CN110699376B - 一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，是一种提高农杆菌瞬时转化的辅助侵染方法。本发明方法为在农杆菌侵染前以纤维素酶溶液浸泡长春花根、茎切口进行预处理，处理后采用真空渗透法对长春花进行侵染，纤维素酶溶液浓度为810‑1080U/mL，纤维素酶溶液pH为5.6‑5.8，溶液温度27‑29℃，浸泡4‑6h。本发明方法显著提高了长春花根、茎的农杆菌侵染率，进而提高目的基因的转化效率，解决了农杆菌难以侵染长春花根、茎的问题，RNA提取及反转录后PCR验证，可检测到目的基因条带，证明目的基因成功转化。

Description

一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法。
背景技术
农杆菌是一种革兰氏阴性菌，主要分布于土壤中。由于其细胞中有一段T-DNA，能够携带外源基因，在其通过伤口侵染双子叶植物或裸子植物后，在乙酰丁香酮的介导下，可将外源基因导入至局部植物组织细胞中，使目的基因在短时间内以较高的水平进行表达。由于农杆菌介导法有着高效、方便、容易操作等优势，广泛用于拟南芥、长春花、喜树、烟草等植物中。
与常规的遗传转化法相比，瞬时转化技术具有简单快速、表达效率高等优点，在基因功能分析方面较常规方法有巨大优势，例如蛋白-蛋白或蛋白-DNA的相互作用，或者是需要在短时间内对基因功能进行分析时，瞬时转化可极大提升工作效率。
农杆菌介导的瞬时转化主要侵染方法分为物理割伤、超声处理及真空渗透三种。物理割伤即为用手术刀割伤植物组织后，将植物组织浸泡于侵染用悬浮液中；超声处理以MS培养基为缓冲液，将植物组织浸泡于悬浮液内，以一定功率的超声处理一定时间后浸泡于侵染用悬浮液中；真空渗透将植物组织浸泡于侵染用悬浮液中抽真空一段时间后泄压，利用压力差将侵染液压进植物细胞中。现有的侵染方法难以使农杆菌侵染长春花根、茎。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，以破坏植物细胞表面细胞壁为原理，增加细胞壁较为致密的长春花根、茎的瞬时转化效率。
一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，所述方法在农杆菌侵染前以纤维素酶溶液浸泡长春花根、茎切口；所述纤维素酶溶液浓度为810-1080U/mL。
上述技术方案中，进一步地，所述纤维素酶溶液pH为5.6-5.8，溶液温度27-29℃，浸泡4-6h。
上述技术方案中，进一步地，所述方法包括以下步骤：
(1)长春花植株茎部及根部切口，以纤维素酶溶液浸泡；
(2)浸泡后置于农杆菌菌液中，采用真空渗透法侵染；
(3)侵染后置于暗室中培养。
上述技术方案中，进一步地，所述步骤(3)真空渗透法侵染15min。
上述技术方案中，进一步地，所述农杆菌为农杆菌GV3101。
本发明的有益效果：本发明方法显著提高了长春花根、茎的农杆菌侵染率，进而提高目的基因的转化效率，解决了农杆菌难以侵染长春花根、茎的问题，RNA提取及反转录后PCR验证，可检测到目的基因条带，证明目的基因成功转化。
附图说明
图1为经过浓度为1080U/mL纤维素酶溶液处理后的长春花根、茎凝胶电泳检测结果；
其中，A：长春花根、茎RNA提取结果；B：反转录后目的基因PCR结果；C：反转录后内参基因PCR结果；
图2为经过不同浓度纤维素酶处理后的长春花根、茎凝胶电泳检测结果；
其中，A：长春花根、茎RNA提取结果；B：反转录后目的基因PCR结果；C：反转录后内参基因PCR结果；
图3是经过浓度不高于1080U/mL的纤维素酶处理后的长春花根、茎实时定量PCR检测结果；其中，A：长春花根、茎RNA提取结果；B：反转录后目的基因PCR结果；C：反转录后内参基因PCR结果；
图4是未经纤维素酶处理及经过浓度为1080U/mL处理后的长春花根、茎电镜照片；其中，从左至右，从上至下，A、D为经过纤维素酶处理后的长春花茎、根电镜照片，B、C为未经纤维素酶处理过的长春花茎、根电镜照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，包括以下方法：
(1)用去离子水洗净长春花植株；所使用长春花幼苗长度约为8厘米；
(2)使用无菌手术刀片在花植株茎部及根部割开0.5～1cm的伤口若干，以不伤及木质部为宜；
(3)将长春花植株浸泡于装有事先配置好的纤维素酶溶液中6个小时，处理温度为26-28℃，纤维素酶溶液pH为5.6-5.8；
(4)取出经纤维素酶溶液浸泡的长春花植株，用去离子水冲洗干净；
(5)将长春花植株放置于装有带菌侵染液的锥形瓶中，将锥形瓶置于钟罩内抽真空，待内部气压达到0.1个大气压后开始计时，15min后拔掉吸气管使压力回升；所使用的侵染液为OD值为1.0的农杆菌菌液所配制，农杆菌菌株为带有质粒pCAMBIA2301的农杆菌GV3101；
(6)从侵染液中取出长春花植株，用事先灭好菌的无菌滤纸将其根部紧密包裹，用去离子水浇湿滤纸；
(7)将处理好的长春花植株放入事先准备的泡沫培养箱中，用喷壶向箱中喷洒去离子水，使箱内空气保持湿润，于26℃环境下暗培3d。
(8)使用液氮研磨法破碎长春花根、茎，并采用Trizol法提取RNA，反转录后采用crACT3及GUS引物进行鉴定。
RNA的提取
1)预冷冷冻离心机，烧好镊子，取6只已烘干的研钵；
2)盛取适量液氮，倒入研钵，并加入样品进行研磨，直到样品成为粉末状；
3)向样品管中加入800μL的Trizol，加入10μL NaAc，手动振荡摇匀5min；
4)冷冻离心机，温度4℃，转速13000rpm，离心30min；
5)取上清于新的2mL离心管中，加入等体积氯仿，手摇5min，13000rpm，4℃冷冻离心20min；
6)取上清于新的2mL离心管中，加入等体积的水饱和酚(保藏于4℃冰箱)，10μLNaAc，手摇5min，温度4℃，转速13000rpm，冷冻离心20min；
7)取上清于新的2mL离心管中，加入等体积的氯仿，手摇5min，温度4℃，转速13000rpm，冷冻离心20min；
8)重复步骤7；
9)取上清于新的2mL离心管中(不可取出杂质)，加入上清体积70％的异丙醇，轻轻的上下晃动，待管中出现沉淀或异丙醇与上清完全混合后，温度4℃，转速13000rpm，冷冻离心30min；
10)用移液枪吸去上清，加入1mL75％乙醇(RNase-free ddH2O配制洗涤沉淀，用移液枪轻轻吹打，使沉淀悬浮，温度4℃，转速13000rpm，冷冻离心15min；
11)重复步骤10，用移液枪吸去上清，用真空旋转蒸发仪旋干乙醇，得到干粉状态的RNA，加入30-50mL RNase-free ddH2O，轻轻弹匀，充分溶解RNA。
cDNA的检测
取200μLPCR管，加入9.5μLddH2O，1μL DNTPMIX，1.5μL Easytaq Buffer，1μLGUS-F，1μL GUS-R，1μL cDNA，0.15μL Easytaq酶，轻弹混匀，使用掌上离心机离心10s。使用PCR仪，采用3步法，程序设定如下：第一步：预变性94℃，5min。第二步：变性94℃30s，退火51℃15s，延伸72℃15s，35个循环。第三步：延伸完全72℃，10min。待PCR反应停止后，向PCR管中加入1μL溴酚蓝溶液作为染色剂，进行凝胶电泳跑胶验证。
琼脂糖凝胶的制备与样品上样
1)制胶：称取30mg琼脂糖，加入30mL1×TAE缓冲溶液，使用微波炉将其加热融化，冷却至60℃左右时加入5μL10mg.mL-1EB母液，混匀后倒入制胶槽，20min后取出备用；
2)将制好的琼脂糖凝胶取出，放入经DEPC处理过的电泳槽中，倒入1×TAE缓冲液，待缓冲液没过琼脂糖凝胶后停止；
3)向离心管中加入加入1μL溴酚蓝缓冲液，5μLRNA样品，混匀；
4)将样品依次点入对应胶孔中；
5)将电泳仪电压设置为100V，进行凝胶电泳10-15min；
6)在紫外透射仪下检测，观察结果；
RNase-free DNase处理(DNA酶消化)
1)取RNase-free的200μL容量的PCR管，配制10μL反应体系，8μL总RNA，1μL10×Buffer，1μLDNase RNase-free2U)；
2)用移液枪轻轻弹动样品使其混匀，掌上离心机离心10s，PCR仪设置程序37℃，40min；
3)取出样品，加入2μL50mmol.L-1EDTA(RNase-free)，PCR设置程序65℃，20min，以使DNase失活，避免对反转录后cDNA产生影响。
反转录合成cDNA
1)取RNase-free的200μL容量的PCR管，加入RNase-freeDNase处理后的RNA溶液11μL，2μL OligodT(10mmol.L-1)，2μLdNTP(10mmol.L-1)；
2)用移液枪轻轻弹动样品使其混匀，掌上离心机离心10s；
3)使用PCR仪，70℃处理5min后4℃处理2min，取出EP管，加4μL 5×First-StrandBuffer(含有DTT)；
4)加入1μL(200U)TIANScript M-MLV并轻弹混匀，掌上离心机离心10s；
5)使用PCR仪，42℃处理50min后95℃处理5min，终止反应，加入30μLRNase-freeddH2O。
图1为经过浓度为1080U/mL纤维素酶溶液处理后的长春花根、茎凝胶电泳检测结果；由图A可知，RNA降解程度较低，可用于下一步实验；由图B可知，经过纤维素酶处理后的长春花根、茎cDNA中，检测到GUS基因表达，证明纤维素酶预处理对长春花瞬时转化有较明显的促进作用；由图C可知，长春花根、茎cDNA中检测到内参基因的表达，证明长春花根、茎cDNA成功被反转录，可用于实验。
图2为经过不同浓度纤维素酶处理后的长春花根、茎凝胶电泳检测结果；由图A可知，RNA降解程度较低，可用于下一步实验；由图B可知，经过浓度为810U/mL的纤维素酶处理后的长春花茎部cDNA及浓度为1080U/mL的纤维素酶处理后的长春花根、茎部cDNA中，检测到GUS基因表达，证明浓度为1080U/mL的纤维素酶预处理对长春花根、茎瞬时转化均有较明显的促进作用；由图C可知，长春花根、茎cDNA中检测到内参基因的表达，证明长春花根、茎cDNA中检测到内参基因表达，证明cDNA成功被反转录，可用于实验。
图3是经过浓度不高于1080U/mL的纤维素酶处理后的长春花根、茎实时定量PCR检测结果；结果表明，经过浓度为810U/mL的纤维素酶处理后的长春花茎，浓度1080U/mL的纤维素酶处理过的长春花根、茎在经农杆菌介导后，目的基因成功表达。进一步表明了纤维素酶对长春花根、茎的侵染有协助和促进作用，经过多次实验也证明了实验的可重复性。
图4是未经纤维素酶处理及经过浓度为1080U/mL处理后的长春花根、茎电镜照片。由图可知，未经纤维素酶处理过的长春花根、茎组织，表面较为光滑，而经过纤维素酶处理过的长春花根、茎组织表面粗糙程度较高，证明了纤维素酶对活体长春花根、茎细胞表面产生了一定的破坏作用，进一步证明了实验的可行性。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (4)

1.一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，其特征在于，所述方法在农杆菌侵染前以纤维素酶溶液浸泡长春花根、茎切口；所述纤维素酶溶液浓度为810-1080U/mL；
所述方法包括以下步骤：
（1）长春花植株茎部及根部切口，以纤维素酶溶液浸泡；
（2）浸泡后置于农杆菌菌液中，采用真空渗透法侵染；
（3）侵染后置于暗室中培养。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，其特征在于，所述纤维素酶溶液pH为5.6-5.8，溶液温度27-29℃，浸泡4-6h。
3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，其特征在于，所述步骤（3）真空渗透法侵染15min。
4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的长春花瞬时转化方法，其特征在于，所述农杆菌为农杆菌GV3101。
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