CN103074364B - 一种番茄遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种番茄遗传转化的方法,属于遗传工程技术领域,具体的说公开了一种番茄种子整体侵染的方法,该方法包括测成熟番茄种子的生理吸胀曲线;含有目标基因的发根农杆菌培养;结合番茄种子的生理吸胀曲线,将消毒灭菌的番茄种子转入到OD600值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时;在25℃黑暗条件下共培养3天;抗性植株的筛选;抗性植株的生根及培育;转化植株炼苗及移栽等步骤。本发明由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染,大大提高了转化效率,经过压力筛选培养基进行筛选,缩短了实验周期2-3个月,简化了实验过程,减少了转化后的鉴定工作量。对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导转化番茄的方法,属于遗传工程技术领域,具体涉及番茄种子整体侵染转化的方法。
背景技术
番茄是一种世界性种植的最重要的鲜食和加工原料。它的基因组较小,是一种理想的模式植物。另外,番茄还具有自花授粉易于纯合、生长周期短、在温室内可周年生长等优点,因而其遗传转化研究备受关注。自从1986年McCormick等首次用农杆菌介导的方法获得转基因番茄植株以来,番茄的遗传转化研究不断发展,但转化效率有很大差异。
影响农杆菌介导番茄遗传转化的因素很多,如番茄基因型、侵染时间、分化培养基等,其中基因型对植物生长调节剂的专一性,使得需要对每个番茄基因型的转化过程分别进行研究,以寻求不同基因型植株最适合的转化方法,即由于再生受基因型限制,从而使转化变得较困难;外植体大小对番茄的再生也有重要影响,理想的外植体大小为叶片0.5 cm2,外植体的放置方向有近轴面向上和背面向上两种方式,但基本原则是使外植体的伤口与培养基有较好的接触,以利于外植体愈伤组织的诱导和芽的分化;基因型、分化培养基都是基于再生体系而形成的限制,从而使番茄的遗传转化变得更困难。
番茄是植物基因工程中进行遗传转化的重要模式植物之一。目前在番茄的遗传转化过程中还存在一些问题,如转化率低,转化体、转化植株后代遗传不稳定,操作复杂等。这些问题阻碍了番茄基因工程的研究。因此,建立高效的番茄遗传转化体系,为植物功能基因研究及基因工程改良提供高效的遗传转化平台,从而促进其产业化发展。农杆菌所携带的目标基因能否成功转入到植物基因组中,对后续实验有着重要影响。在常规的农杆菌介导的植物遗传转化方法中,常选用的外植体为具有分生能力的细胞、幼嫩的组织、子叶及下胚轴等,也采取预培养等使细胞处于感受态的技术,这些都有利于转化率的提高。但目前这些方法转化效率还很低、操作过程也较繁琐,实验周期较长。
发明内容
针对上述不足,本发明的目的在于克服现有番茄遗传转化效率低、转化周期长及操作过程繁琐的难点,提供一种番茄种子整体侵染的方法,从而提高番茄的转效率。
本发明是按以下技术方案实现的:
一种番茄遗传转化的方法,该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的,步骤包括:① 测成熟番茄种子的生理吸胀曲线,② 含有目标基因的发根农杆菌培养,③ 番茄种子消毒灭菌,④ 结合番茄种子的生理吸胀曲线,将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD600值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时,⑤ 在25℃黑暗条件下共培养3天,⑥ 抗性植株的筛选,⑦ 抗性植株的生根及培育,⑧ 转化植株炼苗及移栽等步骤;其中:
步骤 ① 所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是:取8份等量的成熟番茄种子,每隔2小时取1份浸泡到水中,分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时,记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时;
步骤 ② 所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是:将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次,之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有50 ug·ml-1卡那霉素的LB液体培养基中,在温度26oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下,培养5-8小时,然后取1 ml 转接于50 ml 含有50 ug·ml-1卡那霉素和110 umol·L-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中,在温度26oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下,培养12-16小时后,取50 ml菌液加入到离心管中,置于低温冷冻离心机中,在温度25oC、转速3500 rpm条件下离心10 分钟,弃上清液,得菌体沉淀,用含6 mg·L-1 6-BA 和 110 umol·L-1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600值为0.8-1.3备用;
步骤③ 所述番茄种子灭菌的方法是:挑选饱满的番茄种子,蒸馏水浸泡1.5-2小时,Cl2灭菌20分钟,无菌水冲洗5-6次,准备侵染用;
步骤④ 所述结合番茄种子的生理吸胀曲线,侵染番茄种子7-9小时的方法是:结合番茄种子的生理吸胀曲线,将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤② 制备好的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中,农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准,用封口膜封住瓶口,置于摇床中,于26oC,166 rpm条件下振荡培养7-9小时;
步骤⑤ 所述的共培养的方法是:待步骤④ 侵染7-9小时后,从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内,倒掉菌液,加入无菌水冲洗3次后,置于共培养培养基上,25℃黑暗条件下,共培养3天;共培养培养基是指:在MS培养基中加入 6 mg·L-1 6-BA 和 110 umol·L-1 乙酰丁香酮 和 7 g·L-1 琼脂,pH值5.80-5.82;
步骤⑥ 所述抗性植株的筛选其方法是:将经步骤⑤ 共培养的种子,转接到压力筛选培养基上培养1.5-2个月,获得抗性植株。压力筛选培养基是由1/2MS 培养基中加入 0.2 mg·L-1 6-BA 和1 mg·L-1 IBA和 250 mg·L-1 Cef 和50-100 mg·L-1 Kan 组成。
步骤⑦ 所述抗性植株的生根及培育的方法是:将步骤⑥ 筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育,置于光照强度为2000 lx,光照时间为12 day / 8 night 的人工气候箱中培养20-30天,生根培养基是由1/2MS培养基加入 0.4 g·L-1 活性炭组成。
步骤⑧ 所述转化植株炼苗及移栽的方法是:当步骤⑦ 获得的植株根长达到8 cm左右时,置于温室内开盖2-3天,然后用镊子将苗夹出,用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净,移栽到花土中,移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右,且置于有一定光照的阴凉处,不可被阳光直射,2周后,栽入花盆中,在温室培养。
上述方法中使用的LB和MS培养基为常规培养基:
LB液体培养基组成为10 g·L-1 NaCl, 10 g·L-1 蛋白胨和 5 g·L-1 酵母浸膏,pH值7.0;
LB固体培养基是指在LB液体培养基中,再添加15 g·L-1 琼脂;
MS培养基组成为:KNO3 1900 mg·L-1,NH4NO3 1650 mg·L-1,CaCl2·2H2O 440 mg·L-1,MgSO4·7H2O 370 mg·L-1,KH2PO4 170 mg·L-1,H3BO3 6.2 mg·L-1,MnSO4·H2O 16.9 mg·L-1,ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1,KCl 0.83 mg·L-1,Na2MoO4·2H2O 0.25 mg·L-1,CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1,CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1,Na2EDTA 37.3 mg·L-1,FeSO4·7H2O 27.8 mg·L-1,肌醇 20 g·L-1,烟酸 100 mg·L-1,盐酸吡哆醇 100 mg·L-1,盐酸硫胺素 100 mg·L-1,甘氨酸 400 mg·L-1,蔗糖 30 g·L-1,pH值5.80-5.83。
上述方法中各步骤使用的培养基均用蒸馏水按常规方法配制。
上述番茄种子整体侵染的方法中:
步骤 ② 所述农杆菌菌株是含有Gt基因的发根农杆菌(Ageobacterium rhizogenes)A4菌株,该菌株已在ZL200710055462.3公开并使用。在番茄种子整体侵染的方法中,该菌株用于侵染的菌液浓度OD600为0.8-1.3,其中优选1.0。
步骤 ④ 所述的番茄种子吸胀的时间段为0-7/9小时,农杆菌浸泡侵染番茄种子时间优选7小时。
本发明具有以下积极的效果:
1、本发明由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染,大大提高了转化效率,提高了转化植株的获得数量。
2、经过采用含卡那霉素的压力筛选培养基对抗性植株进行筛选,缩短了实验周期2-3个月,简化了实验过程,减少了转化后的鉴定工作量。
3. 本发明的方法操作简单实用,与显微注射法、电击法和其它农杆菌介导的方法相比,具有明显优势和突破性特点,对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。
附图说明
图1是转化的番茄经压力筛选培养基培养后,全部白化,确定为转化未成功的番茄植株,见白化苗。
图2是转化的番茄经压力筛选培养基培养后,有绿色苗存活,初步确定为转化成功的番茄植株,见绿色苗。
图3是转基因番茄经压力筛选后,正常生长,证明转入的外源基因不会对转基因番茄的生长发育有不利影响。
图4是转基因番茄经压力筛选获得的抗性植株,移栽后正常生长。
图5是转基因番茄植株的PCR检测结果图。P-以质粒为阳性对照;CK-以
未转基因的番茄植株为阴性对照;1-以转基因番茄植株为样品;结果
表明获得了1892 bp的目标PCR扩增产物。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步说明:
一、培养基的配制和灭菌
1、 LB液体培养基的配制:分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨和5 g 酵母浸膏放入到1 L三角瓶中,加入蒸馏水定容到1 L,溶解,调pH值到7.0,用封口膜封口,之后采用121oC高压湿热灭菌20分钟,冷却后放在4oC冰箱中,备用;
2、LB固体培养基的配制:分别称量10 g NaCl、10 g 蛋白胨、5 g 酵母浸膏和15 g 琼脂放入到1 L三角瓶中,加入蒸馏水定容到1 L,溶解,调pH值到7.0,用封口膜封口,之后采用121oC高压湿热灭菌20分钟,倒入无菌培养皿中,冷却后放在4 oC冰箱中,备用;
3、 MS培养基的配制:
(1)、MS培养基母液的配制
1)、大量元素母液的配制:
①、KNO3母液的配制:称取190g KNO3放入到1000 ml 的烧杯中,用800 ml 蒸馏水使之完全溶解,加蒸馏水定容至1000 ml,转移至广口瓶中,室温保存;较使用浓度该母液浓缩倍数为100倍。
②、NH4NO3母液的配制:称取330g NH4NO3放入到1000 ml 的烧杯中,用800 ml 蒸馏水使之完全溶解,加蒸馏水定容至1000 ml,转移至广口瓶中,室温保存;较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
③、MgSO4·7H2O母液的配制:称取74g MgSO4·7H2O放入到1000 ml 的烧杯中,用800 ml 蒸馏水使之完全溶解,加蒸馏水定容至1000 ml ,转移至广口瓶中,室温保存;较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
④、KH2PO4母液的配制:称取34g KH2PO4放入到1000 ml 的烧杯中,用800 ml 蒸馏水使之完全溶解,加蒸馏水定容至1000 ml ,转移至广口瓶中,室温保存;较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
⑤、CaCl2·2H2O母液的配制:称取88g CaCl2·2H2O放入到1000 ml 的烧杯中,用800 ml 蒸馏水使之完全溶解,加蒸馏水定容至1000 ml,转移至广口瓶中,室温保存;较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
2)、微量元素母液的配制:分别称取6.2 g H3BO3,16.9 g MnSO4·H2O,8.6 g ZnSO4·7H2O,0.83 g KCl,0.25 g Na2MoO4·2H2O,0.025 g CuSO4·5H2O,0.025 g CoCl2·6H2O放入到1000 ml 的烧杯中,用800 ml 蒸馏水使之完全溶解,加蒸馏水定容至1000 ml ,转移至广口瓶中,室温保存;较使用浓度该母液浓缩倍数为1000倍。
3)、铁盐母液的配制:分别称取18.65 g Na2-EDTA和13.9 g FeSO4·7H2O,分别放入2个500 ml 烧杯中,分别加入200 ml 蒸馏水,加热并不断搅拌,使之完全溶解;冷却,将2种溶液混合,调pH至5.5,加蒸馏水定容至500 ml ,转移至棕色瓶中,在4oC冰箱中保存;较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为500倍。
4)、B5有机母液的配制:分别称取10 g 肌醇,0.05 g 烟酸,0.05 g 盐酸吡哆醇、0.05 g 盐酸硫胺素和0.2 g 甘氨酸,放入到500 ml 的烧杯中,用300 mL蒸馏水使之完全溶解,加蒸馏水定容至500 ml,高压灭菌,转移至无菌棕色瓶中,在4oC冰箱中保存;较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为200倍。
(2)、MS培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:10 ml KNO3、5 ml NH4NO3、5 ml MgSO4·7H2O、5 ml KH2PO4、5 ml CaCl2·2H2O、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5有机,加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中,加入30 g 蔗糖,加入蒸馏水定容到1 L,充分溶解,调pH值到5.80-5.83,用封口膜封口,然后采用121oC高压湿热灭菌20分钟;
4、共培养培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:10 ml KNO3、5 ml NH4NO3、5 ml MgSO4·7H2O、5 ml KH2PO4、5 ml CaCl2·2H2O、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5有机,加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中,加入30 g 蔗糖、7 g 琼脂,加入蒸馏水定容到1 L,充分溶解,调pH值到5.80-5.82,用封口膜封口,然后采用121oC高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出,冷却10分钟后加入 6 ml 浓度为1mg·mL-1 的无菌6-BA,11 ml 浓度为10 mmol·L-1 的无菌乙酰丁香酮,充分混匀,倒入无菌培养皿中,冷却后放在4oC冰箱中,备用;
5、 压力筛选培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:5 ml KNO3、2.5 ml NH4NO3、2.5 ml MgSO4·7H2O、2.5 ml KH2PO4、2.5 ml CaCl2·2H2O、0.5 ml微量元素、1 ml 铁盐、2.5 ml B5有机,加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中,加入15 g 蔗糖、7 g 琼脂,加入蒸馏水定容到1 L,充分溶解,调pH值到5.80-5.82,用封口膜封口,然后采用121oC高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出,冷却10分钟后分别加入 6 ml 浓度为1 mg·mL-1 的无菌 6-BA,1 ml 浓度为 1 mg·mL-1 的无菌 IBA,1 ml 浓度为250 mg·mL-1 的无菌 Cef和 1.5 ml 浓度为50 mg·mL-1 的无菌 Kan,充分混匀,倒入无菌培养皿中,冷却后放在4 oC冰箱中,备用;
6、生根培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:5 ml KNO3、2.5 ml NH4NO3、2.5 ml MgSO4·7H2O、2.5 ml KH2PO4、2.5 ml CaCl2·2H2O、0.5 ml微量元素、1 ml 铁盐、2.5 ml B5有机,加入到盛有800 ml 蒸馏水的1000 ml 三角瓶中,加入15 g 蔗糖、6.5 g 琼脂,0.4 g活性炭,加入蒸馏水定容到1 L,充分溶解,调pH值到5.80-5.83,用封口膜封口,然后采用121oC高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出,充分混匀,倒入无菌培养皿中,冷却后放在4oC冰箱中,备用;
二、番茄种子整体侵染转化法
1、测成熟番茄种子的生理吸胀曲线
植物材料为番茄种子,取8份等量的成熟番茄种子,每隔2小时取1份(200粒)浸泡到水中,分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时,记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时;
2、含有目标基因的发根农杆菌的培养
挑选含有Gt基因的发根农杆菌A4菌株,接种于LB固体培养基平板上活化2次,之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml 含有 20 ug·ml-1 利福平、50 ug·ml-1 卡那霉素和10 ug·ml-1 四环素的LB液体培养基中,在温度26oC、振荡转速166 rpm 的条件下,培养5小时,然后取1 ml 转接于50 ml 含有20 ug·ml-1 利福平、50 ug·ml-1 卡那霉素、10 ug·ml-1 四环素和110 umol·L-1 乙酰丁香酮的LB液体培养基中,在温度26oC、振荡转速160-200 rpm 的条件下,培养12小时后,取50 ml菌液加入到离心管中,置于低温冷冻离心机中,在温度25oC、转速3500 rpm条件下离心10 min,弃上清液,用含6mg·L-1 6-BA 和 110 umol·L-1 乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600=1.0备用;
3、番茄种子灭菌
挑选饱满的番茄种子,蒸馏水浸泡1.5-2小时,用Cl2(NaClO:浓HCl=25ml:1ml)灭菌20分钟,无菌水冲洗5-6次,准备侵染用;
4、结合番茄种子的生理吸胀曲线,将经上述消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD600值为1.0的发根农杆菌菌液中,农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准,用封口膜封住瓶口,置于摇床内控制温度26oC,转速166 rpm培养7小时;
5、共培养:上述番茄种子浸泡侵染7小时后,从摇床中取出置于超净工作台内,倒掉菌液,加入无菌水冲洗3次后,置于共培养培养基上,25℃黑暗条件下,共培养3天;
6、抗性植株的筛选:共培养3天后,取萌发的种子转接到压力筛选培养基上培养2个月,获得无抗性的植株(见附图说明图1)和抗性植株(见附图说明图2);
7、抗性植株的生根及培育: 筛选之后成活的抗性植株长到2-3 cm时,将其移入生根培养基上进行生根及培育,置于光照强度为2000 lx,光照时间为12天day / 8 night 的人工气候箱中培养20天,抗性植株正常生长(见附图说明图3);
8、转化植株炼苗及移栽:当抗性植株的根长达8 cm左右时于温室内开盖3天,然后用镊子将苗夹出,用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净,移栽到花土中,移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右,且置于有一定光照的阴凉处,不可被阳光直射,2周后,栽入花盆中,在温室培养,移栽后的抗性植株正常生长(见附图说明图4);
9、转基因植株的分子检测: 抗性植株移栽后,取其新鲜幼嫩叶片,用CTAB法从叶片中提取其基因组DNA,并以其为模板,以5’-GAAGATCTATGGTGGGCAGAGGCAAAGGC-3’和5’-TTGGTCACCCTAATTAATAGTAGTTGTGC-3’为引物,扩增转化植株中的Gt基因。PCR反应条件为:94oC预变性1 min,94oC变性30 sec,65oC复性10 min,72oC 延伸1min,共计35个循环,最后再72oC延伸10 min。对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,PCR检测情况如见附图说明图5 所示。其中,M为DNA分子量标准,P-为阳性质粒对照的PCR扩增结果,1为转Gt基因番茄的PCR扩增结果,CK-为阴性对照番茄原种的PCR扩增结果。结果表明获得了1892 bp的PCR扩增产物。
Claims (3)
1.一种番茄遗传转化的方法,该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的,其特征在于:步骤包括:
①测成熟番茄种子的生理吸胀曲线:取8份等量的成熟番茄种子,每隔2小时取1份浸泡到水中,分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时,记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时;
②含有目标基因的发根农杆菌培养:将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次,挑取该菌株的单菌落接种到5ml含有50μg·ml-1卡那霉素的LB液体培养基中,在温度26℃、振荡转速160-200rpm的条件下,培养5-8小时,然后取1ml转接于50ml含有50μg·ml-1卡那霉素和110μmol·L-1乙酰丁香酮的LB液体培养基中,在温度26℃、振荡转速160-200rpm的条件下,培养12-16小时后,取50ml菌液加入到离心管中,置于低温冷冻离心机中,在温度25℃、转速3500rpm条件下离心10分钟,弃上清液,得菌体沉淀,用含6mg·L-16-BA和110μmol·L-1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至OD600值为0.8-1.3备用;
③番茄种子的消毒灭菌:挑选饱满的番茄种子,蒸馏水浸泡1.5-2小时,Cl2灭菌20分钟,无菌水冲洗5-6次,准备侵染用;
④结合番茄种子的生理吸胀曲线,将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD600值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时:结合番茄种子的生理吸胀曲线,将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤②制备的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中,农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准,用封口膜封住瓶口,置于摇床中,于26℃,166rpm条件下振荡培养7-9小时;
⑤在25℃黑暗条件下共培养3天:待步骤④侵染7-9小时后,从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内,倒掉菌液,加入无菌水冲洗3次后,置于共培养培养基上,25℃黑暗条件下,共培养3天;共培养的培养基是指:在MS培养基中加入6mg·L-16-BA和110μmol·L-1乙酰丁香酮和7g·L-1琼脂,pH值5.80-5.82;
⑥抗性植株的筛选:将经步骤⑤共培养的种子,转接到压力筛选培养基上培养1.5-2个月,获得抗性植株;压力筛选培养基是由1/2MS培养基中加入0.2mg·L-16-BA和1mg·L-1IBA和250mg·L-1Cef和50-100mg·L-1Kan组成;
⑦抗性植株的生根及培育:将步骤⑥筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育,置于光照强度为2000lx,光照时间为12day/8night的人工气候箱中培养20-30天;生根培养基是由1/2MS培养基加入0.4g·L-1活性炭组成;
⑧转化植株炼苗及移栽:当步骤⑦获得的植株根长达到8cm左右时,置于温室内开盖2-3天,然后用镊子将苗夹出,用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净,移栽到花土中,移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右,且置于有一定光照的阴凉处,不可被阳光直射,2周后,栽入花盆中,在温室培养。
2.如权利要求1所述番茄遗传转化的方法,其特征在于:步骤②所述含有目标基因的发根农杆菌是含有Gt基因的发根农杆菌A4菌株。
3.如权利要求1所述的番茄遗传转化的方法,其特征在于:步骤②制备的用于侵染番茄种子的农杆菌菌液浓度OD600值为1.0。
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Citations (4)
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卡那霉素筛选转基因小麦种子关键技术研究;张艳敏等;《河北农业科学》;20060330;第10卷(第01期);摘要 * |
张艳敏等.卡那霉素筛选转基因小麦种子关键技术研究.《河北农业科学》.2006,第10卷(第01期),摘要. * |
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