CN105349478A - 一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵。本发明从烟叶表面分离获得降解甾醇的微生物，利用种子培养基进行扩大后获得对数期细胞，添加到烟草浸提液中可以有效降解其中的甾醇含量，甾醇总降解率达到35.5%。甾醇为烟草有害物质苯并芘的前体化合物，该发明为烟草生物减害提供参考，具有很高的原创性，有望应用于降低苯并芘的再造烟叶生产过程。

Description

一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法
技术领域
本发明属于烟草生物技术领域，具体涉及一种利用生物法降解烟草中甾醇类有害化合物的方法。
背景技术
甾醇属于大分子醇类，是一类广泛存在于自然界中的甾族化合物，主要存在于动植物的脂肪或油类中，或以高级脂肪酸的酯存在于动物体内或者苷的形式存在于植物的组织中。其基本骨架结构为环戊氢化菲体系，由三个六元环和一个五元环组成(如下图所示)，C-3、C-11位上可能有烃基或酮基，C-10、C-13位上各有一个甲基，C-17位上有8～10个碳原子组成的侧链。
甾醇是烟草植物中的一类激素类物质，对烟草生长有促进作用。烟草中甾醇主要包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇以及胆甾醇等4种化合物，在烟草中的含量约为0.1-0.3％，其中豆甾醇的含量最高。烟草甾醇主要存在于烟草细胞膜中，以游离态和结合态两种形式存在，结合态包括与脂肪酸结合形成酯，以及与糖类形成糖苷键的配糖类物质以及酰基配糖类化合物。不同产地烟叶中植物甾醇含量分布呈现出明显的地域差异，不同部位的烟叶叶片甾醇的含量也不同，中部叶含量最大，上部叶次之，下部叶含量最少。
甾醇类物质在烟草植物成熟之后对烟草品质没有多少贡献，反而是烟气中稠环芳烃类物质的最为主要前体化合物，稠环芳烃已经确认为致癌物质。已有大量研究报道烟草燃烧过程中，甾醇母核经过高温裂解可形成对人体有害的多环芳烃，包括致癌物质苯并(a)芘。因此降解烟草制品中的甾醇含量可以有效降低卷烟主流烟气中的PolycyclicAromaticHydrocarbons(PAHs)的释放，从而有效控制烟草对人体健康的危害。由此可见，甾醇类化合物降解转化对减少烟气毒害，提高烟草品质具有十分重要作用，因此，在烟草调制、陈化及烟草薄片加工过程中有效降解甾醇，对于提高卷烟的安全性具有重要价值。
类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的细菌为土壤中常见的细菌，也是一类重要的病害生物防治微生物。该菌属也可从一些植物体内分离到。现有离体实验表明，类芽孢杆菌在抑制植物病原菌增强植物抗病能力方面有很强作用，同时还有研究者发现，该菌属对甾醇类化合物的生物降解有重要作用。
目前已有部分研究报道，采用有机溶剂萃取法降低烟草中的游离甾醇含量来降低主流烟气中的PAHs的释放量。但是利用萃取法去除烟草中甾醇类化合物的效果不是很理想，同时可能会导致烟草中一些重要香味物质和潜稥物质的散失。应用生物技术降解烟草中部分有害物质的方法在近年来得到了一定的发展，然而关于烟草中甾醇类化合物的生物降解技术的相关研究却寥寥可数。
发明内容
本发明提供一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法。根据本发明可从烟草表面分离可降解甾醇菌株——类芽孢杆菌，并利用正交实验(不同温度、pH、不同生长阶段细胞)确定该菌株降解甾醇的最适条件。本发明中类芽孢杆菌降解甾醇类化合物，具有一定的选择性，同时整个过程简单且快速，可为生物法降解烟草中苯并芘的有害前提物质的开发提供参考，同时在烟草减害领域具有重要的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵。
它的步骤如下：
(1)降甾醇微生物的分离：用无菌水洗涤烟叶表面2-3次，收集沉淀，将沉淀用15mlpH7.0的磷酸缓冲液稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，37℃摇床中，150r/min培养，于富集培养基中富集培养3次后，取200μl培养液涂于固体平板上，培养48h后获得可降解甾醇的微生物单菌落；
(2)微生物扩大培养：挑取步骤(1)中的单菌落到种子培养基中，于37℃摇床中，150r/min培养48小时，获得种子培养液，保存于4℃，同时取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混匀后保存于-20℃；
(3)以步骤(2)中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养液中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定OD值，在18-52h收集细胞，分别在6000转，4℃下离心30min，去掉上清液；
(4)甾醇降解条件：收集18-52h的细胞，并以质量1：50的比例将干细胞加入到烟草浸提液中，置于37℃的摇床中，150r/min下发酵2-8h。
所述步骤(1)中分离培养基的组分：以分离培养基总量1L计，豆甾醇2.0±0.1g；葡萄糖2.0±0.1g；失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚1±0.1ml；柠檬酸2.0±0.1g；K2HPO40.5±0.01g；NH4Cl1.0±0.1g；余量为水。
所述步骤(1)中富集培养基的组分：以富集培养基总量1L计，豆甾醇，5.0±0.1g；tween80，1±0.1ml；柠檬酸，2.0±0.1g；柠檬酸铁胺，0.05±0.01g；K2HPO4，0.5±0.1g；NH4Cl，1.0±0.1g；余量为水。
所述步骤(3)中的种子培养液的组分：以种子培养液总量1L计，K2HPO4，0.5±0.01g；NH4NO3，2.0±0.1g；柠檬酸，2.0±0.1g；甘油，10.0±0.2g；余量为水，pH＝7.0-7.2。
本发明的有益效果：从烟叶表面分离获得降解甾醇的微生物，利用种子培养基进行扩大后获得对数期细胞，添加到烟草浸提液中可以有效降解其中的甾醇含量，甾醇总降解率达到35.5％。甾醇为烟草有害物质苯并芘的前体化合物，该发明为烟草生物减害提供参考，具有很高的原创性，有望应用于降低苯并芘的再造烟叶生产过程。
附图说明
图1为微生物细胞的生长曲线；
图2为标准样品中的甾醇液相质谱图；
图3为烟草浸提液中的甾醇液相质谱图。
具体实施方式
一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，它的步骤如下：
(1)降甾醇微生物的分离：烟叶来源于河南襄县，将烟叶去梗后，叶片剪成2cm*2cm的小叶片，用无菌去离子水洗涤2次，收集沉淀，用15mlpH7.0的磷酸缓冲液稀释沉淀，按照10％接种量接种到分离培养基中，37℃摇床中，150r/min培养，富集培养2次后，取200μl培养液涂于固体平板上，培养48h后获得可降解甾醇的微生物单菌落。所述分离培养基的原料为：豆甾醇7412.1g；失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(tween80)0.9ml；柠檬酸2.1g；K2HPO40.4g；NH4Cl1.1g；加水到0.9L。
(2)微生物扩大培养：挑取步骤(1)中的单菌落到种子培养基中，于37℃摇床中，150r/min培养48小时，获得种子培养液，保存于4℃，同时取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混匀后保存于-20℃。所述种子培养基的成分为：K2HPO40.6g、NH4NO32.1g、柠檬酸1.9g、甘油9.9g、加水到1.1L，pH＝7.0-7.2。
(3)以步骤(2)中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养基中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定OD值，绘制细胞生长曲线，见图1。在不同的生长阶段(初期(18h)、对数期(36h)以及后期(52h))收集细胞，分别在6000转，4℃下离心30min，去掉上清液。
(4)微生物降解甾醇条件优化：利用正交实验设置3个不同培养温度：30℃、37℃、42℃；3个不同的pH值：5.0，6.0，7.0。结合微生物的生长曲线，收集不同生长阶段的细胞(初期(18h)、对数期(36h)以及后期(52h))，并以质量1：50的比例将干细胞加入到烟草浸提液中，置于37℃的摇床中，150r/min下发酵4h，采用液相质谱法测定发酵前后的甾醇含量(标准YC/T501-2014)。确定微生物的最优降解条件(表1)。其特点在于：根据微生物的生长曲线，设定了9组正交实验，并以特定的细胞干重比例(1：50)加入到烟草浸提液中，最终确定了最优条件为pH5，温度37℃下的对数期细胞降解效率最高。
表1不同条件下甾醇的降解率
(5)不同甾醇的降解率：利用液相质谱法(标准YC/T501-2014)测定烟草浸提液中的甾醇，并确定5种不同甾醇在发酵前后的含量，通过计算确定最终的降解效率。图2和图3为标准溶液和烟草浸提液中的甾醇液相质谱图。
甾醇含量以每ml体积中的μg为计量单位，其甾醇降解率计算公式如下：

Claims (5)

1.一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：通过培养基从烟草表面分离甾醇降解菌，利用种子培养基扩大培养该微生物，搜集对数期细胞，接种于烟草浸提液，发酵。
2.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于，它的步骤如下：
(1)降甾醇微生物的分离：用无菌水洗涤烟叶表面2-3次，收集沉淀，将沉淀用15mlpH7.0的磷酸缓冲液稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，37℃摇床中，150r/min培养，于富集培养基中富集培养3次后，取200μl培养液涂于固体平板上，培养48h后获得可降解甾醇的微生物单菌落；
(2)微生物扩大培养：挑取步骤(1)中的单菌落到种子培养基中，于37℃摇床中，150r/min培养48小时，获得种子培养液，保存于4℃，同时取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混匀后保存于-20℃；
(3)以步骤(2)中的种子培养液为种子，重新取1ml接种到50ml新鲜的种子培养液中，相同条件下培养48小时，每隔5小时取2ml菌液，测定OD值，在18-52h收集细胞，分别在6000转，4℃下离心30min，去掉上清液；
(4)甾醇降解条件：收集18-52h的细胞，并以质量1：50的比例将干细胞加入到烟草浸提液中，置于37℃的摇床中，150r/min下发酵2-8h。
3.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：所述步骤(1)中分离培养基的组分：以分离培养基总量1L计，豆甾醇2.0±0.1g；葡萄糖2.0±0.1g；失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚1±0.1ml；柠檬酸2.0±0.1g；K2HPO40.5±0.01g；NH4Cl1.0±0.1g；余量为水。
4.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：所述步骤(1)中富集培养基的组分：以富集培养基总量1L计，豆甾醇，5.0±0.1g；tween80，1±0.1ml；柠檬酸，2.0±0.1g；柠檬酸铁胺，0.05±0.01g；K2HPO4，0.5±0.1g；NH4Cl，1.0±0.1g；余量为水。
5.如权利要求1所述的生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的种子培养液的组分：以种子培养液总量1L计，K2HPO4，0.5±0.01g；NH4NO3，2.0±0.1g；柠檬酸，2.0±0.1g；甘油，10.0±0.2g；余量为水，pH＝7.0-7.2。
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