CN105176836B - 一种双出小克银汉霉wu-18菌株及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物及用途，属于生物降解技术领域。本发明提供的高效降解秸秆纤维的单一菌种腐熟剂，在现有技术中没有提及和公开。本发明为一种双出小克银汉霉WU‑18菌株(其在CGMCC的保藏编号为CGMCC No.9855)及发酵产物制备成固体秸秆腐熟剂的方法。该制剂能促进小麦秸秆还田后快速腐熟，增加土壤有机质含量。
Description
发明领域
本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株、用途及其制剂的制备方法，属于生物降解技术领域。
背景技术
农作物秸秆中含有C、N、P、K以及各种微量元素，还田后可增加土壤有机质，对维持土壤养分平衡，改善土壤团粒结构和理化性状，增加作物产量，节约化肥使用，保护农业生态环境，提高农业综合生产能力、促进农业生态系统良性循环，实现农业可持续发展起着突出重要的作用。秸秆及土壤本身富含大量的微生物，在自然条件下秸秆靠其自身及周围的土著微生物的作用下可以完全腐熟，但秸秆自然腐熟的速度很慢，在农业生产中靠自然腐熟会影响后茬作物种植时的土壤整地、播种质量，进而减少作物产量和品质等。
在秸秆还田中，纤维素分解是最关键的环节。因此，从自然界中筛选高效纤维素降解菌是秸秆还田快腐技术的核心。报道的野生纤维素降解菌大致有以下几种：细菌类的主要有纤维放线菌(Acidothermus cellulolyticus)、诺卡氏菌属(Ncardia spp.)和链霉菌属(Streptomyces spp.)；真菌类的主要有木霉属(Trichoderma spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、枝顶孢霉属(Acremonium spp.)、漆斑霉属(Myrothecium spp.)、脉孢霉属(Neurospora spp.)、毛壳霉属(Chaetomium spp.)的菌株。
我国的腐熟剂多为多种细菌或细菌与真菌的混合菌群。在应用中发现，这些腐熟剂的不同菌种间在秸秆腐熟初期与土著菌群竞争，大量的外来混合菌群的加入，使得在腐熟初期耗氧细菌快速繁殖，强烈抑制了其它有益真菌的生长，对加快秸秆腐熟没有明显的促进作用。因此，在秸秆腐熟初期须用占绝对优势的菌群把秸秆纤维素降解成可利用的糖类物质，进而供土著微生物菌群快速繁殖，从而达到快速降解秸秆的作用。
本发明提供的高效降解秸秆纤维的单一菌种腐熟剂，在现有技术中没有提及和公开。
发明内容
本发明解决现有技术存在的不足，提供一株新分离的真菌：双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株，该菌株加工而成的腐熟剂可用于秸秆的快速腐熟。同时本发明还提供用该双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株，加工成腐熟菌剂的制备工艺。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株，已于2014年10月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所)保藏，保藏号为：CGMCCNo.9855。本发明的菌种具有如下特征：
(1)本发明的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株的菌落形态及显微形态为：
麦芽汁琼脂培养基上菌落生长迅速，25℃黑暗条件下4d菌落直径65-75mm，白色，后期浅灰黑色，絮状，气生菌丝茂盛；菌落背面灰白色，无水溶性色素。孢囊梗高大，分枝多数二叉状，壁光滑或粗糙，未见分隔，宽5.0-9.0μm，长可达377μm。孢囊梗或其分枝顶端膨大呈囊状，小型孢子囊簇生，具小柄，椭圆形、水滴状或球形，7.8-19.3×8.6-13.4μm，壁粗糙，内生单个子囊孢子。未见接合孢子。
(2)本发明的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株的18S rRNA基因序列为：
用本发明的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株制备的腐熟菌剂，其制备方法包括以下步骤：
(A)液态接种体的获得
在PDA固体培养基上长好的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株的菌落边缘打取直径为4mm的菌片，接种于装有100mlPD培养液的容积为500ml的三角瓶中，每瓶接种10个菌片，每瓶中加入约20粒直径为2mm的无菌玻璃珠，置于30℃、200rpm振荡培养72h，无菌过滤去除玻璃珠，获得液态接种体；所述PDA固体培养基组成为1L水中加入10g马铃薯淀粉、10g葡萄糖、15g琼脂粉；所述的PD培养液组成为1L水中加入10g马铃薯淀粉、10g葡萄糖。
(B)固体发酵
按固体发酵培养基20g接种1ml液态接种体的比例混合，将混合好的固体培养基置于长50cm、宽40cm、高20cm无菌铁盘，铁盘内培养基堆料高为10cm，上覆盖双层无菌的无纺布，于25℃培养箱中培养48h后翻搅1次，共发酵7d；所述固体发酵培养基混合比例为5g麦麸、1g谷糠、10ml水。
(C)商用腐熟剂的获得
将上述(B)固体发酵产物在30℃烘箱中烘干至水分含量为5-8％，无菌袋分装即得商用腐熟剂，利用该技术所得的腐熟剂活菌体的菌落数为1.0-6.4×107CFU/g。
本发明的有益效果是：
本发明提供一株新的秸秆腐熟真菌——双出小克银汉霉(Cunninghamellabinariae)WU-18菌株，由该菌株制得的固体腐熟剂，可用于小麦秸秆全量还田。田间试验结果表明，该腐熟剂可加速小麦秸秆的腐熟。该菌剂规模化生产简易、成本低。
具体实施方式
实施例
本发明的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株，已于2014年10月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCCNo.9855。本发明菌株的细胞形态及分子生物学特征见“发明内容”。本实施例的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株的18S rRNA基因序列见“发明内容”。
用本发明的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株制备的生物腐熟剂，其制备方法包括以下步骤：
(A)液态接种体的获得
在PDA固体培养基上长好的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株的菌落边缘打取直径为4mm的菌片，接种于装有100ml PD培养液的容积为500ml的三角瓶中，每瓶接种10个菌片，每瓶中加入约20粒直径为2mm的无菌玻璃珠，置于30℃、200rpm振荡培养72h，无菌过滤去除玻璃珠，获得液态接种体；所述PDA固体培养基组成为1L水中加入10g马铃薯淀粉、10g葡萄糖、15g琼脂粉；所述的PD培养液组成为1L水中加入10g马铃薯淀粉、10g葡萄糖。
(B)固体发酵
按固体发酵培养基20g接种1ml液态接种体的比例混合，将混合好的固体培养基置于长50cm、宽40cm、高20cm无菌铁盘，铁盘内培养基堆料高为10cm，上覆盖双层无菌的无纺布，于25℃培养箱中培养48h后翻搅1次，共发酵7d。所述固体发酵培养基混合比例为5g麦麸、1g谷糠、10ml水。
(C)商用腐熟剂的获得
将上述(B)固体发酵产物在30℃烘箱中烘干至水分含量为5-8％，无菌袋分装即得商用腐熟剂，利用该技术所得的腐熟剂活菌体的菌落数约为1.0-6.4×107CFU/g。
实施效果
(1)双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株的产纤维素酶活性
取PDA平板活化的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株直径1cm菌块，接种于秸秆固态发酵培养基，置于25℃恒温培养箱中培养15d，取1g发酵秸秆，加入20ml pH4.8的柠檬酸缓冲溶液，浸提2h后，置于冷冻离心机(LGR16-W，北京医用离心机厂)，在转速为4000rpm、温度为4℃条件下离心10min，取2ml上清液测定菌株的滤纸酶活和木聚糖酶活。对照菌株用里氏木霉。秸秆固态发酵培养基组成为1L水中加入粉碎玉米秸秆75g，加入5mL无机盐溶液(1L盐溶液中含2gKH2PO4，0.3gMgSO4，0.3gCaCl2，4g(NH4)2SO4、0.4g尿素、0.1gFeSO4、1gMn2SO4、pH7.0-7.5)。
纤维素降解酶活性测定结果：滤纸酶活和木聚糖酶活可分别表示菌株对秸秆中两种主要成分纤维素和半纤维素的降解能力。双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株和里氏木霉在秸秆中发酵15d后的滤纸酶活和木聚糖酶活分别为4.12±0.57、418.56±34.42和2.24±0.46、135.2±24.82，双出小克银汉霉(Cunninghamellabinariae)WU-18菌株的滤纸酶活和木聚糖酶活都极显著高于对照商用里氏木霉菌株(表1)。
表1 双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株对秸秆固态发酵的酶活
注：同列不同大写字母表示差异显著水平P＝0.01。
(2)双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株腐熟剂对小麦秸秆全量还田的作用
小麦秸秆全量还田后，于2014年6月25日移栽水稻，水稻品种为镇稻14号，基肥尿素35公斤/公顷与双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株腐熟剂(15kg/亩)一同施用，设置不加腐熟剂空白对照(加15kg固体发酵培养基)，每个处理设置3次重复。小区四周留保护行，作埂后用薄膜覆盖埂周。肥、水管理、病虫害防治等田间管理统一按大面积生产要求进行，间隔80d后取样。采用酸性洗涤剂法、马弗炉灼烧法测定秸秆中粗纤维含量和有机质含量。
试验结果：秸秆腐熟剂施用后粗纤维含量从初始的67.7％降至45.9％，降幅显著高于自然腐熟(表2)；小麦秸秆中有机质含量从初始92.9％降低至78.8％，降幅极显著高于自然降解(表3)；腐熟剂处理后土壤养分中有机质、全氮、速效磷、速效钾的含量较不处理的对照相比均有显著增加(表4)。
表2 腐熟剂对小麦秸秆中粗纤维含量的变化
注：同列不同大写字母表示差异显著水平P＝0.01。
表3 腐熟剂对小麦秸秆中有机质含量的变化
注：同列不同大写字母表示差异显著水平P＝0.01。
表4 腐熟剂对小麦秸秆还田后土壤中养分的影响
注：同列不同小写字母表示差异显著水平P＝0.05。
Claims (5)
1.一种双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No.9855。
2.根据权利要求1所述的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株，其特征在于该菌株的18S rRNA基因序列为：
3.权利要求1所述的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株在小麦秸秆还田上的应用。
4.一种用权利要求1所述双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株发酵制备而成的固体腐熟剂。
5.一种制备权利要求4所述的固体腐熟剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
(A)液态接种体的获得
在PDA固体培养基上长好的双出小克银汉霉(Cunninghamella binariae)WU-18菌株的菌落边缘打取直径为4mm的菌片，接种于装有100ml PD培养液的容积为500ml的三角瓶中，每瓶接种10个菌片，每瓶中加入约20粒直径为2mm的无菌玻璃珠，置于30℃、200rpm振荡培养72h，无菌过滤去除玻璃珠，获得液态接种体；所述PDA固体培养基组成为1L水中加入10g马铃薯淀粉、10g葡萄糖、15g琼脂粉；所述的PD培养液组成为1L水中加入10g马铃薯淀粉、10g葡萄糖；
(B)固体发酵
按固体发酵培养基20g接种1mL液态接种体的比例混合，将混合好的固体培养基置于长50cm、宽40cm、高20cm无菌铁盘，铁盘内培养基堆料高为10cm，上覆盖双层无菌的无纺布，于25℃培养箱中培养48h后翻搅1次，共发酵7d；所述固体发酵培养基混合比例为5g麦麸、1g谷糠、10mL水；
(C)商用腐熟剂的获得
将上述(B)固体发酵产物在30℃烘箱中烘干至水分含量为5-8％，无菌袋分装即得商用腐熟剂，利用该技术所得的腐熟剂活菌体的菌落数为1.0-6.4×107CFU/g。
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