CN101182542A - 用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷的毛状根的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用基因工程技术遗传转化粘毛黄芩，获得生产黄芩苷的粘毛黄芩的毛状根的方法。涉及包含发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩的方法，遗传转化获得可生产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根。其过程是用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩，获得了粘毛黄芩毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的粘毛黄芩毛状根能够生产黄芩苷。本方法可以为黄芩苷的生产提供一种新型可持续的新型药源。

Description

用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷的毛状根的方法

技术领域

本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种利用转基因技术获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的方法，具体涉及发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩并获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的具体程序。本发明还提供利用基因工程技术获得的产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根及其培养的子代。

背景技术

植物次生代谢产物具有极其复杂的化学结构，至今仍没有找到有效的或经济的合成方法。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。

目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的毛状根的相关研究较多，但对遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷毛状根的研究仍是空白。粘毛黄芩属于唇形科黄芩属多年生药用草本植物。该属植物约300多种，世界广布，我国有100种以上，可作为黄芩药用者约有7种左右，粘毛黄芩就是其中的一种。该植物主要药用成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等黄酮类化合物，现代药理学证实其具有清热解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利胆、降压脱敏、防晒美白等作用。随着国际上对黄芩苷等研究的持续升温和认识的逐步深入，认为黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV等多方面均有作用，具有重要的药用价值和开发利用前景。然而目前获得粘毛黄芩的主要技术是人工栽培，但存在生产周期长、成活率低、农药残留超标和有效成分较低等弊端，使得该方式商业前景尚不明朗。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种转基因技术遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入粘毛黄芩中，获得粘毛黄芩毛状根；

本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法转化的宿主细胞，这种经转化的宿主细胞发育为毛状根。在实例中该宿主细胞是粘毛黄芩

本发明的技术方案如下：

一种获得产黄芩苷粘毛黄芩毛状根的方法和利用该方法获得的产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根，该方法步骤如下：

(1)采用任何可能的手段获得无菌的粘毛黄芩；

(2)采用任何转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到粘毛黄芩细胞、组织、器官、植株中；包括以下步骤：

A、活化发根农杆菌；

B、发根农杆菌浸染粘毛黄芩外植体；

C、发根农杆菌与粘毛黄芩外植体的共培养，步骤如下：

I、将侵染后的粘毛黄芩外植体接种在MS+AS 100μmol·L^-1固体培养基上；

II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养1～5天

D、外植体的除菌培养；

(3)在特定的条件下筛选和鉴定毛状根，方法如下：

I、提取粘毛黄芩毛状根DNA

II、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

III、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

IV、电泳检测目标条带；

(4)在适合的条件下培养粘毛黄芩毛状根，用于生产黄芩苷。

用上述方法获得的生命体，它是可生产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根。

在本发明中，术语“生命体”指粘毛黄芩的细胞、组织、器官、植株。

在本发明中，术语“任何转基因方法”包括发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。

在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指用在离体培养的条件下根据毛状根特殊的形态学特征初步鉴定转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。

在本发明中，术语“在适合的条件下培养粘毛黄芩毛状根”是指对经过鉴定的粘毛黄芩毛状根离体培养，并检测黄芩苷的含量，筛选黄芩苷含量提高的优良转化子进行培养，获得其后代。

在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入粘毛黄芩细胞获得转化毛状根，通过筛选优良无性系，获得黄芩苷及其相关黄酮类化合物含量相对较高而稳定的毛状根无性系，为黄芩苷的生产提供一种新型优质的可持续使用的药源。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

粘毛黄芩无菌外植体的获得

方法一：利用外植体建立粘毛黄芩无菌外植体

采集粘毛黄芩新萌发出来的幼苗叶片，流水冲洗1小时；然后用75％(V/V)乙醇浸泡45秒，无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡9分钟，无菌水冲洗5次；然后接种在添加无菌丛生芽诱导培养基中(培养基盛于150mL三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS基本培养基，30g/L蔗糖调节培养基，pH值为5.8，再添加8.5g·L^-1的琼脂粉。在光照培养箱中培养粘毛黄芩的叶片，培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1。17天后，即可获得无菌的粘毛黄芩无菌幼苗，等到幼茎长到6cm长时可用于遗传转化。

方法二：利用粘毛黄芩种子在无菌条件下萌发获得无菌外植体

选取粘毛黄芩饱满种子在清水中浸泡10小时，然后流水冲洗5小时，75％(V/V)乙醇浸泡30秒，0.1％HgCl₂(M/V)浸泡12分钟，无菌水洗涤5次，接种于MS培养基上，25℃的恒温培养箱中暗培养。14天后，种子开始萌发，然后将其置于温度为25℃，光周期为12小时，光强为2000 Lx的恒温培养箱中，22天后长成茁壮的幼苗，切取茎段做转化外植体用。

实施例2

发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩获得毛状根

1、发根农杆菌C58C1。使用前自超低温冰箱取出，接种于50ml YEB液体培养基中(添加利福平终浓度为40mg·L^-1)，28℃，200rpm振荡培养两次，复苏菌体；

2、第二次活化培养结束两小时前加入乙酰丁香酮，使其终浓度达到100μmol·L^-1也即菌液OD₆₀₀达0.4时，加入乙酰丁香酮，继续28℃，200rpm振荡培养，菌液OD₆₀₀达0.6时，可用于转化；

3、室温下4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用等体积MS液体培养基(含100μmol·L^-1乙酰丁香酮)悬浮，在28℃，200rp振荡培养，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.2左右，成为转化液，此时可用于粘毛黄芩的遗传转化；1、2、3个步骤称为活化发根农杆菌；

4、取无菌粘毛黄芩幼嫩真叶、幼茎段、子叶和愈伤组织等植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm²左右，用无菌解剖针戳一些圆形伤口，放入上述转化液中，浸染15分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接种于添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2～3天，培养条件为：25℃，无光照。该步骤称发根农杆菌与粘毛黄芩的共培养。

5、共培养结束后，在无菌吸水纸上吸干外植体上多余水分，转移至无植物生长调节物的MS固体除菌培养基(添加500mg·L^-1头孢菌素以达到除菌的目的)中培养，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。9天后，在粘毛黄芩受伤的部位开始出现毛状根。该步骤称为粘毛黄芩的除菌培养。

6、外植体每隔5天转入新鲜的同样的培养基中，待转化外植体上诱导出的毛状根长到5cm左右时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2 MS固体培养基上(添加500mg·L^-1头孢菌素以达到除菌的目的)继代培养；在无植物生长调节物的1/2 MS固体培养基上生长的粘毛黄芩毛状根表现出毛状根特有的形态学特征：生长十分迅速、分枝很多、生长失去向地性。以后每15～20天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除杆菌；然后仅在1/2 MS固体培养基上继代培养方可。该步骤为粘毛黄芩毛状根的获得与继代培养。

实施例3

粘毛黄芩毛状根的分子检测

1、粘毛黄芩毛状根基因组DNA的提取，方法如下：

1)取200mg液体培养两周的毛状根，过滤后用10mL蒸馏水洗涤，充分吸干，液氮速冻，研磨成粉。

2)1.5mL Eppendorf管中，加500μL抽提buffer(3％巯基乙醇)，充分震荡65℃水浴50分钟，每5分钟颠倒混匀。

3)4℃、12,000rpm，离心10分钟。

4)吸上清，加500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟钟至分层。

5)室温，12,000rpm，离心10分钟。

6)吸上清约350μL，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

7)室温，12,000rpm，离心10分钟。

8)吸上清约250μL，加2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，充分混匀，室温放置10分钟见有絮状DNA析出。

9)室温，12,000rpm，离心10分钟。

10)弃上清，沉淀用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置10分钟，使乙醇挥发完全。

11)加1μLRNAase，50μLTE，混匀，37℃水浴30-40分钟。

12)加40 μL氯仿，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

14)室温，12,000rpm，离心10分钟。

13)吸取上清(约35μL)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。

抽提缓冲液配方如下：

100mM         Tris-HCl(pH8.0)

2.5％(V/V)    巯基乙醇

500mM         NaCl

20mM          EDTA

1.5％(W/V)    SDS

2、粘毛黄芩毛状根中rolB和rolC基因的PCR检测

诱发并维持毛状根形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。基因检测的PCR引物：rolB(423 bp)的引物为：frolB(5’-GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT-3’)，rrolB(5’-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3’)；rolC(626 bp)的引物为：frolC(5’-TAA CAT GGC TGAAGA CGA CC-3’)，rrolC(5’-AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC-3’)。

反应体系均为(25μL)：ddH₂O 18μL，10×PCR buffer 2.5μL，25 mmol/L MgCL₂ 2.0μL，10 mmol·L^-1 dNTP mix 0.25μL，10mmol/L primerl 0.25μL，10 mmol/L primer 2 0.25μL，Taq DNApoLymerase 0.25μL(1.25U)，Template基因组DNA 1.5μL。

PCR反应程序：94℃ 5min →35循环(94℃ for 40sec→56℃for 40sec→72℃for 1min)→72℃8min。阳性对照为相应的工程菌，粘毛黄芩的天然叶片作为阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolb的扩增条带大小为423bp，rolc为626bp。

实施例4

粘毛黄芩毛状根中黄芩苷含量和野生根中的含量比较

1、黄芩苷吸收峰测定和标准曲线的制作

精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用200mL 75％(V/V)乙醇溶解，配成浓度为1000μg/mL，用乙醇溶液作空白对照，在200～500nm波长下测黄芩苷的吸光度值，得到最大吸收波长。然后讲母液分别梯度稀释成200、100、80、60、40、20μg·mL^-1。分别往试管中加各梯度浓度标准溶液1mL，加75％乙醇至5mL，分别加入0.3mL 5％亚硝酸钠，0.3mL 10％硝酸铝溶液，然后以75％乙醇定容至10mL，混匀，放置20分钟，于278nm波长处，用1cm比色杯测其吸光值，黄芩苷含量(μg)为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，得对照品的线性回归方程和标准曲线。

2、粘毛黄芩中黄芩苷含量的测定

将培养30d的单克隆毛状根洗净，用吸水纸吸干水分，称鲜重后冷冻干燥30h至恒重，研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎20min，过滤，再提取一次，合并滤液，将甲醇提取液浓缩蒸干，用甲醇定容至10mL，-20℃保存，作为供试样品溶液。三年生自然根打粉后，称取150mg，提取方法同上。

精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用色谱纯甲醇溶解过滤，配成浓度为1000μg/mL，分别梯度稀释成280、140、70、35、17.5μg·mL^-1。在相应的色谱条件下进样，且每一浓度进样三次，记录图谱及色谱参数，分别以峰面积对进样量回归分析，得对照品的线性回归方程和标准曲线。结果为：粘毛黄芩毛状根中黄芩苷含量占干重3.58％，与3年生野生药材黄芩黄芩苷的含量(7.62％)相比，约为药材黄芩0.47倍，但从单位时间黄芩苷生成量来看，毛状根系是药材黄芩的17.14倍，可见粘毛黄芩毛状根培养技术是获取黄芩苷的高效策略。

Claims (3)

1.一种获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩的器官，其步骤如下：

(1)粘毛黄芩无菌外植体的获得；

(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到粘毛黄芩细胞、组织、器官或植株中；其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化；包括以下步骤：

A、活化发根农杆菌；

B、发根农杆菌浸染粘毛黄芩外植体；

C、发根农杆菌与粘毛黄芩外植体的共培养，步骤如下：

I、将侵染后的粘毛黄芩外植体接种在MS+AS 100μmol·L^-1固体培养基上；

II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养1～5天

D、外植体的除菌培养；

(3)粘毛黄芩毛状根的获得与继代培养；

(4)粘毛黄芩毛状根的分子检测，方法如下：

I、提取粘毛黄芩毛状根DNA

II、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

III、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

IV、电泳检测目标条带；

(5)粘毛黄芩毛状根中黄芩苷的含量检测。

2.用权利要求1所述方法获得产黄芩苷的粘毛黄芩的毛状根，其特征在于其基因组中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因。

3.用权利要求1所述方法获得粘毛黄芩毛状根的继代培养毛状根。