CN103160441B

CN103160441B - 一种草酸青霉菌发酵液的制备工艺及其在农业中的应用

Info

Publication number: CN103160441B
Application number: CN201110416872.2A
Authority: CN
Inventors: 刘文菊; 耿丽平; 陆秀君; 赵全利; 张丽娟
Original assignee: Heibei Agricultural University
Current assignee: Heibei Agricultural University
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: CN103160441A

Abstract

本发明属于微生物和土壤肥料技术领域。秸秆还田是当今世界上普遍关注的一项培肥地力和增产增效的农艺措施，既能做到秸秆的无污染处理，也能培肥地力。但是秸秆如果在土壤中腐解时间长，将造成土壤空隙大，容易形成死苗、冻害等生产问题，而且还能够使病虫害在土壤中长期存活，对农业生产带来潜在危害。本发明提供一种优化的以玉米秸秆为主要原料，以草酸青霉菌（保藏号为CGMCCNo.4842）为种子菌的发酵液的制备工艺，同时提供这种发酵液在农业生产中的应用方法。使用此发酵液能够加速玉米秸秆的腐解，适合秸秆还田地区用于促进玉米秸秆腐解，培肥地力。

Description

一种草酸青霉菌发酵液的制备工艺及其在农业中的应用

技术领域

本发明属于微生物和土壤肥料技术领域，具体涉及一种加速玉米秸秆腐解青霉属菌株的获得及其发酵液的制备工艺，本发明还涉及该发酵液在农业生产中的应用方法。

技术背景

秸秆还田是当今世界上普遍关注的一项农艺措施，在减少了秸秆焚烧所造成的大气污染的同时还有增肥增产作用，但若方法不当，也会导致土壤病菌增加，作物病害加重及缺苗（僵苗）等不良现象。目前秸秆还田技术主要有三种：一是直接粉碎还田，二是堆肥后还田，三是过腹还田（喂饲牲畜后粪便还田）。而直接粉碎由于节省人力物力最容易推广，但目前的情况是，秸秆粉碎直接还田后腐解时间较长，腐解前期土壤过于松透，大孔隙过多，导致跑风，播种后土壤与种子不能紧密接触，影响种子发芽生长，特别是在玉米-小麦轮作区，玉米秸秆粉碎于田间并耕翻后，由于腐解时间较长等原因，常常造成小麦播种后不能发芽或者吊根死苗，到冬季又易造成小麦冻害，从而影响小麦高产稳产；再者，由于秸秆长时间不能腐解，致使一些害虫和病原菌在土壤中长时间存活，给作物生产又带来潜在危害。因此，目前急需一种促进秸秆快速腐解的方法。

发明内容

1.技术问题

本发明提供一种优化的以玉米秸秆为主要原料，以草酸青霉菌（保藏号为CGMCC No.4842）为种子菌的发酵液的制备工艺，同时提供一种其发酵液促进玉米秸秆腐解的方法。

2.技术方案

（1）具有能分解纤维素能力的菌株的分离

称取土壤样品10 g于装有100 mL富集培养基（羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5 g，NaNO₃ 1 g，KCl 0.5 g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.7 g，KH₂PO₄ 0.9 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，酵母膏0.5 g，水解酪素0.5 g，蒸馏水定容到1000 mL ，pH为7）的锥形瓶中，在28℃下振荡培养3～4 d。从富集培养基土壤液中吸取100 μl土壤悬液加入盛有900 μl无菌水的离心管中充分混匀，采用逐级稀释法将菌悬液稀释至合适浓度，用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基（CMC-Na 5 g ,酵母膏1. 0 g， KH₂PO₄0.25g, (NH₄) ₂ SO₄ 0.4 g， MgSO₄ ·7H₂O 0.01 g ，蛋白胨 0.1 g，琼脂粉15 g ，土豆汁100 mL，蒸馏水定容到1000 mL，pH为7）平板涂板培养，每土样重复3次，28℃培养至菌落长出，挑取出现明显透明圈的菌落，分别编号并记录培养性状，纯化培养和保存。

（2）分解纤维素的高效菌株筛选

在上述方法筛选菌株的基础上，采用Hart T D（Hart T D，2002，World Journal of Microbiology and Biotechnology，18:471-480）的水解圈测定法进一步筛选高效菌株。将获得的菌株分别转接于羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基平板上培养96 h，然后用刚果红(10 mg/mL)染色培养好的平板，染色30 min后，倒出染液，再用NaCl洗涤15 min后倒出溶液，每菌株重复4次，测量水解圈直径，选取水解圈最大的一个菌落，PDA培养基纯培养。

（3）青霉属菌的鉴定

菌株形态鉴定：将上述纯培养获得的菌落，在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基上进行菌落形态观察和显微镜镜检。该菌株在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)鉴别培养基培养后，菌落起初灰绿色，均匀分布在培养基表面，呈轮纹状，边缘无色半透明，菌落背面浅青绿色。在显微镜下可以看出菌丝无色，分生孢子梗散生，从菌丝垂直生出，分生孢子梗长柱状，分生孢子梗下部不分支；有横隔膜，分生孢子梗顶端生排列成帚状的间枝，间枝顶层为小梗，小梗具瓶梗3个，顶生呈串不分枝的链状分生孢子，分生孢子光滑近圆形，蓝绿色。根据《真菌鉴定手册》鉴定为半知菌亚门(Deuteromyeotina)、丝孢纲(Hypholnseetes)、丝孢目(Moniliales)、丛梗孢科(Moniliaceae)、青霉属（Penicillium）菌株。

菌株分子鉴定：经ITS序列分析鉴定，确认该菌株为草酸青霉菌（Penicillium oxalicum），定名为草酸青霉菌HB1菌株，以下简称HB1菌株。

该HB1菌株是从河北省山前平原区玉米-小麦轮作秸秆还田小麦季土壤样品中分离得到，该菌株已于2011年5月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.4842。

（4）HB1菌株对玉米秸秆腐解作用的确定

将活化好的HB1菌株接种到灭菌的CMC-Na液体培养基（CMC-Na 5 g，酵母膏1.0 g，KH₂PO₄0.25 g，(NH₄) ₂ SO₄ 0.4 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.01 g，蛋白胨0.1 g，蒸馏水定容到1000 mL，pH=7）中，30℃，180 r/min，振荡培养24h，制成菌悬液（以下叫做HB1菌悬液）。把HB1菌悬液接种到玉米秸秆培养基（玉米秸秆干粉 5 g ，酵母膏1. 0 g， KH₂PO₄0.25 g，(NH₄) ₂ SO₄ 0.4 g， MgSO₄ ·7H₂O 0.01 g ，蛋白胨0.1 g，蒸馏水定容到1000 mL，pH为7，其中玉米秸杆干粉为玉米秸秆晾干后粉碎，颗粒大小为80%通过16目筛。）上，在30℃，210 rpm震荡培养72 h，同时设置无菌水代替HB1菌悬液的对照，按照DNS法(Ghose T K，1987，Pure Appl. Chem.，59:257-268)分别测定与秸秆分解有关的内切型葡聚糖酶（CMC酶）、滤纸酶（FPA酶）、纤维素酶和半纤维素酶的酶活，发现在玉米秸秆培养基上测得CMC酶酶活和FPA酶酶活分别达282.9U和618.3U，纤维素总酶酶活可达到376.1U，而半纤维素酶酶活为14.1U，各种酶活显著高于对照。说明该菌株对玉米秸秆有腐解作用。

（5）利用HB1菌悬液发酵玉米秸秆制作发酵液其发酵工艺的优化

通过系统设置玉米秸秆的量和HB1菌悬液的不同比例，并设置不同的氮源种类和数量、设置多种发酵时间、发酵温度及初始pH等，筛选最优产酶条件。结果表明，从经济和效果兼顾的情况下，优化的原料配比和发酵条件为：玉米秸杆干粉：牛肉膏蛋白胨： HB1菌悬液量=8～25 g：1～2 g：1 mL，加水100 mL，培养温度30～35℃，摇床转速180～200 r/min，初始pH值为4～7，发酵72～120 h。这时得到的发酵液（简称HB1发酵液）其CMC酶活力较高，均能达到888.8U以上。其中玉米秸杆干粉为玉米秸秆晾干后粉碎，颗粒大小为80%通过16目筛。

（6） HB1发酵液在盆栽试验和田间生产中的应用

在盆栽试验中，通过设置不同的玉米秸秆干粉用量、土壤质量和HB1发酵液之间的不同比例，筛选经济有效的配比，以确定在花盆中的最优使用配比和使用方法。当设定为1 kg土壤，加入玉米秸秆干粉4～5 g，混匀后表面喷洒发酵液1～3 mL，然后浇水，使土壤含水量为20%～25%时。在培养30 d时，在添加HB1发酵液的处理组，玉米秸秆干粉的腐解率在33.2%～45.6%范围，在培养65 d时，腐解率达到70.5%～77.8%，均显著高于对照组和其他设定下的腐解率。

在田间，通过调查每亩玉米秸秆质量，设置不同发酵液用量和土壤含水量，筛选经济有效的使用方法。通过试验确定为：在玉米收获之后立即将玉米秸秆常规粉碎，通过浇水或其他方法保持土壤相对湿度在65%～80%之间，在粉碎的玉米秸秆表面喷洒HB1发酵液50～75 kg/667m²，立即耕翻或者旋耕。此方法下30 d时玉米秸秆的腐解率达到35%～60%，50 d时腐解率达到70%~77.5%，均显著高于对照组或其他设定下的腐解率。

3.有益效果

（1）本发明筛选了利用草酸青霉菌菌株HB1发酵玉米秸秆制作发酵液的方法，其制备工艺得到的纤维素酶的活性较高，能够降低发酵液的制备成本。（2）利用上述发酵液，筛选了在花盆中加速腐解玉米秸秆的方法，能够为花盆种植的作物提供有机肥料，为秸秆的有效利用提供了一条途径，也减少秸秆焚烧对环境的污染。

（3）筛选的利用上述HB1发酵液在玉米秸秆还田地块促进玉米秸秆腐解的方法，能够加速玉米秸秆的腐解，释放玉米秸秆中的养分，为作物提供营养促进作物生长。

（4）玉米秸秆的快速腐解能够改善土壤的理化性质，为作物生长提供合适的土壤环境，减轻死苗、冻害及病虫害给作物带来的危害。

具体实施方式

实施例1：HB1发酵液在盆栽中腐解玉米秸秆的方法：

HB1发酵液的制备可以采用以下方法：将HB1菌株接种到灭菌的CMC-Na液体培养基（CMC-Na 5 g，酵母膏1. 0 g，KH₂PO₄0.25 g，(NH₄) ₂ SO₄ 0.4 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.01 g，蛋白胨0.1 g，蒸馏水定容到1000 mL，pH=7）中，30℃，180 r/min，振荡培养24 h，制成HB1菌悬液。将玉米秸杆干粉：牛肉膏蛋白胨： HB1菌悬液按照10 g：1 g：1 mL配置，加水100 mL，混匀，培养温度30℃，初始pH设为5，180 r/min，发酵72 h，制备HB1发酵液。

在装有1.5 kg土的花盆中，均匀混入8.0 g玉米秸秆干粉，然后土表喷洒HB1发酵液1.5 mL，土壤表面浇水，使土壤含水量为25%。30 d时，玉米秸秆干粉的腐解率在39.0%～42.8%范围，在培养50 d时，腐解率达到71.2%～70.8%。

实施例2 ：HB1发酵液在玉米秸秆还田地块促进玉米秸秆腐解的方法可以采用：

玉米收获后，将玉米秸秆常规粉碎，使粉碎的秸秆均匀平铺在土表，浇水后使土壤相对湿度在70%～75%之间，每667m²喷洒实施例1中制得的HB1发酵液50 kg，立即耕翻或者旋耕，使粉碎后的玉米秸秆和耕层土壤混匀，30 d时测得玉米秸秆腐解率为40%，50 d时测得腐解率达到75.5%。

Claims

1.一种草酸青霉菌HB1发酵液的制备方法，其特征在于，所述发酵液制备时各成分及配比为：玉米秸杆干粉：牛肉膏蛋白胨：HB1菌悬液＝8～25g：1～2g：1mL，加水100mL，发酵温度为30～35℃，初始pH值为4～7，摇床转速为180～200r/min，发酵时间为72～120h；所述草酸青霉菌HB1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4842。

2.如权利要求1所述方法制备的草酸青霉菌HB1发酵液在农业盆栽生产中的使用方法，其特征在于，所述方法为1kg土壤，加入玉米秸秆干粉4～5g，混匀后表面喷洒发酵液1～3mL，然后浇水，使土壤含水量为20％～25％。

3.如权利要求1所述的发酵液的制备方法，其特征在于玉米秸秆干粉的颗粒大小为80％通过16目筛。

4.如权利要求1所述方法制备的草酸青霉菌HB1发酵液在玉米秸秆还田地块中的使用方法，其特征在于，所述方法为玉米收获之后立即将玉米秸秆常规粉碎，通过灌水或其他方法保持土壤相对湿度在65％～80％，在粉碎的玉米秸秆表面喷洒HB1发酵液50～75kg/667m²，立即翻耕或者旋耕。