CN101230349A - 一种获得产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用基因工程技术遗传转化木本曼陀罗，获得生产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗的毛状根的方法。涉及发根农杆菌遗传转化木本曼陀罗的方法，遗传转化获得可生产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根，其过程是用发根农杆菌遗传转化木本曼陀罗，获得了木本曼陀罗毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的木本曼陀罗毛状根能够生产莨菪碱和东莨菪碱。本方法可以为莨菪碱和东莨菪碱的生产提供一种可持续的新型药源。

Description

一种获得产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根的方法

技术领域

本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种利用转基因技术获得产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根的方法，具体涉及发根农杆菌遗传转化木本曼陀罗并获得产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根的具体程序。本发明还提供利用基因工程技术获得的高产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根及其培养的子代。

背景技术

植物次生代谢产物具有十分重要的经济学功能，在工农业生产和人们的日常生活中具有广阔的应用前景，其中在天然药物开发中的地位尤为引人瞩目，然而至今仍没有找到有效的或成熟的合成方法。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长迅速、、合成次生代谢物质能力强且遗传稳定性稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。

目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的毛状根的相关研究较多，但对遗传转化木本曼陀罗获得产莨菪碱和东莨菪碱毛状根的研究仍是空白。木本曼陀罗属于茄科曼陀罗属多年生药用乔木植物。该属植物约16多种，多分布于热带和亚热带地区，温带则较少，我国有4种，南北各省均有分布，野生或栽培。该植物主要药用成分为莨菪碱和东莨菪碱等托品烷类生物碱，现代药理学证实其具有扩瞳、解痉、麻醉、止痛和抑制腺体分泌等作用，且主要作为副交感神经系统的抗胆碱药，临床治疗麻痹症、运动症、肠胃痉挛性绞痛和三叉神经痛等，效果甚好。随着国际上对莨菪碱和东莨菪碱研究的持续升温和认识的逐步深入，认为莨菪碱和东莨菪碱具有重要的药用价值和开发利用前景。然而目前获得木本曼陀罗的主要技术是野生取材和人工栽培，但存在自然繁殖不便、生产周期长、野生资源渐危、农药残留超标和有效成分低等弊端，使得该方式商业前景尚不明朗。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种转基因技术遗传转化木本曼陀罗获得产莨菪碱和东莨菪碱毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入木本曼陀罗中，获得木本曼陀罗毛状根；

本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法转化的宿主细胞，这种经转化的宿主细胞发育为毛状根。在实例中该宿主细胞是木本曼陀罗。

本发明的技术方案如下：

一种获得产莨菪碱和东莨菪碱木本曼陀罗毛状根的方法和利用该方法获得的产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根，该毛状根是一种采用本发明所述方法创造的新生命体。

该方法步骤如下：

(1)采用任何可能的手段获得无菌的木本曼陀罗；

(2)采用任何转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到木本曼陀罗细胞、组织、器官、植株中；

(3)在特定的条件下筛选和鉴定毛状根；

(4)在适合的条件下培养木本曼陀罗毛状根，用于生产莨菪碱和东莨菪碱；

用上述方法获得的生命体，它是可生产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根。

在本发明中，术语“生命体”指木本曼陀罗的细胞、组织、器官、植株。

在本发明中，术语“任何转基因方法”包括发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。

在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指用在离体培养的条件下根据毛状根的特殊形态学特征初步鉴定转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。

在本发明中，术语“在适合的条件下培养木本曼陀罗毛状根”是指对经过鉴定的木本曼陀罗毛状根离体培养，并检测莨菪碱和东莨菪碱的含量，筛选莨菪碱和东莨菪碱含量提高的优良转化子进行培养，获得其后代。

在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入木本曼陀罗细胞获得转化毛状根，通过筛选优良无性系，获得莨菪碱和东莨菪碱及其相关黄酮类化合物含量相对较高而稳定的毛状根无性系，为莨菪碱和东莨菪碱的生产提供一种新型优质的可持续使用的药源。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

木本曼陀罗无菌外植体的获得

方法：利用外植体建立木本曼陀罗无菌外植体

采集木本曼陀罗的当年生幼嫩叶片，0.1％洗衣粉浸泡30分钟，自来水冲洗数次；然后用75％(V/V)乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡9分钟，无菌水冲洗5次；接着用无菌纸吸干表面水分，并将其切成0.5×0.5厘米块状后接种在添加无菌丛生芽诱导培养基中(培养基盛于150mL三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS+6-BA 3.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1，30g·L^-1蔗糖，pH值为5.8，再添加8.5g·L^-1的琼脂粉。在光照培养箱中培养木本曼陀罗的叶片，培养条件为：25℃，12h·d^-1光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1。35天后，即可选择初代培养成功的芽丛切割成单芽，继续转入芽诱导培养基MS+6-BA 3.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1中继代培养，至芽苗长到3～5厘米时，转入1/2MS+IBA 1.0mg·L^-1的生根培养基中诱导生根，20天后即可诱导出不定根，继续培养获得无菌的木本曼陀罗无菌幼苗，待其枝叶着生完全后可用于遗传转化。

实施例2

发根农杆菌遗传转化木本曼陀罗获得毛状根

1、发根农杆菌C58C1。使用前自超低温冰箱取出，接种于50ml YEB液体培养基中(添加利福平终浓度为40mg·L^-1)，28℃，200rpm振荡培养两次，复苏菌体。

2、第二次活化培养结束两小时前加入乙酰丁香酮，使其终浓度达到100μmol·L^-1也即菌液OD₆₀₀达0.3时，加入乙酰丁香酮，继续28℃，200rpm振荡培养，菌液OD₆₀₀达0.5时，可用于转化。

3、室温下4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用等体积MS液体培养基(含100μmol·L^-1乙酰丁香酮)悬浮，在28℃，200rp振荡培养30分钟，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.6左右，成为转化液，此时可用于木本曼陀罗的遗传转化；1、2、3个步骤称为活化发根农杆菌。

4、取无菌木本曼陀罗幼嫩真叶，将其切成1×1cm左右，用无菌解剖针戳一些圆形伤口，放入上述转化液中，浸染10～13分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接种于添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2～3天，培养条件为：25℃，无光照。该步骤称发根农杆菌与木本曼陀罗的共培养。

5、共培养结束后，在无菌吸水纸上吸干外植体上多余水分，转移至无植物生长调节物的MS固体除菌培养基(添加500mg·L^-1头孢菌素以达到除菌的目的)中培养，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。14天后，在木本曼陀罗受伤的部位开始出现毛状根。该步骤称为木本曼陀罗的除菌培养。

6、外植体每隔3天转入新鲜的同样的培养基中，待转化外植体上诱导出的毛状根长到5cm左右时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2MS固体培养基上(添加500mg·L^-1头孢菌素以达到除菌的目的)继代培养；在无植物生长调节物的1/2MS固体培养基上生长的木本曼陀罗毛状根表现出毛状根特有的形态学特征：生长十分迅速、分枝很多、生长失去向地性。以后每15～20天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除杆菌；然后仅在1/2MS固体培养基上继代培养方可。该步骤为木本曼陀罗毛状根的获得与继代培养。

实施例3

木本曼陀罗毛状根的分子检测

1、木本曼陀罗毛状根基因组DNA的提取，方法如下：

(1)取200mg液体培养两周的毛状根，过滤后用10mL蒸馏水洗涤，充分吸干，液氮速冻，研磨成粉。

(2)1.5mL Eppendorf管中，加500μL抽提buffer(3％巯基乙醇)，充分震荡65℃水浴50分钟，每5分钟颠倒混匀。

(3)4℃、12,000rpm，离心10分钟。

(4)吸上清，加500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟钟至分层。

(5)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(6)吸上清约350μL，加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

(7)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(8)吸上清约250μL，加2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，充分混匀，室温放置10分钟见有絮状DNA析出。

(9)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(10)弃上清，沉淀用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置10分钟，使乙醇挥发完全。

(11)加1μL RNAase，50μL TE，混匀，37℃水浴30-40分钟。

(12)加40μL氯仿，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

(13)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(14)吸取上清(约35μL)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。

抽提缓冲液配方如下：

100mM         Tris-HCl(pH8.0)

2.5％         (V/V)巯基乙醇

500mM         NaCl

20mM          EDTA

1.5％(W/V)    SDS

2、木本曼陀罗毛状根中rolB和rolC基因的PCR检测

诱发并维持毛状根形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。基因检测的PCR引物：rolB(423bp)的引物为：frolB(5’-GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT-3’)，rrolB(5’-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3’)；rolC(626bp)的引物为：frolC(5’-TAACAT GGC TGA AGA CGA CC-3’)，rrolC(5’-AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC-3’)。

反应体系均为(25μL)：ddH₂O 18μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL₂ 2.0μL，10mmol·L^-1 dNTP mix 0.25μL，10mmol/L primerl 0.25μL，10mmol/L primer 20.25μL，TaqDNApolymerase 0.25μL(1.25U)，Template基因组DNA 1.5μL。

PCR反应程序：94℃ 5min→35循环(94℃ for 40sec→55℃ for 40sec→72℃ for lmin)→72℃8min。阳性对照为相应的工程菌，木本曼陀罗的天然叶片作为阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolb的扩增条带大小为423bp，rolc为626bp。

实施例4

木本曼陀罗毛状根中莨菪碱和东莨菪碱含量与野生根中的含量比较

1、莨菪碱和东莨菪碱对照品的HPLC标准曲线的制作

分别精密称取2mg莨菪碱和东莨菪碱标准对照品，用甲醇(色谱纯)溶解过滤，配成终浓度为1000μg·mL^-1，分别稀释成500μg·mL^-1、250μg·mL^-1、100μg·mL^-1、50μg·mL^-1、25μg·mL^-1、10μg·mL^-1、5μg·mL^-1。每一浓度进样三次记录图谱及色谱参数，分别以峰面积和进样量(μg·mL^-1)进行线性回归，以进样量为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2、木本曼陀罗中莨菪碱和东莨菪碱含量的测定

将培养30d的单克隆毛状根洗净，用吸水纸吸干水分，称鲜重后60℃干燥24h至恒重，研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎40min，过滤，再提取一次，合并滤液，挥干甲醇提取液，残留物溶于5mL 200m mol·L^-1的NH₄Cl(pH9.8)，过柱(20×1cm)，填充物为4.5g Extrelut-20(Merck)，后用10mL氯仿饱和氨水洗柱，重复三次，洗脱液在40℃下用暖风吹干，残留物溶于1mL HPLC流动相(17％V/V乙腈溶于50mM KH₂PO₄，用磷酸调pH至3.0)，最后用Millipor 0.2μm滤纸过滤，-20℃保存，作为供试样品溶液待用。自然根打粉后，称取30mg，提取方法同上。

HPLC含量测定结果为：木本曼陀罗毛状根中莨菪碱的含量为139.63μg·g^-1DW，是野生药材木本曼陀罗自然根中莨菪碱含量的11倍以及叶片中的6倍；而东莨菪碱含量达到246.92μg·g^-1 DW，是野生药材木本曼陀罗自然根中莨菪碱含量的5.3倍以及叶片中的15倍。可见木本曼陀罗毛状根培养技术是获取莨菪碱和东莨菪碱的高效方法。

Claims (2)

1.一种获得产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗毛状根的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化木本曼陀罗的器官，其步骤如下：

(1)木本曼陀罗无菌外植体的获得；

(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到木本曼陀罗细胞、组织、器官、植株中；其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化；包括以下步骤；

A、活化发根农杆菌；

B、发根农杆菌浸染木本曼陀罗外植体；

C、发根农杆菌与木本曼陀罗外植体的共培养，步骤如下：

I、将侵染后的木本曼陀罗外植体接种在MS+AS 100μmol·L^-1固体培养基上；

II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养48h；

D、外植体的除菌培养；

(3)木本曼陀罗毛状根的获得与继代培养；

(4)木本曼陀罗毛状根的分子检测，方法如下：

A、提取木本曼陀罗毛状根DNA；

B、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

C、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

D、电泳检测目标条带；

(5)木本曼陀罗毛状根中莨菪碱和东莨菪碱的含量检测。

2.用权利要求1所述方法获得产莨菪碱和东莨菪碱的木本曼陀罗的毛状根，其特征在于其基因组中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因。