CN106119276A - 一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：侵染和共培养阶段：将灯盏花愈伤组织切成块状放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行暗培养；恢复培养阶段；筛选培养阶段；分化培养阶段：生根阶段：将抗性芽转接到生根培养基培养，得到完整的抗性苗；阳性苗检测阶段。本发明通过探索、优化灯盏花愈伤组织再生途径建立灯盏花高效的愈伤组织再生体系，愈伤组织形成频率为90％以上，愈伤组织分化率在90％以上，转化效率高达25％以上，可以满足灯盏花育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。
Description
技术领域
本发明属于农杆菌介导技术领域，尤其涉及一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法。
背景技术
灯盏花，学名为短葶飞蓬(Erigeron breviscapus)，菊科飞蓬属，一般生长于海拔1,200米至3,500米的地区，多生长于草地、亚高山开旷山坡、中山和林缘。分布于我国的西南地区，尤以云南最多。由于灯盏花适应性强，自然繁殖力高，野生资源有较大分布，其中文山州、红河州分布较广。灯盏花作为云南特有的野生天然药用植物，它的医药价值很高，全株可入药。其具有散寒解表，祛风除湿，活络止痛，扩张血管，改善脑血循环等作用，临床上常用灯盏花的口服或静脉滴注制剂来治疗或辅助治疗冠心病，心绞痛等心脑血管疾病。目前灯盏花被认为是治疗闭塞性脑血管疾病和脑溢血后遗症最为有效的天然药物,有效率达95％以上,灯盏花已成为全国中医院急诊必备中成药,被列为国家中药保护品种。
灯盏花现存的野生数量有限，并且常见品种单株灯盏乙素含量较低，而我国人工栽培灯盏花仅有10余年的历史，现有栽培种都是短期驯化得到，各种抗性都较差，而由于灯盏花在心脑血管疾病方面的显著疗效就使它的市场需求量大增，现在每年对于灯盏花的需求量达到了一万吨以上并且还在增长，已经远超出了现有的灯盏花产量。因此，培育高产、有效成分含量高、抗逆、抗病等的优良灯盏花品种是现在亟需解决的问题。而目前转基因技术由于其周期短、针对性强、极大扩宽可用的基因资源等显著优势被广泛运用于各种作物的育种。
但是国内目前从事灯盏花相关研究的较少并且大部分还停留在化学成分的研究上，极少从事灯盏花转基因相关研究的，而且采用的基因枪的方法来进行灯盏花转基因。众所周知，基因枪法存在诸如插入位点不确定、遗传稳定性差等较大弊端。
发明内容
针对现有技术灯盏花遗传转化研究少转化技术不成熟等问题，本发明提供一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法。本发明使用农杆菌介导灯盏花转化，打通农杆菌介导灯盏花高效转染体系。这是通过农杆菌转染体系培育新型灯盏花最为重要的一步，同时也是得灯盏花基因功能研究的重要技术手段。建立灯盏花农杆菌介导高效转染体系意味着能够突破灯盏花自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
本发明的技术方案如下：一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：
侵染和共培养阶段：将灯盏花愈伤组织切成块状放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；
侵染时真空度为0.01～0.1MPa，侵染时间为0.5～2h；侵染时间过短，农杆菌与灯盏花组织接触时间短，侵染效果不好；侵染时间过长，造成被侵染细胞死亡以及农杆菌抑制不住。
所述共培养为暗培养，培养温度为22～26℃，培养时间为3～7天；
所述共培养培养基为MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ0.1～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS50～200μmol·L-1，pH 5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；
恢复培养阶段：将共培养后的愈伤组织转接到恢复培养基中进行恢复培养；
所述恢复培养基成分如下：MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+Cef 250～500mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min，恢复培养阶段目的是使愈伤组织在共培养阶段受到农杆菌的损伤得到恢复，同时在培养基中添加Cef抑制愈伤组织上残留的农杆菌生长。
恢复培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养1～5天；
筛选培养阶段：恢复培养后的愈伤组织转接到筛选培养基中进行筛选培养，获得新增殖愈伤组织；
所述筛选培养基成分如下：MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+Cef 250～500mg·L-1+Hyg 5～20mg·L-1蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min；
筛选培养条件如下：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养20～50天；
分化培养阶段：将新增殖愈伤组织转接到分化培养基A中，培养至愈伤组织表面形成小芽，然后转至分化培养基B中长成1～3cm的抗性芽，分化培养基A是诱导小芽的形成，分化培养基B是促进小芽快速生长成完整的植株；
所述分化培养基A成分如下：SH基础配方+6-BA 0.1～2mg·L-1+NAA0.1～2mg·L-1+Ade 40～150mg·L-1+Glu 5～20mg·L-1+CH 0.5～3g·L-1+Cef50～300mg·L-1+Hyg 3～15mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH 5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；
SH基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1；
分化培养基B成分如下：MS基础培养基+KT 0.5～2mgL-1+NAA 0.1～3mgL-1+Cef 50～300mgL-1+Hyg 3～15mgL-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；
分化培养条件如下：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx；
生根阶段：将抗性芽转接到生根培养基培养，得到完整的抗性苗；
所述生根培养基成分如下：White培养基+IBA 0.01～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+Cef 50～300mgL-1，pH5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；
White培养基成分如下：硝酸钾40～100mgL-1，柠檬酸1.0～2.0mgL-1，硝酸钙200～300mgL-1，硫酸镁600～700mgL-1，硫酸钠50～80mgL-1，氯化钾60～80mgL-1，磷酸二氢钠10～20mgL-1，盐酸硫胺素0.05～1mgL-1，盐酸吡哆素0.05～1mgL-1，盐酸0.1～1mgL-1，甘氨酸2～5mgL-1，硫酸锰5～10mgL-1，硫酸锌2～5mgL-1，碘化钾0.1～1mgL-1；
生根培养条件如下：22～28℃光照培养，光照强度为1500～2500lx，每天光照时间12～14h；
阳性苗检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染灯盏花的阳性苗，建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系。
所述灯盏花愈伤组织采用以下方法获得：
种子萌发无菌苗阶段：将灯盏花种子消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成无菌苗；所述灯盏花种子消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗3～15次，在75％乙醇中浸泡20～120s，再使用无菌水清洗3～15次，在0.1～0.2％升汞中浸泡3～15min，再使用无菌水清洗种子8～15次，种子放在滤纸上晾干；
种子萌发无菌苗阶段，所述基础培养基的成分如下：MS基础培养基+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20-30min。
培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养时间20～50天；
MS基础培养基方如下：硝酸钾1.0～5.0g·L-1，硝酸铵2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢钾0.1～0.3g·L-1，氯化钙150～500mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.1～0.4mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸纳19.8～40mg·L-1，七水硫酸亚铁27.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.025～0.1mg·L-1，五水硫酸铜0.025～0.1mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾0.5～2mg·L-1，四水硫酸锰22.3～30mg·L-1，二水钼酸钠0.25～0..3mg·L-1，七水硫酸锌8～10mg·L-1；
无菌苗扩繁阶段：将萌发20～50天的无菌苗的叶片切成6～20mm2的小段，然后接到诱导培养基上诱导愈伤组织20～50天。
所述愈伤组织诱导培养基的成分如下：MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min。
愈伤组织诱导培养条件为：22～26℃光照培养20～50天，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx。
所述农杆菌采用以下方法获得：将农杆菌加入到同时添加有40～65mg/L卡那霉素和40～70mg/L利福平的YM培养基中，2000～4000r/min，4～8℃离心10～20min，弃上清，下层加入重悬液使OD值达到0.2～0.3，最后向菌液中加入终浓度为50～200μmol·L-1AS，混匀备用；
所述YM培养基成分如下：蛋白胨10～20g·L-1，酵母提取物5～10g·L-1，氯化钠10～20g·L-1，农杆菌在YM培养基中培养条件如下：26～30℃培养10～14h，有无光照不影响效果；
所述重悬液为MS基础培养基+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～40g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高温灭菌20～30min；
本发明提供的农杆菌介导高效转染体系适合对灯盏花进行转基因功能验证、灯盏花突变体的获得、灯盏花转基因育种。
农杆菌植物转化虽然比较常见，但一般都针对水稻等谷物植物；由于灯盏花的基因屏障作用较强，农杆菌很难侵染到灯盏花基因中，因此其他植物的农杆菌转化方法对灯盏花的借鉴意义很小。本发明希望通过由农杆菌介导的转基因技术对灯盏花进行有效的遗传转化，来提高其主要药用成分灯盏乙素的含量，增强植株抗性。为了实现上述目标，本发明对农杆菌介导的灯盏花转基因的整个遗传体系进行了研究并取得了一定成果。
本发明以灯盏花为模型的研究平台，建立灯盏花的组织培养体系以及转基因体系的重点在于共培养、筛选和生根培养等过程。而共培养基、筛选培养基、以及生根培养基中加入的激素种类及组合、激素添加量以及培养时间，都有不可预知、不可控的结果。根据研究，发现在本发明提供的侵染条件下容易打破其基因屏障，农杆菌能够成功介导灯盏花，且本发明采用的激素配方以及培养时间比较适合侵染后的灯盏花共培养、筛选等，愈伤组织形成频率较高，本发明中愈伤组织形成频率为90％以上，愈伤组织分化率在90％以上，转化效率高达25％以上，可以满足灯盏花育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过探索、优化灯盏花愈伤组织再生途径建立灯盏花高效的愈伤组织再生体系。同时本发明不仅建立了灯盏花农杆菌转化体系，同时又对体系进行了优化对缩短了获得活的阳性苗的时间，又不会产生因为各步骤时间太短，导致效果不好等问题，愈伤组织形成频率为90％以上，愈伤组织分化率在90％以上，转化效率高达25％以上，可以满足灯盏花育种需求，适合大规模工业生产和商业育种。
附图说明
图1为实施例1中豆瓣绿转化阳性苗PCR扩增后的凝胶电泳图；
图2为实施例2中豆瓣绿转化阳性苗PCR扩增后的凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
中英文对照
SH：SH培养基；
MS：MS培养基；
White：White培养基；
6-BA：6-苄氨基腺嘌呤；
TDZ：Thidiazuron(即：噻苯隆)；
NAA：a-萘乙酸；
Ade：硫酸盐腺嘌呤；
AS：乙酰丁香酮；
IBA：吲哚丁酸；
Cef：头孢青霉素；
Hyg：潮霉素；
Glu：谷氨酸；
CH：水解酪蛋白。
以下实施例中所述培养基的溶剂均为水。
实施例1：“千山一号”灯盏花的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1种子萌发无菌苗阶段：将种子置于无菌水中冲洗3次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃30s，倒出乙醇，无菌水清洗2次，倒出无菌水，加入0.1％升汞，浸泡5min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子5次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于MS基础培养基+琼脂8g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH 5.8，121℃高压灭菌20min。22～26℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx；
MS基础培养基方如下：硝酸钾1.9g·L-1，硝酸铵1.65g·L-1，硫酸镁0.37g·L-1，磷酸二氢钾0.17g·L-1，氯化钙440mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，肌醇100mg·L-1，盐酸硫胺素0.4mg·L-1，盐酸吡哆素0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，乙二胺四乙酸纳37.3mg·L-1，七水和硫酸亚铁27.8mg·L-1，六水氯化钴0.025mg·L-1，五水硫酸铜0.025mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，碘化钾0.83mg·L-1，四水硫酸锰22.3mg·L-1，二水钼酸钠0.25mg·L-1，七水硫酸锌8.6mg·L-1，以下步骤也采用该配方。
步骤2愈伤组织诱导阶段：15～40天后，将步骤1中萌发长到3cm以上的无菌苗叶片切成6～20mm2小块，接入诱导培养基MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA 2mg·L-1+TDZ0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，25℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物载体PCAMBIA1300的农杆菌加入到同时添加有40mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使OD值达到0.2～0.3；重悬液为MS基础培养基+蔗糖20g·L-1+葡萄糖10g·L-1，pH5.2，115℃高温灭菌20min。最后向菌液中加入100μmol·L-1AS，混匀备用；
YM培养基成分如下：蛋白胨10g·L-1，酵母提取物5g·L-1，氯化钠10g·L-1，
步骤4侵染和共培养阶段：将步骤2中在诱导培养基诱导20～30天的愈伤组织，切成15～50mm3左右的愈伤组织块，放入100mL三角瓶中约150～200块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.03～0.08MPa，保持1h，倒去菌液，将愈伤组织块晾干，转接到共培养培养基(MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA2mg·L-1+TDZ 0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1+AS 100umolL-1，pH 5.2，115℃灭菌20～30min)，25℃暗培养两天。
步骤5恢复培养阶段：将步骤4共培养两天的愈伤组织，转接到恢复培养培养基中(MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA 2mg·L-1+TDZ 0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1+Cef 400mg·L-1，pH 5.8，120℃灭菌20min)，25℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx。
步骤5筛选阶段：在恢复培养7天后，将步骤4中获得的愈伤组织转接到筛选培养基筛选培养20～30天后获得新增值愈伤组织(MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA2mg·L-1+TDZ0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1+400mg·L-1+潮霉素18mg·L-1，120℃灭菌20min，pH5.8)，22～26℃光照培养，每天光照12，光照强度1500～2500lx。
步骤6分化阶段：筛选培养20～30天后，将步骤5中获得获得新增值愈伤组织转接到分化培养基A中(SH基础配方+6-BA 1mg·L-1+NAA 1mg·L-1+Ade80mg·L-1+Glu 5mg·L-1+CH 2g·L-1+Cef 200mg·L-1+Hyg 5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，pH 5.8，121℃灭菌20min)，培养至愈伤组织表面形成小芽转至分化培养基B(MS基础培养基+KT0.5mgL-1+NAA0.3mgL-1+Cef200mgL-1+Hyg5mgL-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，pH5.8，121℃灭菌20～30min)中长成1～3cm的抗性芽；培养条件如下25℃光照培养，光照强度为1500～2500lx，光照时间每天12h。
SH基础配方成分如下：硝酸钾3.0g·L-1，硫酸镁0.24g·L-1，磷酸二氢铵0.4g·L-1，氯化钙200mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，肌醇120mg·L-1，盐酸硫胺素0.5mg·L-1，盐酸吡哆素0.6mg·L-1，烟酸0.7mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳22mg·L-1，六水氯化钴0.13mg·L-1，五水硫酸铜0.24mg·L-1，硼酸6mg·L-1，碘化钾2mg·L-1，一水硫酸锰11mg·L-1，二水钼酸钠0.12mg·L-1，七水硫酸锌1.2mg·L-1；
步骤(8)生根阶段：将步骤(7)中获得的抗性芽转接到生根培养基培养(White培养基+IBA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8·L-1+Cef 200mgL-1)，pH5.2～5.8，得到完整的抗性苗；
White培养基成分如下：硝酸钾80.0mgL-1，柠檬酸2.0mgL-1，硝酸钙287.0mgL-1，硫酸镁738.0mgL-1，硫酸钠53.0mgL-1，氯化钾65.0mgL-1，磷酸二氢钠19.1mgL-1，盐酸硫胺素0.1mgL-1，盐酸吡哆素0.1mgL-1，盐酸0.5mgL-1，甘氨酸3.0mgL-1，硫酸锰6.6mgL-1，硫酸锌2.7mgL-1，碘化钾0.75mgL-1；
步骤7阳性检测阶段：在生根培养基培养约8周后，将步骤6获得的抗性苗取叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
PCR扩增条件：
其中2c-3c-4c循环30次。
电泳条件：电压100v，电流100mA
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因已经表达。
参考图1，9号，26号，43号泳道为标记DNA；50号泳道是阴性对照，51号泳道是潮霉素基因PCR阳性对照；2号,5号,7号,10号,20号,21号,38号,40号,44号,47号,48号,51号泳道为阳性植株。
本实施例中愈伤组织形成频率为90％以上，愈伤组织分化率在90％以上，
转化效率高达25％。如表1、表2和表3所示。
表1
表2
表3
筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导的方法能将外源基因引入灯盏花基因组。因此，采用此方法进行灯盏花的诱导愈伤及农杆菌介导的高效转染，可以使灯盏花快速获得目的性状，而且可以突破灯盏花自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
实施例2：“玉溪”灯盏花的诱导愈伤及农杆菌介导高效转染
步骤1种子萌发无菌苗阶段：将种子置于无菌水中冲洗3次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃30s，倒出乙醇，无菌水清洗2次，倒出无菌水，加入0.1％升汞，浸泡5min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子5次，把种子放在滤纸上吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于MS基础培养基+琼脂8g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH 5.8，121℃高压灭菌20min。22～26℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx；
MS基础培养基方如下：硝酸钾1.9g·L-1，硝酸铵1.65g·L-1，硫酸镁0.37g·L-1，磷酸二氢钾0.17g·L-1，氯化钙440mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，肌醇100mg·L-1，盐酸硫胺素0.4mg·L-1，盐酸吡哆素0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，乙二胺四乙酸纳37.3mg·L-1，七水和硫酸亚铁27.8mg·L-1，六水氯化钴0.025mg·L-1，五水硫酸铜0.025mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，碘化钾0.83mg·L-1，四水硫酸锰22.3mg·L-1，二水钼酸钠0.25mg·L-1，七水硫酸锌8.6mg·L-1，以下步骤也采用该配方。
步骤2愈伤组织诱导阶段：15～40天后，将步骤1中萌发长到3cm以上的无菌苗叶片切成6～20mm2小块，接入诱导培养基MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA 2mg·L-1+TDZ0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，25℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物载体PCAMBIA1300的农杆菌加入到同时添加有40mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使OD值达到0.2～0.3；重悬液为MS基础培养基+蔗糖20g·L-1+葡萄糖10g·L-1，pH5.2，115℃高温灭菌20min。最后向菌液中加入100μmol·L-1AS，混匀备用；
YM培养基成分如下：蛋白胨10g·L-1，酵母提取物5g·L-1，氯化钠10g·L-1，
步骤4侵染和共培养阶段：将步骤2中在诱导培养基诱导20～30天的愈伤组织，切成15～50mm3左右的愈伤组织块，放入100mL三角瓶中约150～200块叶片块，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，抽真空到0.03～0.08MPa，保持1h，倒去菌液，将愈伤组织块晾干，转接到共培养培养基(MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA2mg·L-1+TDZ 0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1+AS 100umolL-1，pH 5.2，115℃灭菌20～30min)，25℃暗培养两天。
步骤5恢复培养阶段：将步骤4共培养两天的愈伤组织，转接到恢复培养培养基中(MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA 2mg·L-1+TDZ 0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1+Cef 400mg·L-1，pH 5.8，120℃灭菌20min)，25℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx。
步骤5筛选阶段：在恢复培养7天后，将步骤4中获得的愈伤组织转接到筛选培养基筛选培养20～30天后获得新增值愈伤组织(MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA2mg·L-1+TDZ0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1+400mg·L-1+潮霉素18mg·L-1，120℃灭菌20min，pH5.8)，22～26℃光照培养，每天光照12，光照强度1500～2500lx。
步骤6分化阶段：筛选培养20～30天后，将步骤5中获得获得新增值愈伤组织转接到分化培养基A中(SH基础配方+6-BA 1mg·L-1+NAA 1mg·L-1+Ade80mg·L-1+Glu 5mg·L-1+CH 2g·L-1+Cef 200mg·L-1+Hyg 5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，pH 5.8，121℃灭菌20min)，培养至愈伤组织表面形成小芽转至分化培养基B(MS基础培养基+KT0.5mgL-1+NAA0.3mgL-1+Cef200mgL-1+Hyg5mgL-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，pH5.8，121℃灭菌20～30min)中长成1～3cm的抗性芽；培养条件如下25℃光照培养，光照强度为1500～2500lx，光照时间每天12h。
SH基础配方成分如下：硝酸钾3.0g·L-1，硫酸镁0.24g·L-1，磷酸二氢铵0.4g·L-1，氯化钙200mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，肌醇120mg·L-1，盐酸硫胺素0.5mg·L-1，盐酸吡哆素0.6mg·L-1，烟酸0.7mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳22mg·L-1，六水氯化钴0.13mg·L-1，五水硫酸铜0.24mg·L-1，硼酸6mg·L-1，碘化钾2mg·L-1，一水硫酸锰11mg·L-1，二水钼酸钠0.12mg·L-1，七水硫酸锌1.2mg·L-1；
步骤7生根阶段：将步骤(7)中获得的抗性芽转接到生根培养基培养(White培养基+IBA 0.1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8·L-1+Cef 200mgL-1)，pH5.2～5.8，得到完整的抗性苗；
White培养基成分如下：硝酸钾80.0mgL-1，柠檬酸2.0mgL-1，硝酸钙287.0mgL-1，硫酸镁738.0mgL-1，硫酸钠53.0mgL-1，氯化钾65.0mgL-1，磷酸二氢钠19.1mgL-1，盐酸硫胺素0.1mgL-1，盐酸吡哆素0.1mgL-1，盐酸0.5mgL-1，甘氨酸3.0mgL-1，硫酸锰6.6mgL-1，硫酸锌2.7mgL-1，碘化钾0.75mgL-1；
步骤7阳性检测阶段：在生根培养基培养约8周后，将步骤6获得的抗性苗取叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，确定是否存在阳性条带，确定阳性苗。
PCR扩增条件：
其中2c-3c-4c循环30次。
电泳条件：电压100v，电流100mA
本发明检测的抗性植株对于潮霉素具有一定的抗性，证明导入的潮霉素抗性基因已经表达。
参考图2，9号，26号，43号泳道为标记DNA；50号泳道是阴性对照，51号泳道是潮霉素基因PCR阳性对照；1号,2号,3号,7号,10号,11号,18号,19号,20号,21号,27号,33号,38号,39号,42号，46号,48号泳道为阳性植株。
本实施例中愈伤组织形成频率为90％以上，愈伤组织分化率在90％以上，转化效率高达36.95％，如表4、表5和表6所示。
表4
表5
表6
筛选之后分化所得的阳性苗经过如上验证，证实了本发明中通过农杆菌遗传介导的方法能将外源基因引入灯盏花基因组。因此，采用此方法进行灯盏花的诱导愈伤及农杆菌介导的高效转染，可以使灯盏花快速获得目的性状，而且可以突破灯盏花自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。
实施例3“千山一号”灯盏花的愈伤不同转染条件对比
为对比不同的侵染条件的侵染效果，我们使用含GUS基因载体PCAMBIA1301载体进行转化，共培养后进行染色检测转化效率，结果如表7～表10所示。
步骤1种子萌发无菌苗阶段：将种子置于无菌水中冲洗3次，倒去无菌水，加入75％乙醇，摇晃30s，倒出乙醇，无菌水清洗2次，倒出无菌水，加入0.1％升汞，浸泡5min，倒出升汞并回收，无菌水清洗种子5次，把种子放在滤纸上
抽真空到0.03～0.08MPa，保持1h，倒去菌液，将愈伤组织块晾干，转接到共培养培养基(MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA吹干。将种子一半接触空气，半嵌接种于MS基础培养基+琼脂8g·L-1+蔗糖30g·L-1，pH 5.8，121℃高压灭菌20min。22～26℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx；
MS基础培养基方如下：硝酸钾1.9g·L-1，硝酸铵1.65g·L-1，硫酸镁0.37g·L-1，磷酸二氢钾0.17g·L-1，氯化钙440mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，肌醇100mg·L-1，盐酸硫胺素0.4mg·L-1，盐酸吡哆素0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，乙二胺四乙酸纳37.3mg·L-1，七水和硫酸亚铁27.8mg·L-1，六水氯化钴0.025mg·L-1，五水硫酸铜0.025mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，碘化钾0.83mg·L-1，四水硫酸锰22.3mg·L-1，二水钼酸钠0.25mg·L-1，七水硫酸锌8.6mg·L-1，以下步骤也采用该配方。
步骤2愈伤组织诱导阶段：15～40天后，将步骤1中萌发长到3cm以上的无菌苗叶片切成6～20mm2小块，接入诱导培养基MS基础培养基+6-BA 4mg·L-1+NAA 2mg·L-1+TDZ0.5mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂8g·L-1，25℃光照培养，每天光照12h，光照强度1500～2500lx。
步骤3农杆菌准备阶段：将导入植物载体PCAMBIA1301的农杆菌加入到同时添加有40mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基中，摇床培养的转速200r/min，28℃培养过夜，之后把菌液放入离心机，4000r/min，4℃离心10min，倒掉上清液，加入重悬液使OD值达到0.2～0.3；重悬液为MS基础培养基+蔗糖20g·L-1+葡萄糖10g·L-1，pH5.2，115℃高温灭菌20min。最后向菌液中加入100μmol·L-1AS，混匀备用；
YM培养基成分如下：蛋白胨10g·L-1，酵母提取物5g·L-1，氯化钠10g·L-1，
步骤4侵染和共培养阶段：将步骤2中在诱导培养基诱导20～30天的愈伤组织，切成15～50mm3左右的愈伤组织块，放入100mL三角瓶中约，向三角瓶中倒入适量步骤3获得的菌液，套上封口膜并用橡筋勒紧，分别进行不同的共培养时间(表7)、不同的侵染时间(表8)、不同的真空处理(表9)共培养培养基(10)。
步骤5染色阶段：将步骤4中处理后的愈伤组织，每种处理区100块，放入50ml灭菌的离心管中，加入GUS染液，37℃黑暗条件反应16h，统计出现蓝色的斑点的愈伤组织数目。
GUS染液的成分如下：EDTA 1Mm、亚铁氰化钾5mM、铁氰化钾5mM、TritonX-100 1％、X-Gluc 1mg/ml、溶解在50mmol/l的磷酸钠缓冲液(PH＝7)。
由表7可知，共培养超过7天后愈伤组织周围生长大量农杆菌，到10天由于农杆菌生长导致愈伤组织死亡。
表8可以看出在合适的侵染时间范围内(1h～2h)，转化率比较好。
时间过长，则会造成侵染过度，使得植物细胞死亡。
由表9可知，常压条件侵染效果较差。
表10中，虽然瞬时转化率相近,但是由于缺少激素的处理若采用两种激素则后期分化效率会下降。
Claims (10)
1.一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
侵染和共培养阶段：将灯盏花愈伤组织切成块状放入三角瓶中，加入菌液，瓶口密封，真空条件下侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行共培养；
恢复培养阶段：将共培养后的愈伤组织转接到恢复培养基中进行恢复培养；
筛选培养阶段：恢复培养后的愈伤组织转接到筛选培养基中进行筛选培养，获得新增殖愈伤组织；
分化培养阶段：将新增殖愈伤组织转接到分化培养基A中，培养至愈伤组织表面形成小芽，然后转至分化培养基B中培养长成1～3cm的抗性芽；
生根阶段：将抗性芽转接到生根培养基培养，得到完整的抗性苗；
阳性苗检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染灯盏花的阳性苗，建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系。
2.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，侵染和培养阶段：侵染时真空度为0.01～0.1MPa，侵染时间为0.5～2h；共培养为暗培养，暗培养温度为22～26℃，培养时间为3～7天。
3.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述共培养培养基为MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS 50～200μmol·L-1，pH 5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min 。
4.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述恢复培养基成分如下：MS基础培养基+6-BA2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+Cef 250～500mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min。
恢复培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养1～5天。
5.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，筛选阶段：所述筛选培养基成分如下MS基础培养基+6-BA 2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ0.1～1mg·L-1+Cef250～500mg·L-1+Hyg 5～20mg·L-1蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min；
筛选培养条件如下：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养20～50天。
6.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，分化培养阶段：所述分化培养基A成分如下：SH基础配方+6-BA 0.1～2mg·L-1+NAA 0.1～2mg·L-1+Ade40～150mg·L-1+Glu 5～20mg·L-1+CH 0.5～3g·L-1+Cef 50～300mg·L-1+Hyg 3～15mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH 5.2～5.8， 118～125℃灭菌20～30min；
所述分化培养基B成分如下：MS基础培养基+KT 0.5～2mgL-1+NAA 0.1～3mgL-1+Cef 50～300mgL-1+Hyg 3～15mgL-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH 5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min。
7.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，分化培养条件如下：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx。
8.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，生根阶段：所述生根培养基成分如下：White培养基+IBA 0.01～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+Cef50～300mgL-1，pH5.2～5.8，118～125℃灭菌20～30min；
生根培养条件如下：22～28℃光照培养，光照强度为1500～2500lx，每天光照时间12～14h。
9.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述灯盏花愈伤组织采用以下方法获得：
种子萌发无菌苗阶段：将灯盏花种子消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成无菌苗；所述灯盏花种子消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗3～15次，在75％乙醇中浸泡20～120s，再使用无菌水清洗3～15次，在0.1～0.2％升汞中浸泡3～15min，再使用无菌水清洗种子8～15次，种子放在滤纸上晾干；
所述基础培养基的成分如下：MS基础培养基+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20-30min。
培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养时间20～50天；
愈伤组织诱导阶段：将萌发20～50天的无菌苗的叶片切成6～20mm2的小段，然后接到诱导培养基上诱导愈伤组织20～50天。
所述愈伤组织诱导培养基的成分如下：MS基础培养基+6-BA2～5mg·L-1+NAA 1～4mg·L-1+TDZ 0.1～1mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min；
愈伤组织诱导培养条件为：22～26℃光照培养20～50天，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx。
10.如权利要求1所述的建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法，其特征在于，所述农杆菌采用以下方法获得：将农杆菌加入到同时添加有40～65mg/L卡那霉素和40～70mg/L利福平的YM培养基中，2000～4000r/min，4～8℃离心10～20min，弃上清，下层加入重悬液使OD值达到0.2～0.3，最后向菌液中加入终浓度为50～200μmol·L-1AS，混匀备用；
所述YM培养基成分如下：蛋白胨10～20g·L-1，酵母提取物5～10g·L-1，氯化钠10～20g·L-1，农杆菌在YM培养基中培养条件如下：26～30℃培养10～14h，有无光照不影响效果；
所述重悬液为MS基础培养基+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～40g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高温灭菌20～30min。
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