CN106222095B - 一种耐热真菌新种及其在微生物肥料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种耐热真菌新种及其在微生物肥料中的应用，通过从新疆吐鲁番地区羊粪自然堆肥样品中选育获得一株耐热真菌新种TF121，并通过制备微生物肥料，对测试的棉花、苹果、番茄、黄瓜和茄子来源的根结线虫卵均有寄生效果，卵被寄生率为22.1%‑32.2%,平均寄生率为26.6%，从棉花、大棚番茄作物应用本效果试验可以看出，本发明利用筛选的小克银汉霉新种TF121在提高作物产量效果显著，对于大棚黄瓜、大棚茄子等经济作物，果树如苹果、香梨等应用都具有明显的增产增效作用，同时可以有效降低根结线虫的发病率，可见，利用本发明提供的小克银汉霉新种TF121制备制剂的开发应用具有非常大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌种及应用农业技术领域，具体的涉及一种丝状真菌及其在制备微生物肥料中应用的技术领域。
背景技术
小克银汉霉属是一类丝状真菌，根据形态及生理特征共分为5种：刺孢(短刺)小克银汉霉，班氏小克银汉霉，布氏小克银汉霉，巴西果小克银汉霉和绮丽(雅致)小克银汉霉，是毛霉目中的一科，主要为腐生，除生活于土壤外，在粪便、腐烂植物等基物内也生长。
根结线虫(Meloidogynesp.)在我国发生极为普遍，严重危害农作物，且防治困难。随着人们生态意识的提高，剧毒化学杀虫剂的限用，从自然界中分离筛选高效能的食线虫菌物(Nema tophagous fung i)菌株已成为根结线虫生物防治的重点和热点。食线虫菌是指一类能寄生、捕捉、定殖和产生毒素杀死线虫的真菌。有关报道从桃树根部根结结线虫(M.incognita)的卵囊上分离到一株小克银汉霉(Cunninghamella)，经鉴定为绮丽小克银汉霉(C.elegans)，但只停留在实验室小试水平，并未有制成杀虫制剂的有关报道。
文平兰发明专利申请号：201510551796.4《一种双出小克银汉霉WU-18菌株及用途》公开了一种双出小克银汉霉，可以制成高效 降解秸秆纤维的单一菌种腐熟剂，但单一菌种腐熟剂只针对降解田间秸秆，也并未挖掘到小克银汉霉其他特殊的功效。
由于新疆广阔的地域环境，蕴藏着丰富的微生物。研究新疆极端微生物不仅有助于扩大极端微生物资源库，也有利于新疆特殊环境微生物的开发和利用。利用小克银汉属有较强的甾体转化能力，是医药工业用菌。目前研究的热点主要是作为体外药物代谢的微生物模型以及作为产生γ—亚麻酸发酵菌种开发。现有技术研究表明，有关小克银汉霉在生物防治和微生物肥料方面研究较为少见，而小克银汉霉是一类潜在的植物线虫生物防菌，因此，研究利用该微生物特性具有现实的意义。
发明内容
针对现有技术中未见有关小克银汉霉新种在生物防治和微生物肥料方面研究相关报道的技术现状，本发明旨在提供一种耐热真菌新种及其在微生物肥料中的应用。本发明通过在新疆吐鲁番羊圈周边羊粪自然堆肥样品中分离筛选出一株小克银汉霉新种(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624，利用分离出的菌种在微生物肥料中的应用，果树如苹果、香梨等应用本发明提供的微生物肥料都具有明显的增产增效作用，同时可以有效降低根结线虫的发病率，筛选获得菌种具有广泛的应用价值。
本发明采用的主要技术方案：
本发明通过从新疆吐鲁番地区羊圈周边羊粪自然堆肥过程样品中分离得到。样品采取梯度稀释法，称取10g辐照后的土壤样品于90ml无菌生理盐水中，30℃活化30min后进行梯度稀释，经PDA培养基筛选分离培养，大量筛选、优选、驯化选育，从中筛选出一株可应用于微生物肥料方面的小克银汉霉新种TF121。利用本发明分 离筛选出的编号为TF121的真菌菌株制备微生物肥料，对测试的棉花、苹果、番茄、黄瓜和茄子来源的根结线虫卵均有一定程度的寄生效果，卵被寄生率为22.1％-32.2％,平均寄生率为26.6％，从棉花、大棚番茄作物应用本效果试验可以看出，本发明利用筛选的小克银汉霉新种TF121在提高作物产量效果显著，通过选用其它如大棚黄瓜、大棚茄子等经济作物，果树如苹果、香梨等应用本发明提供的微生物肥料都具有明显的增产增效作用，同时可以有效降低根结线虫的发病率，可见，利用本发明提供的小克银汉霉新种TF121制备制剂的开发应用具有非常大的应用前景。
本发明具体提供一种新种小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624。通过从新疆吐鲁番羊圈周边羊粪自然堆肥过程样品中分离得到取样，筛选出一株耐热真菌小克银汉霉，该菌具有杀虫功效，并具有良好的热稳定性和pH稳定性，为该菌株通过常规发酵技术获得的制剂具有良好的杀虫功效，其制剂的开发应用具有非常大的应用前景。
本发明根据新疆地理环境的特殊性，从新疆吐鲁番地区羊圈周边羊粪自然堆肥过程样品进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批真菌，并从中分离筛选出小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)，编号为TF121，经微生物学分类与鉴定，属于小克银汉霉属，其具有杀虫功效和微生物肥效。参照《真菌鉴定手册》等对菌株进行形态学测定，生理生化测定确定TF121菌株为小克银汉霉属中成员；16SRNA同源分析、系统发育分析，通过BLAST同源比对，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的序列，并结合真菌生物多样性研究中心数据库，进行聚类分析和系统进化树构建。菌株归属于小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)，菌株TF121与C.intermedia菌株单独聚为一个发育簇，但单独分枝；同源性比较表明，菌株与C.intermedia IMI 200623T和CBS347.69进化距离最近，最大同源性分别为93.4％和93.3％，与其余种相似性都在80％以下，极有可能为新种，暂命名为小克银汉霉Cuninghamella sp.TF121。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101；保藏日期是2016年06月20日，菌种保藏号为CGMCC No. 12624。
该菌株小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624具有可在25℃-55℃生长良好，60℃生长明显受抑制，可在无或含有1.5％NaCl的PDA培养基上生长。菌株TF121在PDA培养基中28℃培养3d，菌落圆性棉絮状，菌丝白色，菌落背面白色，无皱褶；显微观察，初生菌丝无分隔，后期有横隔；孢子囊梗从菌丝伸出，直立，分枝或不分枝，顶端膨大，满生细刺，刺上生单细胞孢子，球形，表面带有细刺，孢子可脱落。
采用Biolog FF鉴定板进行生理生化特征分析表明：菌株TF121可以利用D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、糊精、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、a-D-葡萄糖、D-葡萄醛酸、丙三醇、a-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、a-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、6-O-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-蜜三糖、D-核糖、水杨苷、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、D-木糖、y-氨基丁酸、反丁烯二酸、a-酮戊二酸、L-苹果酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、琥珀 酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、L-丙胺酸、L-丙胺酰氨基乙酸、L-谷氨酸、鸟氨酸、L-苯基丙氨酸、脯氨酸、L-丝氨酸。
同时，本发明进一步提供一种小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624的发酵工艺，具体工艺步骤如下：
(1)液体发酵工艺：将活化制得种子液，按2％接种量接种于发酵培养基pH 5—8，25℃—30℃、180rpm培养4d—6d，收获菌体及发酵液。
(2)固体发酵工艺：将活化制得种子液，按2％接种量接种于固体发酵培养基，25℃—30℃，固体发酵4d—6d，至菌丝长满固体培养基，上层有大量孢子产生。
本发明进一步提供利用小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624制备微生物肥料的方法，具体方法如下：
(1)有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植酸按重量比7：3：2组成。
(2)腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile Apinis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比(1-3)：(1-3)：(1-3)：(1-3)进行混合；选用小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂。
(3)有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，将有机混合物发酵基料重量含水量为25％，压实后堆积覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于50℃-70℃时，进行翻堆，并按重量 比添加1-5％的腐熟复合菌剂，堆放发酵腐熟剂15—25d，期间翻动5—10次；经充分搅拌制备获得微生物肥料。
进一步，经过利用小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料的优选方法，具体制备方法步骤如下：
(1)将有机混合物发酵基料重量含水量为25％，压实后堆积用塑料膜覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于60℃时，进行翻堆，堆放发酵腐熟15-25d，期间翻动5-10次；其中，有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，有机物基料并按重量比添加1％的腐熟复合菌剂，有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植酸按重量比7：3：2组成，腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile Apinis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比1：1：1：1进行混合。
(2)选用耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂，按照重量百分比5％比例添加至步骤(1)制备的有机混合物发酵基料，经充分搅拌制备获得微生物肥料。
(3)液体发酵菌剂制备为将小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d得到斜面菌种；斜面经5mL无菌水剧烈振荡洗涤过滤，并适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液；吸取上述孢子悬浮液1mL,接 种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液；吸取上述种子液，按2％接种量接种于液体发酵培养基，28℃、180rpm培养6d，收获菌体及发酵液。
(4)固体发酵菌剂制备为将小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d得到斜面菌种；斜面经5mL无菌水剧烈振荡洗涤过滤，并适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液；吸取上述孢子悬浮液1mL,接种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液；吸取上述种子液，按2％接种量接种于固体发酵培养基，28℃、培养6d，收获固体培养菌剂。
本发明中，采用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile Apinis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)都为本领域普通菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道购买或者受赠获得。
本发明中，采用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)和嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile Apinis)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)三种菌剂制备按照现有技术提供的常规方法制备获得。
通过实施本发明具体技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：
(1)本发明提供的耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624是一种典型的新菌种，在55℃保持较高的酶活性，热稳定性好，具有培养条件简单，繁殖快的特点。
(2)将本发明分离筛选的耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624制备的有机混合物微生物肥料，对测试的棉花、苹果、番茄、黄瓜和茄子来源的根结线虫卵均有一定程度的寄生效果，卵被寄生率为22.1％-32.2％,平均寄生率为26.6％。从棉花、大棚番茄作物应用本效果试验可以看出，本发明产品在提高作物产量效果显著。通过选用其它如大棚黄瓜、大棚茄子等经济作物，果树如苹果、香梨等应用本发明提供的微生物肥料都具有明显的增产增效作用，同时可以有效降低根结线虫的发病率。同时，本发明产品可单独施用，有良好培肥地力，稳定产量的作用；也可与化肥进行配施，在土壤保育的同时尽快获得高产。对块茎类作物也可进行沾根，施用方法多样，田间应用简便，能够兼顾环境友好和产量提升。
附图说明
图1所示为菌株小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624的菌落图片。
图2所示为小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624菌丝及孢子显微照片。
图3所示为基于菌株小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624系统发育树状图。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都 为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
实施例一：小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121的分离、筛选及鉴定
1、分离：从新疆吐鲁番地区羊圈周边羊粪自然堆肥过程样品中分离得到。样品采取梯度稀释法，称取10g辐照后的土壤样品于90ml无菌生理盐水中，28℃-32℃活化30min—2h后进行梯度稀释，涂布于PDA培养基平板上培养。
2、纯化：待长出真菌菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，40℃—60℃纯化培养，优选采用55℃培养，直至无杂菌落，从中优选出菌株。
3、分类、鉴定：通过观察菌落形状和生理生化特点，提取菌株TF121的总DNA，采用真菌ITS PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，测序。进行ITS BLAST比较，进行聚类分析和系统进化树构建。
本发明所使用的耐热真菌小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121从新疆吐鲁番地区羊圈周边羊粪自然堆肥过程样品中分离得到。样品采取梯度稀释法，称取10g辐照后的土壤样品于90ml无菌生理盐水中，30℃活化30min后进行梯度稀释，选取原液、10-1、10-2、10-3稀释液分别涂布于PDA培养基(土豆200g、葡萄糖20g，琼脂15g、水1000mL)平板上，每个处理3个重复，置55℃恒温培养。待长出真菌菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于相应的平板，直至无杂菌落，从中优选出一株编号为TF121的菌株。
菌株小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121可在25℃-55℃生长良好，60℃生长明显受抑制，可在无或含有1.5％NaCl的PDA培养基上生长。菌株TF121在PDA培养基中28℃培养3d，菌落圆性棉絮状，菌丝白色，菌落背面白色，无皱褶；显微观察，初生菌丝无分隔，后期有横隔；孢子囊梗从菌丝伸出，直立，分枝或不分枝，顶端膨大，满生细刺，刺上生单细胞孢子，球形，表面带有细刺，孢子可脱落，菌落圆性棉絮状，菌丝白色，菌落背面白色，无皱褶；显微观察，初步断定为小克银汉霉(Cunninghamella sp.)，参见附图1和2。
通过提取菌株小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121的总DNA，采用采用真菌ITS PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化，送由上海生工测序。将实验菌株的所得TF121区序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的序列，并结合真菌生物多样性研究中心数据库(http://www.cbs.knaw.nl/databases/)的标准模式菌序列，利用MEGA 5.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joining method)进行聚类分析和系统进化树构建。参见附图3，由系统进化树可示，菌株归属于小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)，菌株TF121与C.intermedia菌株单独聚为一个发育簇，但单独分枝；同源性比较表明，菌株与C.intermedia IMI 200623T和CBS347.69进化距离最近，最大同源性分别为93.4％和93.3％，与其余种相似性都在80％以下，极有可能为新种，暂命名为小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121。
采用Biolog FF鉴定板进行生理生化特征分析表明：菌株TF121可以利用D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-纤维二糖、糊精、D-果糖、D-半乳糖、龙胆二糖、a-D-葡萄糖、D-葡萄醛酸、丙三醇、a-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽三糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、a-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、6-O-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-蜜三糖、D-核糖、水杨苷、D-山梨醇、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、D-木糖、y-氨基丁酸、反丁烯二酸、a-酮戊二酸、L-苹果酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、L-丙胺酸、L-丙胺酰氨基乙酸、L-谷氨酸、鸟氨酸、L-苯基丙氨酸、脯氨酸、L-丝氨酸。
该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2016年06月20日，菌种保藏号为CGMCCNo.12624。经微生物学鉴定暂命名为小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121。
通过上述对于菌种小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624的菌体形态、培养特征观察、生理生化指标测定及分子水平鉴定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定、耐性试验等试验，与常见的菌种相比，参照《真菌鉴定手册》的方法进行，编号为TF121的菌种尽管与常见的小克银汉霉属真菌菌种相比，具有共性的一些属性，但是依据与常见的小克银汉霉属真菌菌种有明显的生理生化特性差异和分子水平的差异性，表明TF121菌株是一种典型的新菌种，从菌种分类角度将菌种编号为TF121的菌株综合鉴定为小克银汉霉(Cunninghamella sp.)。
实施例二：小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624功能酶的分析
采用透明圈法，将小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624点植于纤维素酶筛选培养基((NH4)2SO4 2.0g，MgSO40.5g，KH2PO41.0g，CMC-Na 2.0g，刚果红0.4g，琼脂15.0g，蒸馏水1L，pH自然)、淀粉酶筛选培养基(可溶性淀粉20.0g，KCl 0.5g，NaNO32.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂15.0g，蒸馏水1L，pH 6.5)、脂肪酶筛选培养基(KH2PO4 0.2g，MgSO40.05g，PVA乳化液2.0mL，酵母粉0.2g，蛋白胨1.0g，琼脂1.7g，蒸馏水1L，pH 6.5。灭菌冷却50℃加10mL0.2％罗丹明B溶液)、蛋白酶筛选培养基(蛋白胨10.0g，葡萄糖1.0g，CaCl20.1g，酪氨酸0.1g，酪素5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1L，pH 6.5、壳聚糖酶筛选培养基(壳聚糖10.0g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO40.02g，CaCO36.0g，琼脂20.0，pH 6.0)和半乳糖苷酶酶筛选培养基(PDA固体培养基倒完平板后，添加200uL的20mg/mLX-Gal溶液，并涂布均匀)。55℃恒温培养7d，待菌落长成后，在产淀粉酶的筛选培养基上加碘液，其余5种酶分别在其筛选培养基测量透明圈直径与菌落直径比，初步判断菌株各种酶活性大小。
由表1可以看出，耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624在所测定的各种酶中均具有活性，其中蛋白酶和淀粉酶活性最大，其透明圈直径与菌落直径比可达2以上，其次为纤维素酶可达到1.41，而壳聚糖酶活性最低，仅为1.12。
表1：耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624产酶特征表
实施例三：耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624对根结线虫卵寄生性测定
将分离纯化的耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624在PDA培养基斜面上培养3d后,斜面试管中加5mL无菌水剧烈振荡后,使用双层灭菌纱布过滤。滤液经适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液备用。
选择透光度好的玻璃培养皿,加入灭菌的0.1％的氯霉素水琼脂(蒸馏水1L,琼脂10g,灭菌后加入氯霉素至终浓度为0.1％)，制成厚度约1.5mm平板薄层。在无菌条件下滴加10μL耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624孢子悬浮液于水琼脂平板上，待菌丝萌发可见小菌落后,在菌落边缘滴加10μL各种来源的根结线虫卵悬浮液,培养皿用封口膜封口后于黑暗(25℃)中倒置培养15d。用倒置显微镜直接观察培养皿内不同胚胎发育时期卵被寄生状况,如卵粒上附着菌丝或菌丝长出,视为寄生；无菌丝附着或卵已孵化出幼虫视为未被寄生.另单独接卵粒于水琼脂平板作对照。
实验表明，耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624对测试的各种来源的根结线虫卵均有一定程度的寄生效果，卵被寄生率为22.1％-32.2％,平均寄生率为26.6％。被寄生卵多为胚胎早期发育的卵,边缘不完整,卵内容物模糊变空,有 的卵粒上可复长出孢囊梗与孢子囊，已发育有幼虫的卵未见被寄生,但幼虫大多未孵化逸出。对照平板中的卵内容物完整,卵壳边缘完整，均孵化为幼虫逸出。
表2：耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624寄生性测定
| 根结线虫来源 | 棉花 | 番茄 | 苹果 | 黄瓜 | 茄子 |
| 寄生率(％) | 30.1±0.4 | 22.1±0.3 | 25.7±0.2 | 23.1±0.5 | 32.2±0.5 |
实施例四：耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624液体发酵工艺
将耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d(到气生菌丝丰满有黑色孢子产生)，即得到斜面菌种。斜面试管中加5mL无菌水剧烈振荡后,使用双层灭菌纱布过滤，滤液经适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液。吸取上述孢子悬浮液1mL,接种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液。
吸取上述种子液,按2％接种量接种于发酵培养基(蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，pH 6.6，500ml的三角瓶中装100ml发酵培养基)，28℃、180rpm培养6d，收获菌体及发酵液。
实施例五：耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624固体发酵工艺
将耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d(到气生菌丝丰满 有黑色孢子产生)，即得到斜面菌种。斜面试管中加5mL无菌水剧烈振荡后,使用双层灭菌纱布过滤，滤液经适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液。吸取上述孢子悬浮液1mL,接种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液。
吸取上述种子液,按2％接种量接种于固体发酵培养基(粉碎棉杆65％，麸皮20％，棉籽壳13％，蔗糖1％，CaCO31％，然后添加自来水充分搅匀，控制最终含水量为60％)，28℃固体发酵6d,至菌丝长满固体培养基，上层有大量孢子产生。经固体发酵后固体培养基中菌种孢子数可达到1亿/g以上，各种酶活表现较高。
表3：耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624固体发酵物特性
实施例六：利用耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料的方法
利用耐热耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料方法，具体制备方法步骤如下：
(1)将有机混合物发酵基料重量含水量为25％，压实后堆积用塑料膜覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于60℃时，进行翻堆，堆放发酵腐熟15-25d，期间翻动5-10次；其中，有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，有机物基料并按重量比添加1％的腐熟复合菌剂，有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植 酸按重量比7：3：2组成，腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile Apinis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比1：1：1：1进行混合。
(2)选用耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂，按照重量百分比5％比例添加至步骤(1)制备的有机混合物发酵基料，经充分搅拌制备获得微生物肥料。
(3)液体发酵菌剂制备为将小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d得到斜面菌种；斜面经5mL无菌水剧烈振荡洗涤过滤，并适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液；吸取上述孢子悬浮液1mL,接种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液；吸取上述种子液，按2％接种量接种于液体发酵培养基，28℃、180rpm培养6d，收获菌体及发酵液。
(4)固体发酵菌剂制备为将小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d得到斜面菌种；斜面经5mL无菌水剧烈振荡洗涤过滤，并适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液；吸取上述孢子悬浮液1mL,接种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液； 吸取上述种子液，按2％接种量接种于固体发酵培养基，28℃、培养6d，收获固体培养菌剂。
实施例七：利用耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料的方法
有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植酸按重量比7：3：2组成，腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile Apinis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比1：1：1：1进行混合；选用小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂；有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，将有机混合物发酵基料重量含水量为25％，压实后堆积覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于50℃时，进行翻堆，并按重量比添加1％的腐熟复合菌剂，堆放发酵腐熟剂15—25d，期间翻动5—10次；经充分搅拌制备获得微生物肥料。
实施例八：利用耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料的方法
有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植酸按重量比7：3：2组成，腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile Apinis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比3：3：3：3进行混合；选用小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂；有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，将有机混合物发酵基料重量含水量为25％，压实后堆积覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于70℃时，进行翻堆，并按重量比添加5％的腐熟复合菌剂，堆放发酵腐熟剂15—25d，期间翻动5—10次；经充分搅拌制备获得微生物肥料。
实施例九：利用耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料的方法
有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植酸按重量比7：3：2组成，腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile Apinis)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比2：2：2：2进行混合；选用小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂；有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，将有机混合物发酵基料重量含水量为25％，压实后堆积覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于60℃时，进行翻堆，并按重量比添加1-5％的腐熟复合菌剂，堆放发酵腐熟剂15—25d，期间翻动5—10次；经充分搅拌制备获得微生物肥料。
实施例十：利用耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料的方法
有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植酸按重量比7：3：2组成，腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile Apinis)、哈茨木 霉(Trichoderma harzianum)和耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比1.5：1.5：1.5：2.5进行混合；选用小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂；有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，将有机混合物发酵基料重量含水量为25％，压实后堆积覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于65℃时，进行翻堆，并按重量比添加4.5％的腐熟复合菌剂，堆放发酵腐熟剂15—25d，期间翻动5—10次；经充分搅拌制备获得微生物肥料。
实施例十一：耐热小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料应用的肥效和线虫防治试验
在不同作物上，以常规施肥为对照，比较该发明提供的耐热小克银汉霉Cuninghamella sp.TF121制备微生物肥料在提高作物产量、提高和保持土壤肥力，经及在线虫防治方面的效果。
1)棉花种植中的应用
试验地点选择为新疆石河子142农场、新疆阿克苏农一师一团。棉花品种为新陆早26(新疆石河子)、新陆早33号(新疆阿克苏)。试验土壤：两个试验点土壤类型均为灰漠土，其中石河子点土壤基本理化性状：有机质12.5g/kg，碱解氮49.0mg/kg，有效磷10.5mg/kg，速效钾220mg/kg，肥力中等。阿克苏点土壤基本理化性状为：有机质18.0g/kg，碱解氮79.0mg/kg，Olsen磷7.0mg/kg，速效钾289mg/kg，pH8.3，肥力中等，土壤含磷量偏低
试验设计对照常规施化肥：石河子按尿素25kg/亩+磷酸二铵20kg/亩，硫酸钾5kg/亩施用，灌溉方式为滴灌。阿克苏点按尿素29kg/亩、磷酸二铵18kg/亩施用，灌溉方式为滴灌。施肥方法为全 部磷肥和钾肥基肥，氮肥结合滴灌随水分4次滴施。试验组为常规施化肥+微生物肥料50kg/亩。
试验设3次重复，每个小区面积为40m2，测试项目为棉花产量。
试验结果表明，施用本发明产品后，产量及其构成指标的影响均得到了明显的改善，棉花单株铃数和单铃重均有增加，籽棉产量提高18.9％-22.9％，获得了良好的增产效果。
表4：施用微生物肥后棉花产量差异
从表5对施用本发明产品后，产量及其构成指标的影响可以看出，施用本产品后，棉花单株铃数和单铃重均有增加，籽棉产量提高11.9％-13.9％，获得了良好的增产效果。
2)番茄种植中的应用
试验地点选择为新疆石河子141团场蔬菜大棚，番茄种植年限10年以上，番茄品种为早粉二号。番茄苗12月2日用原大棚土播种育苗，3月15日定植。定植时，大棚内土壤平整后按垄高30cm，垄宽60cm，沟宽40cm，起垄铺膜，行距50cm、株距35cm。
试验设计对照常规施肥：施农家肥5000kg/亩、二铵40kg/亩为基肥。验组为常规施肥+微生物肥料50kg/亩，其它田间管理按 常规操作。试验设3次重复，小区面积为40m2，测试项目为番茄产量及根结线虫发病株数。
试验结果表明，施用本发明产品后，番茄单果重明显增加，根结线虫发病株数明显下降，产量最高可增产20％以上。
表5：施用微生物肥后大棚番茄产量差异
从以上在经济作物棉花、大棚番茄应用本产品的效果试验可以看出，本发明产品在提高作物产量效果显著。通过选用其它如大棚黄瓜、大棚茄子等经济作物，果树如苹果、香梨等应用本发明提供的微生物肥料都具有明显的增产增效作用，同时可以有效降低根结线虫的发病率。同时，本发明产品可单独施用，有良好培肥地力，稳定产量的作用；也可与化肥进行配施，在土壤保育的同时尽快获得高产。对块茎类作物也可进行沾根，施用方法多样，田间应用简便，能够兼顾环境友好和产量提升。
通过上述系列实施例提供的小克银汉霉(Cunninghamella sp.)TF121 CGMCCNo.12624是一种典型的新菌种，在55℃保持较高的酶活性，热稳定性好，具有培养条件简单，繁殖快的特点，制备的有机混合物微生物肥料，对测试的棉花、苹果、番茄、黄瓜和茄子来源的根结线虫卵均有一定程度的寄生效果，卵被寄生率为22.1％-32.2％,平均寄生率为26.6％。从棉花、大棚番茄作物应用本效果 试验可以看出，本发明产品在提高作物产量效果显著。通过选用其它如大棚黄瓜、大棚茄子等经济作物，果树如苹果、香梨等应用本发明提供的微生物肥料都具有明显的增产增效作用，同时可以有效降低根结线虫的发病率。同时，本发明产品可单独施用，有良好培肥地力，稳定产量的作用；也可与化肥进行配施，在土壤保育的同时尽快获得高产。对块茎类作物也可进行沾根，施用方法多样，田间应用简便，能够兼顾环境友好和产量提升
上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆山川秀丽生物有限公司
<120> 一种耐热真菌新种及其在微生物肥料中的应用
<130> TF121
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 825
<212> DNA
<213> TF121
<220>
<221> TF121
<222> (1)..(825)
<400> 1
aggaagggga ctgcggaagg atcattaact atgttgtggg gaagagggga gccttgaaag 60
caatttcatg gtttcttttt ttcctactca ttttatccac cttttgtgca ctgtctttat 120
tcatcagtct tgtaccgcaa ggtgcacgcc tgagccttgg atcatgatca atggtccatt 180
ggggctctgg tgcggattga tacacctttt ttatactaaa ttatactgaa aatgattgac 240
cataaatcat ggttgtttat aataataata aaaaaaaaac aactttcagc aatggatctc 300
tcggctttcg tatcgatgaa raacgcagca aatcgcgata tttaatgtga tctgcctata 360
gtgaatcatc aaatctttga acgcatcttg caccttatgg tattccataa ggtacgtctg 420
tttcagtacc aactgttatc tcccttcctc cccattcgtt tgggttgaat gatggaagaa 480
ggatcagaga tttattgaat tggtcctggt ggtagtaggc tttgctgcct tgtcgtccta 540
cggggtgatg cagtattgca gccgaagaca aaatccactc tcgacctaat aataaagccg 600
gcttaaccga gtgaaagggg acctcgcctt tgccttccct ttagggggat agggaaagaa 660
aaagggacct gagtagtagg gaggttttgc tttgataatg aataacattc tgtaaagttt 720
tactttgcag gatccaatag gtcttaatcg cctgttggaa ctcattactt tggcctgaaa 780
tcagatggga ctacccgctg aacttaagca tatcataggc gggaa 825
Claims (4)
1.一种小克银汉霉（Cunninghamella sp.）TF121，其特征在于，所述的小克银汉霉（Cunninghamella sp.）TF121的菌种保藏号为CGMCC No.12624。
2.一种小克银汉霉（Cunninghamella sp.）TF121 CGMCC No.12624的发酵工艺，具体工艺步骤如（1）或（2）所示：
（1）液体发酵工艺：将活化制得种子液，按2%接种量接种于发酵培养基pH5-8，25℃-30℃、180rpm培养4d-6d，收获菌体及发酵液；
（2）固体发酵工艺：将活化制得种子液，按2%接种量接种于固体发酵培养基，25℃-30℃，固体发酵4d-6d，至菌丝长满固体培养基，上层有大量孢子产生。
3.一种利用小克银汉霉（Cunninghamella sp.）TF121 CGMCC No.12624制备微生物肥料的方法，具体方法如下：
（1）将有机混合物发酵基料重量含水量为25%，压实后堆积用塑料膜覆盖密封，经自然发酵，当堆积温度高于60℃时，进行翻堆，堆放发酵腐熟15-25d，期间翻动5-10次；其中，有机混合物发酵基料由有机物基料和腐熟复合菌剂组成，有机物基料并按重量比添加1%的腐熟复合菌剂，有机物基料以畜禽粪便、秸秆、腐植酸按重量比7：3：2组成，腐熟复合菌剂由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Ehreuberg Cohn）、嗜热侧孢霉（Sporotrichumthermophile Apinis）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和小克银汉霉（Cunninghamellasp.）TF121 CGMCC No.12624四种菌剂以重量比1:1:1:1进行混合；
（2）选用耐热小克银汉霉（Cunninghamella sp.）TF121 CGMCC No.12624经液体发酵或固体发酵菌剂，按照重量百分比5%比例添加至步骤（1）制备的经发酵腐熟的有机混合物发酵基料，经充分搅拌制备获得微生物肥料；
（3）液体发酵菌剂制备为将小克银汉霉（Cunninghamella sp.）TF121 CGMCC No.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d得到斜面菌种；斜面经5mL无菌水剧烈振荡洗涤过滤，并适当稀释制备成含有106 个孢子悬浮液；吸取上述孢子悬浮液1mL，接种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液；吸取上述种子液，按2%接种量接种于液体发酵培养基，28℃、180rpm培养6d，收获菌体及发酵液；
（4）固体发酵菌剂制备为将小克银汉霉（Cunninghamella sp.）TF121 CGMCC No.12624接种于PDA斜面培养基，28℃培养3d得到斜面菌种；斜面经5mL无菌水剧烈振荡洗涤过滤，并适当稀释制备成含有106个孢子悬浮液；吸取上述孢子悬浮液1mL，接种于PDA液体培养基中，28℃、180rpm培养96h，得到种子液；吸取上述种子液，按2%接种量接种于固体发酵培养基，28℃、培养6d，收获固体培养菌剂。
4.如权利要求3制备的微生物肥料。
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