CN101121942A - 一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)介导的玉米遗传转化的新方法。主要是通过发根农杆菌侵染玉米愈伤组织诱导产生毛状根(hairy root)，毛状根经分化培养再生转基因植株。以Ri质粒为载体，将一个或多个外源基因导入受体基因组中。本发明具有毛状根转化率高达78％；毛状根高频分化再生植株55％；再生植株移栽成活率高达92％；目标克隆的筛选方便，有利于遗传操作，具有实用性。并且，进行外源基因遗传转化的同时，由于Ri质粒的rol基因作用，植株表现根系发达，抗旱性强的特点。可应用于生产玉米转基因抗旱植株。

Description

一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法。

背景技术

目前，在国际国内关于玉米遗传转化技术的方法主要有：基因枪介导法、根癌农杆菌介导法、PEG介导法、花粉管通道法、子房注射法、超声波法、阳离子转化法等。基因枪介导法和根癌农杆菌介导法为最常规方法广泛采用。其不足是：基因枪介导法不仅价格比较高，而且在基因整合的过程中经常发生重排和高拷贝插入现象，外源基因在后代的遗传稳定性较差，很难筛选出抗性较强的品系，且容易导致外源基因的失活；根癌农杆菌介导法外源基因插入的完整性好，但转化率极低，外源基因表达易失活，筛选转化体较难，必须使用标记基因Npt II、Hpt和Bar等，工作量大，同时，愈伤组织的高频分化以及再生植株的移栽成活率低依然是困扰人们的难题。

本发明采用发根农杆菌(Ri)介导法遗传转化玉米较比根癌农杆菌(Ti)介导的遗传转化的优点体现在：(i)Ri质粒可以不经“解除武装(disarm)”进行转化，并且转化产生的毛状根能够再生植株；(ii)毛状根是一个单细胞克隆，可以避免嵌合体，并且毛状根每一个细胞都是通过转化而来的有利于遗传操作；(iii)可直接作为中间载体；(iv)Ri质粒和Ti质粒可以配合使用，建立双元载体。拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围；(v)毛状根适于进行离体培养，而且很多植物的毛状根在离体培养条件下都表现出原植株所有的特征；(vi)产生的再生植株产生稳定的可遗传的变异，在利用Ti质粒转化时，由于T-DNA插入植物基因组是随机的，因而可能产生具有不同基因型的重组细胞。而毛状根是单细胞起源的，这就为目标克隆的筛选以及新的有益变异的发现提供了方便。对于抗性育种具有十分重要的意义。同时，由于毛状根在培养过程中高频分化，极易再生植株。又由于获得的再生植株根系发达移栽成活率高，因此更具有实用性和可操作性。

发明内容

本发明的目的是建立一种高效、稳定、简便的利用发根农杆菌介导玉米遗传转化方法。通过外源基因和Ri质粒rol基因的表达，实现转基因植株基因转移和抗旱的双重目的。解决玉米转基因工程育种中已有技术存在的外源基因转化率低、筛选转化体难、后代遗传稳定性差、易失活、移栽成活率低等关键技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

发根农杆菌侵染玉米愈伤组织诱导产生毛状根，毛状根经分化培养再生转基因植株；以Ri质粒为载体，将一个或多个外源基因导入受体基因组中。所使用的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌系为：ATCC15834或Ri1000或Ri1601或A₄，来源于法国园艺研究中心。

本发明方法包括以下具体步骤：

Ri质粒的转化载体构建，将外源基因导入T-DNA，中间载体采用pBI121，并带有nos-pro，nos-ter(T-DNA限制性内切酶片断)及npt-II基因；把外源基因插入T-DNA的35S启动子和终止子之间构建中间载体；将中间载体导入发根农杆菌，通过诱导菌株的协助质粒E.coli HB101(pRK2013)、携带中间载体pBI121-外源基因的大肠杆菌和发根农杆菌直接进行三亲杂交，再通过同源重组把中间载体整合到Ri质粒的T-DNA中。通过酶切和测序进行检测(参考文献如王关林，方宏筠主编.植物基因工程.北京：科学出版社，2002.SHI Bu-Jun等1997J.Gen.Virology：1181～1185)。将携带有中间载体pBI121的发根农杆菌振荡培养当A₆₀₀为1.2时用于侵染玉米愈伤组织诱导毛状根，将产生的毛状根分化培养再生植株。

具体操作如下：

1、将pBI121质粒导入发根农杆菌：

a、质粒pBI121的制备：

试剂：STE(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH 8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后4℃储存)；溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)；溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS(新鲜配制)；溶液III(5mol/L KAc 60mi)冰乙酸11.5ml，dH₂O 28.5ml(pH4.8))。

操作：从LB平板上挑取单菌落，接种于5ml附加相应抗生素的LB液体培养基中，37℃条件下250r/min振荡培养过夜(至对数生长后期)。取1.2～1.5ml菌液菌液移至2ml无菌Eppendorf管中，12000r/min离心30s，弃去上清液。加入1ml STE溶液，涡旋振荡重悬菌体。12000r/min离心30s，弃去上清液。向离心管中内加入100μl冰冷的溶液I，旋涡振荡悬浮菌体。加入200μl新配制的溶液II，迅速盖严离心管盖，快速颠倒离心管5次，

室温放置5min。向离心管中加入150μl溶液III，颠倒离心管10次，置冰水浴中5～10min，12000r/min离心10min。将上清液转入1.5ml无菌Eppendorf管中，加入1/10体积RNase，37℃保温1h至过夜。分别用1倍体积的Tris平衡酚、酚/氯仿、氯仿各抽提1次，每次抽提后均于12000r/min离心5min，仔细吸取上层水相。将氯仿抽提后的上层水相转入无菌Eppendorf管中，加入1倍体积的水饱和乙醚，颠倒混匀，12000r/min离心5min。取下层水相，转入无菌Eppendorf管中，打开离心管盖，置68℃水浴中5min，以除去残留的乙醚。冷至室温，加入2倍体积无水乙醇，-20℃放置备用。

b、大肠杆菌感受态细胞制备：将单菌落接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养。次日按1％(v/v)的量转入新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至A₆₀₀＝0.3。将50～100ml的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，4℃下3500r/min离心10min。去上清液。离心管中各加入10ml冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30min。4℃、3500r/min离心10min。去上清液，将菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液中，即为感受态细胞。

c、引物设计：根据目的基因序列设计正向和反向引物。为了便于外源基因与pBI121质粒35S启动子下游的多克隆位点相连接，在PCR引物5′端引入XbaI酶切位点、3′端引入BamHI酶切位点。

d、目的片断及质粒载体的酶切连接：在A、B两个Eppendorf管中分别依次加入以下试剂：A管中(ddH₂O 11μl，10×Buffer 2μl，目的片断(1μg/μl)5μl，限制酶XbaI 1μl，限制酶BamHI 1μl)；B管中(ddH₂O 15μl，10×Buffer 2μl，载体DNA(1μgg/μl)1μl，限制酶XbaI 1μl，限制酶BamHI 1μl)，混匀，瞬时离心。37℃保温3h。65℃保温10min，灭活限制酶。加入适量的加样缓冲液，混匀，离心5s，加样电泳用DNA试剂盒分别回收DNA。在1.5ml Eppendorf管中加入以下试剂(ddH₂O 12μl，目的片断(0.1μg/μl)4μl，载体DNA(0.1μg/μl)1μl，10×连接酶缓冲液2μl，T4DNA连接酶(1U/μl)1μl)混匀，瞬时离心。14℃连接4～6h，即得目的片段连接液。

e、目的基因的PCR检测：

PCR反应总体系为          50ul

Taq Mix(购自宝生物)      25ul

引物I                    2(20pmol)ul

引物II                   2(20pmol)ul

模板                     5(100ng)ul

去离子无菌水             16ul

在PCR仪(UNOII，Biometra)中进行反应，反应程序为95℃，5min；然后进行29个循环，每个循环包括95℃，60s；57℃，40s；72℃，90s；72℃延长10min。反应完毕取4μl反应产物上样于1.0％琼脂糖凝胶电泳。

f、转化与克隆筛选：用无菌吸头取100μl感受态细胞置于1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10～1000ng(d)步骤得到的连接液，轻轻混匀，立即置于冰上30min。将管置于42℃恒温水浴热激90s，立即放回冰上15min，加入800μl无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预表达培养45～60min。用无菌吸头取200μl菌液移至附加相应选择抗生素的LB平板上，涂布均匀，于37℃培养12～16h，挑选单菌落(含重组质粒)进行扩增，并进一步重组子鉴定。

g、三亲杂交法将带有目的基因的重组质粒pBI121转入发根农杆菌：接种受体发根农杆菌(Rif^r)在含有100μg/ml利福霉素的MG/L固体培养基上，28℃培养，等单菌落长出后，挑选一个单菌落接种在液体培养基中，28℃振荡培养。接种含有“协助”质粒(如pRK2013)的大肠杆菌在固体LB培养基上，37℃培养，等菌落长出后，挑选一个单菌落接种在液体培养基中，37℃振荡培养。挑选(f)步骤的带有中间载体pBI121(Rif+Km)的大肠杆菌的单菌落在含有50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中37℃振荡培养。三种菌生长到A₆₀₀为0.5左右时，等体积混匀，涂布于不含任何抗生素的YEP固体培养基上，28℃过夜培养。用接种针将长出的菌落转接到含有100μg/ml利福霉素和50μg/ml的卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃培养3～4天，长出单菌落。将长出的单菌落再次转接到含有100μg/ml利福霉素和50μg/ml卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃过夜培养。

2、发根农杆菌的培养：将步骤(g)的发根农杆菌单菌落按1％的量接种于50ml含浓度为30～50mg/L利福霉素和浓度为40～50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，25～28℃、4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后的农杆菌当A₆₀₀值达到1.2时用于感染外植体。

3、玉米愈伤组织诱导：取授粉10～15d玉米果穗，用70％酒精喷洒苞叶，去掉苞叶和花丝，用解剖刀削去种子的上端，取出幼胚，盾片向上接种在诱导培养基MS+2，4-D1.5～2mg/L+6-BA0.2mg/L+LH500mg/L+Pro700mg/L+3％蔗糖，pH 5.8上，在26℃培养箱内暗培养。幼胚接种10d后开始膨大，并出现胚性愈伤组织。愈伤组织在MS+2，4-D 0.75mg/L+0.2mg/L 6-BA+500mg/L LH+700mg/L Pro+3％蔗糖，pH 5.8继代。

4、玉米愈伤组织的遗传转化及植株再生：将II型玉米愈伤组织浸入A₆₀₀值为0.2～1.5的发根农杆菌菌液中侵染30min：取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+ZT 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+20～100mol/L乙酰丁香酮培养基上，黑暗中共培养3d，直至外质体出现菌斑后移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素300～500mg/L的培养基于25℃散射弱光照除菌培养诱导发根，每5天转一次培养基。大约经过7～14天，玉米愈伤组织开始出现毛状根。把感染后玉米愈伤组织外植体上长出的毛状根剪下移到新的含抗生素的培养基上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素和任何激素的MS培养基上培养。将毛状根段接种于MS+ZT 1.6mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L上，形成愈伤组织并一次成苗。再生植株在含MS+ZT 1.0mg/l+NAA0.2～0.4mg/l的MS培养基保存和繁殖。将再生的植株移栽到壮苗培养基(1/2MS+0.5％活性炭+3％蔗糖十多效唑2mg/L+0.8％琼脂)上，(25土1)℃，20001x光强，每天光照14h条件下培养。壮苗后移栽到蛭石∶炭为1∶3的基质中，12天后移栽到大田。

本发明步骤1、2所述的LB液体培养基为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，10g/L NaCl，调pH值至7.2后高压灭菌。LB固体培养基在上述的基础上加15g/L琼脂糖。YEP培养基为：10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L牛肉浸膏，15g/L琼脂糖，调pH值至7.0后高压灭菌。MG/L固体培养基为：5g/L蛋白胨，2.5g/L酵母浸膏，0.1g/L MgSO₄·7H₂O，5.1g/L NaCl，0.25g/L KH₂PO₄，5g/L甘露醇，1.16g/L谷氨酸钠，0.001g/L生物素，15g/L琼脂糖，调pH值至7.0后高压灭菌。

本发明步骤3所述的MS培养基为：50ml MS大量元素(20*)，5ml MS微量元素(200*)，5ml Fe盐(200*)，10ml V维生素(100*)(V_B11000mg，V_B6100mg，烟酸100mg，甘氨酸200mg，肌醇10g，生物素5mg。定容至1000ml，配成母液)，0.2g酪素，0.2g天冬素，0.5mg氨基苯甲酸，0.25mg核黄素。叶酸50mg用少量NaOH溶解，定容至100ml，每升培养基取1ml(0.5mg/ml)。6.5g/L琼脂，pH 5.8～6.0。

需要说明的是，本发明所述的发根农杆菌选择与培养、侵染进行遗传转化、PCR的检测方法均为分子生物学中的常用方法，其参考文献如下：

1、外植体的选择、发根农杆菌选择与培养、侵染进行遗传转化方法：

Xu Hongwei，Zhou Xiaofu，et al.2006，Science in China：SeriesC Life Sciences 49(4)：305-310.

2、PCR的方法：

Sambrook J，et al.1989，Molecular cloning：Alaboratory manual

本发明采用发根农杆菌(Ri)介导法遗传转化玉米较比根癌农杆菌(Ti)介导的遗传转化的优点体现在：(i)Ri质粒可以不经“解除武装(disarm)”进行转化，并且转化产生的毛状根能够再生植株；(ii)毛状根是一个单细胞克隆，可以避免嵌合体，并且毛状根每一个细胞都是通过转化而来的有利于遗传操作；(iii)可直接作为中间载体；(iv)Ri质粒和Ti质粒可以配合使用，建立双元载体。拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围；(v)毛状根适于进行离体培养，而且很多植物的毛状根在离体培养条件下都表现出原植株所有的特征；(vi)产生的再生植株产生稳定的可遗传的变异，在利用Ti质粒转化时，由于T-DNA插入植物基因组是随机的，因而可能产生具有不同基因型的重组细胞。而毛状根是单细胞起源的，这就为目标克隆的筛选以及新的有益变异的发现提供了方便。对于抗性育种具有十分重要的意义。同时，由于毛状根在培养过程中高频分化，极易再生植株。又由于获得的再生植株根系发达移栽成活率高，因此更具有实用性和可操作性。

附图说明

图1是愈伤组织侵染转化产生的毛状根示意图。

图2是玉米毛状根形成愈伤组织分化的绿色芽点示意图。

图3是毛状根愈伤组织分化的转基因再生苗形成的发达的根系示意图。

图4是毛状根及毛状根再生植株的m-gfp5-ER基因PCR检测图

图5是pBI121图谱

具体实施方式

实施例

1.转化与克隆筛选：本发明以绿色荧光蛋白为外源基因，pBINm-gfp5-ER购自Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)编号CS9342。用无菌吸头取100μl感受态细胞置于1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10～1000ng pBIN m-gfp5-ER，轻轻混匀，立即置于冰上30min。将管置于42℃恒温水浴热激90s，立即放回冰上15min，加入800μl无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预表达培养45～60min。用无菌吸头取200μl菌液移至附加相应选择抗生素的LB平板上，涂布均匀，于37℃培养12～16h，挑选单菌落进行扩增。

2.三亲杂交法：将pBIN m-gfp5-ER转入发根农杆菌ATCC15834，接种受体发根农杆菌(Rif^r)在含有100μg/ml利福霉素的MG/L固体培养基上，28℃培养，等单菌落长出后，挑选一个单菌落接种在液体培养基中，28℃振荡培养。接种含有“协助”质粒(如pRK2013)的大肠杆菌在固体LB培养基上，37℃培养，等菌落长出后，挑选一个单菌落接种在液体培养基中，37℃振荡培养。挑选步骤1的的大肠杆菌(Rif+Km^r)的单菌落在含有50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中37℃振荡培养。三种菌生长到A₆₀₀为0.5左右时，等体积混匀，涂布于不含任何抗生素的YEP固体培养基上，28℃过夜培养。用接种针将长出的菌落转接到含有100μg/ml利福霉素和50μg/ml的卡那霉素的固体YEP培养基上，28℃培养3～4天，长出单菌落。将长出的单菌落再次转接到含有100μg/ml利福霉素和50μg/ml卡那霉素的YEP固体培养基上，28℃过夜培养。

3.发根农杆菌的培养：将步骤2的发根农杆菌单菌落按1％的量接种于50ml含浓度为30～50mg/L利福霉素和浓度为40～50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，25～28℃、4000r/min黑暗下摇床震荡培养，继代3次后的农杆菌当A₆₀₀值达到1.2时用于感染外植体。

4.玉米愈伤组织诱导：取授粉10～15d玉米果穗，用70％酒精喷洒苞叶，去掉苞叶和花丝，用解剖刀削去种子的上端，取出幼胚，盾片向上接种在诱导培养基MS+2，4-D1.5～2mg/L+6-BA 0.2mg/L+LH 500mg/L+Pro700mg/L+3％蔗糖，pH 5.8上，在26℃培养箱内暗培养。幼胚接种10d后开始膨大，并出现胚性愈伤组织。愈伤组织在MS+2，4-D 0.75mg/L+0.2mg/L6-BA+500mg/L LH+700mg/L Pro+3％蔗糖，pH 5.8继代。

5.发根农杆菌遗传转化玉米愈伤组织诱导毛状根：选取处于活跃分裂增殖状态的、结构疏松、呈小细胞团状、色泽淡黄、大小均匀的II型胚性愈伤组织为外植体。将玉米愈伤组织浸入A₆₀₀值为0.2～1.5的发根农杆菌菌液中侵染30min，取出用无菌滤纸吸干多余的菌液，置于MS+ZT 0.3mg/L+NAA 0.3mg/L+20～100mol/L乙酰丁香酮培养基上，黑暗中共培养3d，直至外质体出现菌斑后移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素300～500mg/L的培养基于25℃散射弱光照除菌培养诱导发根，每5天转一次培养基。大约经过7～14天，玉米愈伤组织开始出现毛状根，如图1所示。

6.毛状根的除菌及卡那霉素筛选：把感染后玉米愈伤组织外植体上长出的毛状根剪下移到新的含抗生素的1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素300～500mg/L培养基上，每周转接1次，直至除菌完成后，移到不含抗生素和任何激素的1/2MS培养基上培养。毛状根诱导率在78％左右。

7.毛状根再生植株培养及移栽：将毛状根段接种于MS+ZT 1.6mg/L+NAA 0.2～0.4mg/L+LH 500mg/L+Pro 700mg/L+3％蔗糖培养基上，形成愈伤组织并一次成苗(分化率达55％)，如图2、3所示。再生植株在含MS+ZT 1.0mg/l+NAA 0.2～0.4mg/l+LH 500mg/L+Pro 700mg/L+3％蔗糖的培养基保存和繁殖。将再生植株移栽到壮苗培养基(1/2MS+0.5％活性炭+3％蔗糖十多效唑2mg/L+0.8％琼脂)上，(25土1)℃，20001x光强，每天光照14h条件下培养3～5天。壮苗后移栽到蛭石∶炭为1∶3的基质中，12天后移栽到大田(成活率达92％)。

8.总DNA提取：参照德国马普国家科学院植物生长发育与表达调控实验室的方法：(i)取2g左右新鲜嫩叶片或毛状根，放于研钵中，用液氮研磨。少量提取时，取一片叶子放入EP管中，到入液氮研磨；(ii)将研磨后的粉末放入预冷的50ml的离心管中；(iii)用15ml的2×CTAB溶解粉末，然后于水浴锅中65℃ 30min；(iv)加入15ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，涡旋振荡至形成乳浊液，静止分层；(v)5000G室温离心15min；(vi)将上清液转入新的离心管中，加入2μl的RNA酶(10mg/ml)，37℃放置1小时；(vii)重复氯仿∶异戊醇抽提一次，离心，将上清液转入无菌离心管；(viii)加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒离心管数次，离心，将沉淀(基因组DNA)挑到1.5ml的管中；(ix)用70％的乙醇洗涤沉淀两次，空气中干燥，然后向每管中加入200μl(根据所提取的DNA量和所需的DNA浓度酌情决定)ddH₂O溶解沉淀。

9.m-gfp5-ER及rolC基因的PCR检测：具体步骤按照宝生物试剂盒说明操作，在PCR仪(UNOII，Biometra)中进行反应，m-gfp5-ER的PCR引物：5′-GC-TCTAGA-AAACATGATGAGCTTTAAAGACTC-3′

5′-CG-GGATCC-CTTCATTGTTTGATCACCTTGCATCC-3′

Rol C基因的PCR引物：

5`-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3`

5`-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3`

反应程序为95℃，5min；然后进行29个循环，每个循环包括95℃，60s；57℃，40s；72℃，90s；72℃延长10min。反应完毕取4μl反应产物上样于1.0％琼脂糖凝胶电泳，如图4所示(图4中M：1kb DNA molecular markers(Gibco-BRL)；p为m-gfp5-ER阳性对照；1为玉米种子苗阴性对照；2、3、4为转基因毛状根再生植株样品；5、6、7为Ri质粒转化玉米愈伤组织诱导的毛状根样品)。

实施例中涉及的缩写术语、培养基：

1.外植体——玉米愈伤组织。

2.发根农杆菌菌种——Ri1000，Ri1601，ATCC15834，A4，LBA9402由法国园艺研究中心(Tepter博士惠赠)。

3.植物基本培养基：MS(Murashige and Skoog，1962)

4.抗生素：卡那霉素Km(Kanamycin)、头孢霉素Cef(cephamycin)

5.激素：2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、NAA(Naphthaleneacetic acid)、BA(benzyladenine)、ZT

6.(trans-Zeatin)

7.其他试剂：乙酰丁香酮AS(3，5-mcthoxy-4-hydroxyacetophenone)、脯氨酸Pro(proline)。

Claims (9)

1.一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导玉米遗传转化，具体是用发根农杆菌侵染玉米愈伤组织诱导产生毛状根(hairyroot)，毛状根经分化培养再生转基因植株；以Ri质粒为载体，将一个或多个外源基因导入受体基因组中。

2.如权利要求1所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：该方法的步骤为：

a、Ri质粒的转化载体构建，将外源基因导入T-DNA，中间载体采用pBI121，并带有nos-pro，nos-ter(T-DNA限制性内切酶片断)及npt-II基因；把外源基因插入T-DNA的35S启动子和终止子之间构建中间载体；将中间载体导入发根农杆菌，通过诱导菌株的协助质粒E.coli HB101(pRK 2013)、携带中间载体pBI121-外源基因的大肠杆菌和发根农杆菌直接进行三亲杂交，再通过同源重组把中间载体整合到Ri质粒的T-DNA中，通过酶切和测序进行检测；

b、将携带有中间载体pBI121的发根农杆菌振荡培养当A₆₀₀为1.2时用于侵染玉米愈伤组织诱导毛状根，将产生的毛状根分化培养再生植株。

3.如权利要求1所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：所述的发根农杆菌菌系为ATCC15834或Ri1000或Ri1601或A₄。

4.如权利要求1所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：所述愈伤组织为所有玉米基因型的愈伤组织。

5.如权利要求4所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：所述的愈伤组织为具有胚性的II型愈伤组织。

6.如权利要求1所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：所述的发根农杆菌与愈伤组织共培养，在20～24℃条件下黑暗共培养1～3天。

7.如权利要求1或2所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：所述的发根农杆菌菌液A₆₀₀值为0.5～1.5。

8.如权利要求1或2所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化新方法，其特征在于：在转化的侵染和共培养过程中添加乙酰丁香酮，乙酰丁香酮浓度为30～150μmol/L。

9.如权利要求1或2所述的一种以发根农杆菌介导的玉米遗传转化方法在生产转基因玉米及植株抗旱的应用。