CN110184190A - 用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法 - Google Patents

用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110184190A
CN110184190A CN201910398193.3A CN201910398193A CN110184190A CN 110184190 A CN110184190 A CN 110184190A CN 201910398193 A CN201910398193 A CN 201910398193A CN 110184190 A CN110184190 A CN 110184190A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sterol
culture medium
cholic acid
bacterial strain
fermenting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910398193.3A
Other languages
English (en)
Inventor
杜琳
张亮富
宋立波
熊丹梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Bai Dai Shi Shi Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Chengdu Bai Dai Shi Shi Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Bai Dai Shi Shi Biotechnology Co Ltd filed Critical Chengdu Bai Dai Shi Shi Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201910398193.3A priority Critical patent/CN110184190A/zh
Publication of CN110184190A publication Critical patent/CN110184190A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种能够提高发酵菌将甾醇转化为粗胆酸的转化率，并且工艺简单的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法。该发酵菌的定向改进方法包括以下步骤：S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间30d以上；S2、取甾醇倾倒出的土壤；提取菌悬液；将菌悬液滴入到培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；S3、将单菌落在培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；S5、纯菌株接种到新的甾醇培养基上；计算胆酸的转化率；S6、重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。采用该发酵菌的定向改进方法工艺简单，获得的发酵菌转化率高。

Description

用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法
技术领域
本发明涉及将甾醇发酵生产胆酸的领域，具体涉及一种用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌 的定向改进方法。
背景技术
熊去氧胆酸是治疗胆结石疾病的老药，随着熊去氧胆酸需求的增长，以及奥贝胆酸上市， 鹅去氧胆酸的需求越来越大，即将出现供不应求的局面，所以需要开发熊去氧胆酸的其它来 源。
鹅去氧胆酸是从鸡，鸭，猪胆里提取的天然物，主要用于熊去氧胆酸和奥贝胆酸的生产， 随着熊去氧胆酸需求的增长，以及奥贝胆酸上市，对鹅去氧胆酸的需求越来越大，即将出现 供不应求的局面，所以需要开发其它来源。
然而，甾醇可以通过在植物中进行提取，因此来源广泛，便于获得。并且熊去氧胆酸、 鹅去氧胆酸等胆酸可以通过甾醇生物发酵法进行制备。
由于现有的甾醇发酵生产胆酸的发酵菌将甾醇发酵生产胆酸率较低，因此需要对发酵菌 进行定向改进，从而提高发酵菌的转化率。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提出了一种能够提高发酵菌将甾醇转化为粗胆酸的转化率， 并且工艺简单的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：用于甾醇发酵生产胆酸的发 酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：
S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间30d以上；
S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为 甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；
S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌 株编号保存；
S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产 胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；
S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培 养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；
S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆 酸的转化率大于或者等于90％。
进一步的，在步骤S2中，通过取甾醇倾倒出的土壤；置消毒试管中，加入无菌水以涡旋 振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。
具体的，在步骤S2中通过以下方法获得菌落，将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上， 并且放置到恒温培养箱中培养，等到长出菌落后，挑出单菌落。
具体的，在步骤S4中通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；
将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基放置于试管中，加 冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃ 水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力:若不显蓝紫色，则不具备转化能力。
本发明所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其有益效果在于：本发 明所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法在S1步骤中通过在自然界获得能 够将甾醇进行转化，同时可以适应具有甾醇的培养基的菌种。
然后通过对菌种进行筛选，筛选出能够将甾醇转化为胆酸的菌株，最后在对菌株进行诱 导培养，从而获得高转化率的发酵菌。因此，本发明所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌 的定向改进方法，工艺简单，便于实现，同时获得的发酵菌转化率较高。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。
本发明所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：
S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间60d以上；
S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为 甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；
S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌 株编号保存；
S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产 胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；
S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培 养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；
S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆 酸的转化率大于或者等于90％。
在步骤S1中通过在土壤中连续倾倒甾醇，从而排出土壤中不能适应甾醇环境生长的菌 落；最终土壤中留下的均为能够适应甾醇培养基的菌落。
在步骤S2中，通过获取土壤中原始的甾醇转化发酵菌，然后对发酵菌进行选取。
在步骤S3中，选取纯菌株，并且在S4步骤中对纯菌落中，能够将甾醇转化为胆酸的菌 落进行筛选。
在步骤S5和S6中对能够将甾醇转化为胆酸的菌落进行诱导培养，从而得到高转化率的 发酵菌。
具体的，在步骤S2中，通过取甾醇倾倒出的土壤；置消毒试管中，加入无菌水以涡旋振 荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。
具体的，在步骤S2中通过以下方法获得菌落，将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上， 并且放置到恒温培养箱中培养，等到长出菌落后，挑出单菌落。
具体的，在步骤S4中通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；
将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基放置于试管中，加 冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃ 水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力:若不显蓝紫色，则不具备转化能力。
实施例1
用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：
S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间65d；
S2、取甾醇倾倒出的土壤5g；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液 为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；
通过取甾醇倾倒出的土壤5g；置消毒试管中，加入无菌水50ml以涡旋振荡器振荡摇匀， 静置后取上层清液，从而获得菌悬液。
将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上，并且放置到25℃恒温培养箱中培养，等到长 出菌落后，挑出单菌落；所述培养基还包括葡萄糖50g，其中甾醇液1000mL；
S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌 株编号保存；
S4、将50份纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵 生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；
通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；
将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1g放置于试管中， 加冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃ 水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力；若不显蓝紫色，则不具备转化能力。
S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培 养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；
S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆 酸的转化率为91％；从而获得发酵菌。
实施例2
用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，包括以下步骤：
S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间65d；
S2、取甾醇倾倒出的土壤5g；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液 为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；
通过取甾醇倾倒出的土壤5g；置消毒试管中，加入无菌水50ml以涡旋振荡器振荡摇匀， 静置后取上层清液，从而获得菌悬液。
将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上，并且放置到28℃恒温培养箱中培养，等到长 出菌落后，挑出单菌落；所述培养基还包括葡萄糖60g，其中甾醇液1500mL；
S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌 株编号保存；
S4、将50份纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵 生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；
通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；
将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基1g放置于试管中， 加冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃ 水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力；若不显蓝紫色，则不具备转化能力。
S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培 养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；
S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆 酸的转化率为95％；从而获得发酵菌。

Claims (4)

1.用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将甾醇连续倾倒在同一地点的土壤中，持续时间60d以上；
S2、取甾醇倾倒出的土壤；在采取的土壤试样中提取菌悬液；将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上培养获得菌落后，挑出单菌落；
S3、将单菌落在营养液为甾醇的新的培养基上培养，并且判断出是否为纯菌株；将纯菌株编号保存；
S4、将纯菌株分别接种到新的甾醇培养基上；同时判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；如果有则将该纯菌株保留，如果没有则去除该纯菌株；
S5、将保留的纯菌株接种到新的甾醇培养基上；然后将菌落和培养基底分离，并且在培养基底中提纯胆酸，并且计算胆酸的转化率；
S6、继续将分离出来的菌落接种到新的甾醇培养基上，重复步骤S5，直到甾醇转化为胆酸的转化率大于或者等于90％。
2.根据权利要求1所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其特征在于：在步骤S2中，通过取甾醇倾倒出的土壤；置消毒试管中，加入无菌水以涡旋振荡器振荡摇匀，静置后取上层清液，从而获得菌悬液。
3.根据权利要求1所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其特征在于：在步骤S2中通过以下方法获得菌落，将菌悬液滴入到营养液为甾醇的培养基上，并且放置到恒温培养箱中培养，等到长出菌落后，挑出单菌落。
4.根据权利要求1所述的用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法，其特征在于：在步骤S4中通过显色法判断纯菌株是否具有将甾醇发酵生产胆酸的能力；
将菌株接种在甾醇培养基中，待长出单菌落后，取菌落下面的培养基放置于试管中，加冰醋酸溶液，超声处理，滤过，取滤液，置试管中，加新制的糠醒溶液与硫酸溶液，在70℃水浴中加热，溶液如呈蓝紫色，则此菌株具备转化能力；若不显蓝紫色，则不具备转化能力。
CN201910398193.3A 2019-05-14 2019-05-14 用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法 Pending CN110184190A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910398193.3A CN110184190A (zh) 2019-05-14 2019-05-14 用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910398193.3A CN110184190A (zh) 2019-05-14 2019-05-14 用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110184190A true CN110184190A (zh) 2019-08-30

Family

ID=67716195

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910398193.3A Pending CN110184190A (zh) 2019-05-14 2019-05-14 用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110184190A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101928679A (zh) * 2009-09-22 2010-12-29 江南大学 一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育
CN105349478A (zh) * 2015-12-23 2016-02-24 郑州轻工业学院 一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法
CN106434822A (zh) * 2016-12-27 2017-02-22 河南利伟生物药业股份有限公司 一种采用微生物转化法制备高含量胆酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101928679A (zh) * 2009-09-22 2010-12-29 江南大学 一株高效转化L-谷氨酸为γ-氨基丁酸乳酸菌的选育
CN105349478A (zh) * 2015-12-23 2016-02-24 郑州轻工业学院 一种生物法降解烟草浸出液中甾醇类化合物的方法
CN106434822A (zh) * 2016-12-27 2017-02-22 河南利伟生物药业股份有限公司 一种采用微生物转化法制备高含量胆酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杜敏: "《药学微生物实用技术 供中职使用》", 31 August 2009 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101270329B (zh) 液态深层发酵生产高浓度果醋制备方法
CN101659924A (zh) 一种黑曲霉菌种及其在厌氧发酵制备低聚果糖中的应用
CN106906106A (zh) 一种酿造酒的酯化红曲制备方法
CN103766781A (zh) 一种富含纳豆激酶和Monaclin K的豆豉的制备方法
CN102964170A (zh) 双孢菇液体菌种配方及其制备方法
CN104004720B (zh) 一种大规模高密度生产猪圆环病毒2型抗原的方法
CN106635919A (zh) 一种螺旋藻的养殖方法
CN107022581A (zh) 一种利用空气压力脉动固体发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法
CN114027105A (zh) 一种高蛋白杏鲍菇液体菌种的培养方法
WO2017016199A1 (zh) 一种沙链霉菌的用途及香兰素的生产方法
CN102864190A (zh) γ-氨基丁酸的生产方法
CN110184190A (zh) 用于甾醇发酵生产胆酸的发酵菌的定向改进方法
CN102002481A (zh) 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法
CN114591878B (zh) 一种制备海水养殖尾水处理菌剂的工艺及尾水处理方法
CN103343151B (zh) 一种细菌纤维素薄膜的液体培养基制备方法
CN114409826B (zh) 一种从美洲大蠊药渣中提取甲壳素的方法
CN105272424A (zh) 一种低温农家自用腐熟剂的制备方法
CN109082449A (zh) 一种基于植物源的l-组氨酸生产工艺
CN104531575A (zh) 一种凝结芽孢杆菌固态发酵生产方法
CN109168972A (zh) 一种杏鲍菇的栽培工艺
CN112772282A (zh) 一种蛹虫草的培育方法
CN110129205A (zh) 一种白灵菇液体菌种培养基及白灵菇液体菌种制备方法
CN103937679B (zh) 一种制醋的曲霉菌种
CN104789489A (zh) 一株高产精氨酸脱亚胺酶的蜡样芽孢杆菌及其应用
CN110408511A (zh) 利用红曲发酵过滤液生产红曲米醋的制备工艺

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190830

RJ01 Rejection of invention patent application after publication