CN101665804B - 培育根癌农杆菌介导的长春花转基因植株的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物技术领域的培育根癌农杆菌介导的长春花转基因植株的方法，包括如下步骤：取长春花无菌苗，获取无菌苗的下胚轴；制备根癌农杆菌菌液，利用根癌农杆菌介导长春花下胚轴的转化；取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得愈伤组织；将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织；将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽；取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得长春花转基因植株。本发明建立了稳定的根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系，为进一步研究代谢途径调控网络和提高TIAs的含量奠定了基础，能进一步应用到生产TIAs代谢产物的基因工程育种中。
Description
技术领域
本发明涉及一种培育根癌农杆菌介导的长春花转基因植株的方，属于生物技术领域。
背景技术
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属植物，含长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、文朵灵(Vindoline)、阿吗碱(Ajmalicine)、蛇根碱(Serpentine)等100多种萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids，TIAs)。这些生物碱多数具有药理活性，尤其是长春碱和长春新碱是目前应用最广泛的天然抗肿瘤药物。然而正常情况下在植物体中双萜类吲哚生物碱(长春碱和长春新碱)的含量极其微少，而且毛状根和细胞培养只能产生单萜类吲哚生物碱。目前国内外大多是通过先提取长春花中含量相对较多的文多灵和长春质碱，再在此基础上通过化学半合成长春碱和长春新碱。但由于生物碱结构复杂，人工合成难度大、产量低、成本高，使得长春花生物碱大规模商业化生产受到了限制。因此提高植物生物碱含量对于开发出低成本、高效的抗肿瘤药物具有非常重要的意义，并且具有非常广阔的市场前景。近年来随着植物代谢工程技术的快速发展和对长春花生物碱合成途径的逐渐明晰，采用基因工程手段为提高长春花TIAs含量提供了一个简单有效的途径。
在植物基因工程研究中，目前普遍认为农杆菌介导的遗传转化是一种较为理想的途径，并在许多植物中获得了成功。Choi PS等在2004年报道了发根农杆菌介导的长春花遗传转化方法，但由于长春花的发根中不含有长春碱和长春新碱，所以其应用价值受到限制。根癌农杆菌介导的长春花的遗传转化，仅在对长春花悬浮细胞的转化上有报道，然而细胞培养在代谢产物和遗传方面并不具有稳定性，并且转基因长春花细胞在继代过程中TIAs的含量逐渐降低。
超声波辅助农杆菌介导法(Sonication assisted Agrobacterium-mediatedtransformation，SAAT)是一种将农杆菌介导法和超声波直接转导法相结合的遗传转化方法。近年来这种技术已经被广泛应用于蚕豆、萝卜、亚麻等不同植物的遗传转化中，该方法可以显著提高转化效率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种培育根癌农杆菌介导的长春花转基因植株的方法。本发明建立了稳定的根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系。
本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤：
步骤一，取长春花无菌苗，获取无菌苗的下胚轴；
步骤二，制备根癌农杆菌菌液，利用根癌农杆菌介导长春花下胚轴的转化；
步骤三，取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得愈伤组织；
步骤四，将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织；
步骤五，将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽；
步骤六，取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得长春花转基因植株。
步骤一中，所述长春花无菌苗的获得具体为：取长春花种子，消毒后接种于MS培养基上，25±2℃，光照时间16h/d，光照强度2,000lx，培养3～4d。
步骤二中，所述根癌农杆菌为携带pCAMBIA2300-GUS表达载体的根癌农杆菌。
步骤二中，所述制备根癌农杆菌菌液具体为：取携带pCAMBIA2300-GUS表达载体的根癌农杆菌，在添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L链霉素的固体LB培养基进行培养，培养基的pH为7.0；挑取单菌落接种到添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L链霉素的LB液体培养基中，培养基的pH为7.0，培养至对数期，菌液浓度OD600值为0.8；将菌液以转速5,000rpm/min离心8min，然后用含100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基稀释至OD600值为0.4，28℃下100rpm摇床振荡培养2h，得菌液。
步骤二中，所述转化具体为：将长春花下胚轴放入无菌的EP管中，加入含100μmol/L的乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将其悬浮，超声波处理80W，处理10min，之后将下胚轴浸入OD600为0.4的根癌农杆菌菌液中，100rpm摇床震荡培养，30min后弃去菌液，用无菌滤纸将表面菌液吸干；将下胚轴平铺于添加100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS培养基上，在26℃遮光的恒温培养箱中共培养2d。
步骤三中，所述愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+0.1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+0.1mg/L α-萘乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素40mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8。；
步骤四中，所述分化培养基为：MS培养基+2.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.25mg/Lα-萘乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素70mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8。
步骤五中，所述不定芽诱导培养基为：MS培养基+1mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.1mg/L3-吲哚乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素90mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8。
步骤六中，所述生根培养基为：1/2MS培养基+头孢霉素500mg/L+0.3mg/Lα-萘乙酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明建立了稳定的根癌农杆菌介导的长春花遗传转化体系，为进一步研究代谢途径调控网络和提高TIAs的含量奠定了基础，能进一步应用到生产TIAs代谢产物的基因工程育种中。
附图说明
图1为质粒pCAMBIA 2300-GUS的T-DNA区域图谱；
图2为长春花根癌农杆菌介导的遗传转化；
图3为GUS基因在长春花再生植株根和叶中的表达；
图4为转GUS基因长春花的PCR检测结果。
本发明技术方案中涉及的MS培养基和1/2MS培养基的具体组分可分别见Murashige T和Skoog F在《Physiologia Plantarum》(植物生理学)1962年第15卷第3期473～497页上发表的题为《A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures》(一种用于烟草组织培养物快速生长和生物分析的改进培养基)和Tang K等在《Plant Science》(植物科学)2001年第160卷第6期1035～1042页上发表的题为《Transgenic rice plantsexpressing the ferredoxin-like protein(AP1)from sweet pepper showenhanced resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae》(表达来源于甜椒的铁氧环类蛋白AP1的转基因水稻显示出对白叶枯病具有增强的抗性)。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
具体实施方式
以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。如无特别说明，各种培养基配方中的百分数均为重量体积百分数(w/v)。
实施例
(1)长春花无菌苗的培养
本发明所采用的长春花种子购自PanAmerican Seed公司，太平洋系列樱桃红色(Pacifica Cherry Red，PCR)。长春花种子经75％酒精消毒1min，20％NaClO消毒5min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干多余的水分，然后接种于MS培养基上，培养3～4d，剪取获得5mm长无菌苗下胚轴。
培养室条件：温度(25±2)℃，光照时间16h/d，光照强度2,000lx。
(2)根癌农杆菌菌液制备
植物表达载体pCAMBIA2300-GUS(如图1)做为供试材料，材料由上海交通大学植物生物技术研究中心保存。该表达载体可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，载体编号为pCAMBIA2301。
用移液器取50μL携带pCAMBIA2300-GUS表达载体的根癌农杆菌(-70℃冰箱保存)，在添加卡那霉素(100mg/L)、利福平(100mg/L)和链霉素(40mg/L)的固体LB培养基上划线培养并保存。转化前挑取单菌落接种到10mL添加添加卡那霉素(100mg/L)、利福平(100mg/L)和链霉素(40mg/L)的LB液体培养基中，于28℃振荡培养(180～200rpm)至对数期，菌液浓度OD600值为0.8。侵染前将菌液以转速5,000rpm/min离心8min，然后用含100μmol/L乙酰丁香酮(AS)的1/2MS液体培养基(1/2MS培养基+3％蔗糖，培养基的pH为5.8)稀释至OD600值为0.4，然后置于28℃摇床振荡培养(100rpm)2h。
(3)根癌农杆菌介导的长春花转化
将剪好的长春花下胚轴放入无菌的EP管中，加入含AS(100μmol/L)的1/2MS液体培养基将其悬浮，无菌密封后，超声波处理功率80W，处理时间10min。而后将超声处理后的下胚轴浸入稀释好的OD600为0.4的农杆菌菌液中，100rpm摇床震荡培养，30min后弃去菌液，用无菌滤纸将表面菌液吸干；最后将下胚轴平铺于添加了100μmol/L AS的1/2MS培养基上，在26℃遮光的恒温培养箱中共培养2d。
(4)长春花愈伤组织的诱导
将共培养后的长春花下胚轴以平卧方式接种于愈伤组织诱导培养基上，见图2。图2为长春花根癌农杆菌介导的遗传转化，图中，(A)长春花再生(1：播种，2：愈伤组织诱导，3，4：在2种培养基上诱导不定芽)；(B)诱导的愈伤组织以及再生芽；(C)生根的幼苗；(D)发育完全的幼苗；(E)移栽到土壤中的幼苗；(F)开花。
所述愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+0.1mg/L2，4-二氯苯氧乙酸+0.1mg/L α-萘乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素40mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；培养温度为25±1℃，每天光照16h，经过10～12d的光照培养，可在外植体的剪切处形成愈伤组织；
将愈伤组织接种到分化培养基上，培养温度为25±1℃，每天光照16h，经过10～12d的光照培养，愈伤组织被诱导成为具有分化不定芽能力的绿色愈伤细胞；所述分化培养基为：MS培养基+2.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.25mg/L α-萘乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素70mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；
(5)长春花不定芽的分化
选取绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上培养1～2代，每代12～14d，培养温度为25±1℃，每天光照16h，经过20d左右的培养，愈伤组织上先形成大量芽点，继而芽点生长并分化形成不定芽(如图2)；所述不定芽诱导培养基为：MS培养基+1mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.1mg/L 3-吲哚乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素90mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；
(6)长春花不定芽的生根
切取从长春花下胚轴分化的不定芽，置入生根培养基中，培养温度为25±1℃，每天光照16h，经过15～20d的光照培养，可从不定芽基部分化出根，从而形成再生的植株；所述生根培养基为：1/2MS培养基+头孢霉素500mg/L+0.3mg/Lα-萘乙酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8。
(7)长春花再生植株的快速繁殖
选取生长健壮的长春花再生植株，通过切割增殖手段在快速繁殖培养基中进行培养，形成长春花再生植株；所述快速繁殖培养基为：MS培养基+3％蔗糖+3g/L植物凝胶。
(8)长春花再生植株的移栽
选取生长健壮、繁殖系数高的植株，移栽到装有移栽基质的花盆中，所述的移栽基质成分为蛭石∶珍珠岩∶泥炭土为2∶1∶6(体积比)。培养温度为25±1℃，每天光照12h，通过驯化可获得生长正常的长春花植株。
(9)转基因植株GUS组织化学活性检测
本发明中用于长春花遗传转化的载体含有β-葡萄糖苷酶基因，可采用X-Gluc作为底物，通过显色反应可直接观察到组织器官中GUS基因的表达活性。取移栽到土里2个月以上的再生植株新生叶片和根尖组织，加入GUS显色液(2mMX-gluc，100mM磷酸缓冲液pH7.0，0.5％Triton X-100，2mM K3[Fe(CN)6]，2mMK4[Fe(CN)6])，抽真空几分钟，37℃恒温培养箱中过夜。以pCAMBIA2300-GUS农杆菌作为阳性对照，非转化长春花植株的叶片和根尖作为阴性对照。染色后将材料转入70％乙醇中脱色2～3次至去除色素后观察。结果如图3所示。图3为GUS基因在长春花再生植株根和叶中的表达
A，C：转GUS基因长春花的根和叶；B，D：非转基因长春花的根和叶对照.
检测结果：用携带GUS基因表达载体的农杆菌侵染长春花下胚轴，通过卡那霉素筛选获得了32株再生植株。这些再生植株包括已导入GUS基因的转基因植株和未导入外源基因的非转基因植株。GUS组织化学染色有9株再生植株显色，认为有GUS蛋白表达，初步认为是转基因植株。
(10)转基因植株PCR分子检测
根据GUS基因的编码序列设计正反向引物，检测T-DNA是否整合到长春花基因组中。用GUS-F(AGTAAAGTAGAACGGTTTGTGGTTA)和GUS-R来检测pCAMBIA2300-GUS(CAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTA)中T-DNA在长春花基因组的整合情况，PCR的目标产物大小为402bp。
PCR反应体系为：
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，并在UVP凝胶成像系统(Transillumi-nator White/UV，UVP，inc.，USA)紫外光下拍照。能扩增出目标大小特异DNA片段的植株即为转基因植株。
检测结果见图4，扩增结果表明其中7株转基因再生植株中能够扩增出402bp的目的条带，证明这7株是独立的转化GUS基因的转基因再生植株。图4为转GUS基因长春花的PCR检测结果：
M：DNA Marker DL2000；5～32：卡那霉素抗性植株；-：阴性对照(缓冲液)；CK：对照(非转基因植株)；+：阳性对照(pCAMBIA2300-GUS质粒)。
Claims (2)
1.一种培育根癌农杆菌介导的长春花转基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取长春花无菌苗，获取无菌苗的下胚轴；
步骤二，制备根癌农杆菌菌液，利用根癌农杆菌介导长春花下胚轴的转化；
步骤三，取下胚轴，置于愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到愈伤组织；
步骤四，将愈伤组织接种到分化培养基上进行培养，得绿色愈伤组织；
步骤五，将绿色愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养，得不定芽；
步骤六，取不定芽，置入生根培养基中进行培养，得长春花转基因植株；
步骤二中，所述制备根癌农杆菌菌液具体为：取携带pCAMBIA2300-GUS表达载体的根癌农杆菌，在添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L链霉素的固体LB培养基进行培养，培养pH为7.0；挑取单菌落接种到添加100mg/L卡那霉素、100mg/L利福平和40mg/L链霉素的LB液体培养基中，培养基的pH为7.0，培养至对数期，菌液浓度OD600值为0.8；将菌液以转速5,000rpm/min离心8min，然后用含100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基稀释至OD600值为0.4，28℃下100rpm/min摇床振荡培养2h，得菌液；
步骤二中，所述转化具体为：将长春花的下胚轴放入无菌的EP管中，加入含100μmol/L的乙酰丁香酮的1/2MS液体培养基将其悬浮，超声波处理80W，处理10min，之后将下胚轴浸入OD600为0.4的根癌农杆菌菌液中，100rpm摇床震荡培养，30min后弃去菌液，用无菌滤纸将表面菌液吸干；将下胚轴平铺于添加100μmol/L乙酰丁香酮的1/2MS培养基上，在26℃遮光的恒温培养箱中共培养2d；
步骤三中，所述愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+0.1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+0.1mg/L α-萘乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素40mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；
步骤四中，所述分化培养基为：MS培养基+2.5mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.25mg/L α-萘乙酸+头孢霉素500mg/L+70mg/L卡那霉素+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；
步骤五中，所述不定芽诱导培养为：MS培养基+1mg/L 6-苄基腺嘌呤+0.1mg/L 3-吲哚乙酸+头孢霉素500mg/L+卡那霉素90mg/L+150mg/L水解乳蛋白+250mg/L脯氨酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8；
步骤六中，所述生根培养基为：1/2MS培养基+头孢霉素500mg/L+0.3mg/L α-萘乙酸+3％蔗糖+3g/L植物凝胶；培养基的pH为5.8。
2.根据权利要求1所述的培育根癌农杆菌介导的长春花转基因的方法，其特征是，步骤一中，所述长春花无菌苗的获得具体为：取长春花种子，消毒后接种于MS培养基上，25±2℃，光照时间16h/d，光照强度2,000lx，培养3～4d。
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