CN101223862A - 获产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用组织培养技术诱导木本曼陀罗毛状根，获得高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗的再生植株的方法。涉及诱导木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，获得可生产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗完整植株，其过程是用合适的组织培养技术诱导木本曼陀罗毛状根，获得了木本曼陀罗再生植株，经分子检测确为遗传转化的毛状根再生植株，HPLC检测表明组织培养获得的木本曼陀罗毛状根再生植株能够生产莨菪碱和东莨菪碱，且其产量均显著高于野生植株。本方法可以为莨菪碱和东莨菪碱的生产提供一种新型可持续的新型药源。

Description

获产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法

技术领域

本发明属于分子生物学、生药学、育种学以及细胞工程等领域，涉及一种利用组织培养技术获得高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，具体涉及诱导木本曼陀罗毛状根再生并获得高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗植株的具体程序。本发明还提供利用组织培养技术获得的高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根再生植株及其培养的子代。

背景技术

木本曼陀罗属于茄科曼陀罗属多年生药用乔木植物。该属植物约16多种，多分布于热带和亚热带地区，温带则较少，我国有4种，南北各省均有分布，野生或栽培。该植物主要药用成分为莨菪碱和东莨菪碱等托品烷类生物碱，现代药理学证实其具有扩瞳、解痉、麻醉、止痛和抑制腺体分泌等作用，且主要作为副交感神经系统的抗胆碱药，临床治疗麻痹症、运动症、肠胃痉挛性绞痛和三叉神经痛等，效果甚好。随着国际上对莨菪碱和东莨菪碱研究的持续升温和认识的逐步深入，认为莨菪碱和东莨菪碱具有重要的药用价值和开发利用前景。然而目前获得木本曼陀罗的主要技术是野生取材和人工栽培，但存在自然繁殖不便、生产周期长、野生资源渐危、农药残留超标和有效成分低等弊端，使得该方式商业前景尚不明朗。利用基因工程技术获得高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗新品种是一种有效方法，但直接通过根癌农杆菌和基因枪转化获得转基因木本曼陀罗植株还未见报道。通过发根农杆菌遗传转化可获得高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根，由于毛状根起源于一个单细胞，因此由毛状根再生的植株是纯合体，解决了Ti质粒转化形成嵌合体的问题。并且Ri质粒的T-DNA可按孟德尔方式稳定遗传，所得到的转化植株大多经数代分化繁殖其克隆的性质不变，均表现出特异的可遗传优良表型。

目前通过发根农杆菌遗传转化获得毛状根并再生完整植株的方法已在较多的物种上得以应用，且多为较名贵的药材，可见其潜力不容小视。由转基因木本曼陀罗再生出完整植株，通过筛选鉴定具有高含量莨菪碱和东莨菪碱的转化木本曼陀罗植株可为理论研究和生产实践提供巨大的动力和广阔的前景，特别是最终解决莨菪碱和东莨菪碱药物稀缺提供木本曼陀罗优质新品种，但尚未发现与本发明主题所提及的木本曼陀罗毛状根再生植株相关的报道。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种组织培养技术诱导木本曼陀罗毛状根再生获得高产莨菪碱和东莨菪碱植株的方法，本发明涉及木本曼陀罗毛状根愈伤组织诱导培养基、不定芽诱导培养基、不定芽生根培养基的组织培养技术，建立了木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，为基于现代生物技术的木本曼陀罗的遗传改良和种质创新奠定了坚实的基础，促进了我国木本曼陀罗药物技术领域的发展；

本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法诱导的宿主细胞，这种经诱导的宿主细胞发育为再生植株。在实例中该宿主细胞是木本曼陀罗毛状根。

本发明的技术方案如下：

一种获得高产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法和利用该方法获得的高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根再生植株，该再生植株是一种采用本发明所述方法创造的新生命体。

该方法步骤如下：

(1)木本曼陀罗毛状根愈伤组织的诱导和不定芽的分化，方法如下：

A：将木本曼陀罗毛状根切成约2-3cm长的节段，转入愈伤组织诱导培养基上，所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+4.0mg·L^-16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.5mg·L^-1激动素(KT)+0.5mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。置于25℃±1.0℃恒温培养，15h光照/天，15天后毛状根大部分愈伤化，随着培养时间延长，愈伤组织体积迅速增大；

B：从诱导出的毛状根愈伤组织中选取生长良好、无褐化的部分毛状根转入不定芽诱导培养基，所述的不定芽诱导培养基为MS培养基+4.0mg·L^-16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.2mg·L^-1萘乙酸(NAA)+30g·L^-1蔗糖。经过14天光照培养后，在愈伤组织上开始出现芽点，随着培养时间延长，芽点陆续分化出芽，芽不断伸长，并长出真叶。

(2)木本曼陀罗不定芽的生根培养，切取从木本曼陀罗毛状根分化出的绿色不定芽，转入生根培养基中，所述的生根培养基为1/2MS培养基+0.1mg·L^-1吲哚-3-丁酸(IBA)+30g·L^-1蔗糖。置于25℃±1.0℃恒温培养，15h光照/天，6天后开始长出不定根，逐渐形成完整的再生植株。

(3)木本曼陀罗毛状根的再生植株的分子检测，方法如下：

A、提取木本曼陀罗毛状根再生植株DNA；

B、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

C、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

D、电泳检测目标条带。

(4)木本曼陀罗毛状根再生植株中莨菪碱和东莨菪碱的含量检测。

(5)木本曼陀罗毛状根再生植株的移栽，选取生长健壮的无菌植株，经过室温炼苗后移栽到花盆中，短期驯化后可获得生长正常的木本曼陀罗植株。

用上述方法获得的生命体，它是可生产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根再生植株。

在本发明中，利用组织技术，筛选出适合木本曼陀罗毛状根愈伤组织诱导、不定根分化和生根的培养基，木本曼陀罗毛状根的愈伤组织诱导率达92.5％，不定芽分化率为62.5％，不定芽生根率为100％，再生植株的移栽成活率为85％。诱导木本曼陀罗细胞毛状根再生，通过筛选鉴定优良转化体，获得莨菪碱和东莨菪碱相对较高且稳定的再生植株株系，为莨菪碱和东莨菪碱的生产提供一种新型优质的可持续使用的药源。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

木本曼陀罗毛状根愈伤组织的诱导和不定芽的分化

将木本曼陀罗毛状根切成约2-3cm长的节段，转入愈伤组织诱导培养基上，其配方为MS培养基+4.0mg·L^-16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.5mg·L^-1激动素(KT)+0.5mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。置于25℃±1.0℃恒温培养，15h光照/天，15天后毛状根大部分愈伤化，随着培养时间延长，愈伤组织体积迅速增大；从诱导出的毛状根愈伤组织中选取生长良好、无褐化的部分毛状根转入不定芽诱导培养基，其配方为MS培养基+4.0mg·L^-16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.2mg·L^-1萘乙酸(NAA)+30g·L^-1蔗糖。经过14天光照培养后，在愈伤组织上开始出现芽点，随着培养时间延长，芽点陆续分化出芽，芽不断伸长，并长出真叶。

实施例2

木本曼陀罗不定芽的生根培养

切取从木本曼陀罗毛状根分化出的绿色不定芽，转入生根生根培养基中，其配方为1/2MS培养基+0.1mg·L^-1吲哚-3-丁酸(IBA)+30g·L^-1蔗糖。置于25℃±1.0℃恒温培养，15h光照/天，6天后开始长出不定根，逐渐形成完整的再生植株。

实施例3

木本曼陀罗毛状根再生植株的分子检测

1、木本曼陀罗毛状根再生植株基因组DNA的提取，方法如下：

(1)取200mg木本曼陀罗毛状根再生植株的叶片，过滤后用10mL蒸馏水洗涤，充分吸干，液氮速冻，研磨成粉。

(2)1.5mL Eppendorf管中，加500μL抽提buffer(3％巯基乙醇)，充分震荡65℃水浴50分钟，每5分钟颠倒混匀。

(3)4℃、12,000rpm，离心10分钟。

(4)吸上清，加500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟钟至分层。

(5)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(6)吸上清约350μL，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

(7)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(8)吸上清约250μL，加2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，充分混匀，室温放置10分钟见有絮状DNA析出。

(9)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(10)弃上清，沉淀用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置10分钟，使乙醇挥发完全。

(11)加1μL RNAase，50μL TE，混匀，37℃水浴30-40分钟。

(12)加40μL氯仿，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

(13)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(14)吸取上清(约35μL)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。

抽提缓冲液配方如下：

100mM    Tris-HCl(pH8.0)

2.5％(V/V)    巯基乙醇

500mM         NaCl

20mM          EDTA

1.5％(W/V)    SDS

2、木本曼陀罗毛状根再生植株中rolB和rolC基因的PCR检测

诱发并维持毛状根及其再生植株形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。基因检测的PCR引物：rolB(423 bp)的引物为：frolB(5’-GCT CTT GCA GTGCTA GAT TT-3’)，rrolB(5’-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3’)；rolC(626 bp)的引物为：frolC(5’-TAA CAT GGC TGAAGA CGA CC-3’)，rrolC(5’-AAA CTT GCACTC GCC ATG CC-3’)。

反应体系均为(25μL)：ddH₂O 18μL，10×PCR buffer 2.5μL，25 mmol/L MgCL₂ 2.0μL，10mmol.L^-1 dNTP mix 0.25μL，10mmol/L primerl 0.25μL，10mmol/L primer 20.25μL，Taq DNA polymerase 0.25μL(1.25U)，Template基因组DNA 1.5μL。

PCR反应程序：94℃ 5min→35循环(94℃for 40 sec→55℃ for 40 sec→72℃ for1min)→72℃ 8min。阳性对照为相应的工程菌，木本曼陀罗的天然叶片作为阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolb的扩增条带大小为423bp，rolc为626bp。

实施例4

木本曼陀罗毛状根再生植株中莨菪碱和东莨菪碱含量与野生木本曼陀罗根中的含 量比较

1、莨菪碱和东莨菪碱对照品的HPLC标准曲线的制作

分别精密称取2mg莨菪碱和东莨菪碱标准对照品，用甲醇(色谱纯)溶解过滤，配成终浓度为1000μg·mL^-1，分别稀释成500μg·mL^-1、250μg·mL^-1、100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、10μg·mL^-1、5μg·mL^-1。每一浓度进样三次记录图谱及色谱参数，分别以峰面积和进样量(μg·mL^-1)进行线性回归，以进样量为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2、木本曼陀罗中莨菪碱和东莨菪碱含量的测定

将培养30d的单克隆毛状根再生植株外植体洗净，用吸水纸吸干水分，称鲜重后60℃干燥24h至恒重，研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎40min，过滤，再提取一次，合并滤液，挥干甲醇提取液，残留物溶于5mL 200m mol·L^-1的NH₄Cl(pH9.8)，过柱(20×1cm)，填充物为4.5g Extrelut-20(Merck)，后用10mL氯仿饱和氨水洗柱，重复三次，洗脱液在40℃下用暖风吹干，残留物溶于1mL HPLC流动相(17％V/V乙腈溶于50mM KH₂PO₄，用磷酸调pH至3.0)，最后用Millipor 0.2μm滤纸过滤，-20℃保存，作为供试样品溶液待用。自然根打粉后，称取30mg，提取方法同上。

HPLC含量测定结果为：木本曼陀罗毛状根再生植株中莨菪碱的含量为105.05μg·g^-1DW，是野生药材木本曼陀罗自然根中莨菪碱含量的8倍以及叶片中的6倍；而东莨菪碱含量达到218.122μg·g^-1 DW，是野生药材木本曼陀罗自然根中莨菪碱含量的15倍。可见木本曼陀罗毛状根培养技术是获取莨菪碱和东莨菪碱的高效策略。

实施例5

木本曼陀罗毛状根再生植株的移栽

待再生植株长至5cm左右时，揭开封口膜，于室温下炼苗7天，再移栽到掺有蛭石的土壤中盆栽。培养过程中观察移栽苗生长情况，发现小部分植株培养一周后，植株发黄，逐渐黄化，枯萎致死；大部分再生植株开始一周时，叶片萎蔫，生长缓慢，个体较纤细，随着适应期过后，叶片很快挺立起来，颜色变绿，长势逐渐良好，一个月后，生长成为健壮的木本曼陀罗完整植株，很好地存活下来。

Claims (5)

1.一种获产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，特征在于采用组织培养技术，用木本曼陀罗毛状根外植体诱导获得生长正常的木本曼陀罗活体植株，其步骤如下：

(1)木本曼陀罗毛状根愈伤组织的诱导和不定芽的分化，方法如下：

A：将木本曼陀罗毛状根切成约2-3cm长的节段，转入愈伤组织诱导培养基上，置于25℃±1.0℃恒温培养，15h光照/天，15天后毛状根大部分愈伤化，随着培养时间延长，愈伤组织体积迅速增大；

B：从诱导出的毛状根愈伤组织中选取生长良好、无褐化的部分毛状根转入不定芽诱导培养基，经过14天光照培养后，在愈伤组织上开始出现芽点，随着培养时间延长，芽点陆续分化出芽，芽不断伸长，并长出真叶；

(2)木本曼陀罗不定芽的生根培养，切取从木本曼陀罗毛状根分化出的绿色不定芽，转入生根培养基中，置于25℃±1.0℃恒温培养，15h光照/天，6天后开始长出不定根，逐渐形成完整的再生植株；

(3)木本曼陀罗毛状根的再生植株的分子检测，方法如下：

A、提取木本曼陀罗毛状根再生植株DNA；

B、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

C、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

D、电泳检测目标条带；

(4)木本曼陀罗毛状根再生植株中莨菪碱和东莨菪碱的含量检测；

(5)木本曼陀罗毛状根再生植株的移栽，选取生长健壮的无菌植株，经过室温炼苗后移栽到花盆中，短期驯化后获得生长正常的木本曼陀罗植株。

2.根据权利要求1所述的获产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，其特征在于，所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+4.0mg·L^-16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.5mg·L^-1激动素(KT)+0.5mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。

3.根据权利要求1所述的获产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，其特征在于，所述的不定芽诱导培养基为MS培养基+4.0mg·L^-16-苄基腺嘌呤(6-BA)+0.2mg·L^-1萘乙酸(NAA)+30g·L^-1蔗糖。

4.根据权利要求1所述的获产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，其特征在于，所述的生根培养基为1/2MS培养基+0.1mg·L^-1吲哚-3-丁酸(IBA)+30gL^-1蔗糖。

5.根据权利要求1所述的获产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根再生植株的方法，其特征在于该方法获得高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根的再生植株的基因组中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因。