉碎后的菌丝体与固体发酵培养基按重量比为1∶6～10混合，在30～35℃、湿度60～80％条件下进行固相发酵3～5天以产生孢子；
所述液体发酵培养基的组成为马铃薯150～200克，葡萄糖或蔗糖15～20克，磷酸二氢钾1～2克，硫酸镁0.5～1克，酵母膏0～0.5g，蛋白胨0～0.5g，氯化钠0～0.5g，水1000mL，pH6.0～7.5；固体发酵培养基的组成为红薯粉10％～30％，玉米粉5％～20％，麸皮5％～10％，磷酸二氢钾0.01％～0.2％，硫酸镁0.01％～0.2％，水40％～60％。
2.按权利要求1所述的液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法，其特征在于：将小克银汉霉活化采用PDA斜面培养基或玉米粉琼脂斜面培养基进行活化，活化时间为5～7天；所述液体发酵振动发酵的速度为150～200r/min。
3.按权利要求1所述的液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法，其特征在于：所述在将液体发酵培养基中培养好的小克银汉霉菌丝体采用离心或过滤收集菌丝体，其离心速度为2000～3000转/分，时间为10～20分钟。
4.按权利要求1所述的液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法，其特征在于：所述小克银汉霉菌丝体用无菌水或无菌生理盐水洗涤；所述小克银汉霉菌丝体粉碎采用电磨机将菌丝体粉碎成长度在500um～800um。
5.按权利要求1所述的液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法，其特征在于：所述粉碎好的菌丝体与固体发酵培养基混合后，摊开高度为1～3cm；所述固相发酵时培养基上覆盖无菌滤纸或无菌玻璃纸。
6.按权利要求5所述的液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法，其特征在于：所述无菌滤纸的厚度为0.20-2.30mm，含水量为10％～70％，无菌玻璃纸的厚度为0.03-0.60mm，含水量为10％～70％。
7.按权利要求1所述的液固双相发酵生产小克银汉霉孢子的方法，其特征在于：所述液体发酵培养基起始pH为5.5～7.5。
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