CN117158319B - 灯盏花植物组织培养及植株再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法，属于涂料植物组培领域。该方法包括外植体的处理、愈伤组织诱导培养、不定芽诱导培养、不定根诱导培养和炼苗移栽几大步骤。本发明方法组培时间上培养时间缩短，愈伤组织在加入浓缩硅后褐化现象消失，苗更健壮，抗逆行增强；愈伤组织在加入浓缩硅后褐化现象消失，苗更健壮，抗逆行增强；本发明方法能够为灯盏花分子研究、遗传转化体系的建立提供数据支撑和理论基础，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法。
背景技术
灯盏花别称有灯盏细辛、东菊草、地顶草、双葵花等，为菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz的干燥全草。全株中含有成分黄酮类、咖啡酸酯类、芳香酸类、香豆素类、吡喃酮类等，其中黄酮类化合物野黄芩苷(又名灯盏花乙素)及咖啡酸酯类为其主要有效成分。灯盏花具有非常广泛的药理活性，目前灯盏花临床用药上，除了治疗心脑血管系统疾病以外，在糖尿病、肾组织受损、头晕目眩、老年性疾病等的治疗上也有很好的作用。
灯盏花是一种多年生草本植物，大部分生长在中国的西南部地区，栽培面积主要以云南居多。
灯盏花整株高约20-30cm左右。根状茎木质，根纤维状，颈部被残叶基。叶片集中在植株的底部呈莲座状生长；茎杆生有叶片2-4叶，且叶片无柄，圆披针形或狭叶披针形，茎秆上叶呈线形。花序头状，总苞绿色。舌状外围的雌花，花开展后为上中下3层，颜色为蓝或粉紫色，有光泽的花筒顶部全缘；中心为管状两性花，呈黄色，花基部窄呈漏斗状，花药长于花冠；瘦果狭长0.1-0.2cm，呈压扁状。花期通常为4-10月。
灯盏花在海拔1500-2400m的山坡、草地或林缘生长普遍。灯盏花从野生生长到人工栽培的时间不长，所以它对环境的适应及抗逆性都比较强，适宜温度在15-25℃之间，相对湿度60％-75％，年雨量650-1200mm，长日照对灯盏花的品质会有所提升。营养生长前期施加氮肥有利于营养器官的生长，抽薹开花后期施加磷肥有利于籽粒饱满。
灯盏花中含有的化学成分主要有黄酮类化合物，其中又以灯盏乙素最具代表性。目前，从灯盏花中分离出的黄酮及黄酮苷类成分已有20余个；灯盏花中还含有许多的咖啡酸酯类化合物，其中包括咖啡酸酯类化合物的同分异构体，迄今为止从灯盏花植株中共分离得到40余种咖啡酸酯类物质；还含有许多的挥发油成分，其中以长链状脂肪酸、环类、长链脂肪烷等居多。现今为止，从灯盏花中大概鉴定了出近80种挥发油类成分。除了黄酮及其苷类、咖啡酸酯类、挥发油之外，灯盏花中还含有香豆素类、植物甾醇、五环三萜类、氧杂蒽酮等多种成分。
灯盏花在现代医药方面具有不可替代的价值，以灯盏花总黄酮、灯盏花素、灯盏乙素和总咖啡酸酯等酚酸类化合物为基础生产的剂型有片剂、软胶囊、丸剂、注射液、滴丸等，药材市场原料需求量非常广泛，需求总量超过300万kg。灯盏花在心脑血管、骨科、及皮肤科都占有一定的地位，其中以治疗心脑血管类疾病为主，心脑血管疾病被称为世界上第四大疾病，因此也就迫切的需要大量的灯盏花原料药用来制备中成药，治疗疾病，所以灯盏花的市场需求量相比往年只会不断增加。
灯盏花的主要药用价值有解表散寒，祛风除湿，疏经活血，消积止痛等，主治心脑血管类疾病及其导致的瘫痪、脑后遗症等。但因为对野生灯盏花的盲目采集、以及引种栽培困难、品种退化等，使得药用灯盏花野生资源在不断减少，依靠采挖野生灯盏花的方式已经不能够满足人类临床需求和社会发展需要了，为了解决野生灯盏花无法提供需求这类问题，只有通过人工种植的方法来满足这类需求。
随着药用植物生物技术的迅速发展，特别是对植物细胞全能性的广泛认识，越来越多的人希望利用植物组织培养技术进行药用灯盏花无性系的快速繁殖和离体育苗，尤其是直接生产一些药用成分，以满足社会需求，为人类健康服务。
在灯盏花植物组培方面，大量文献表明，前研究人员用灯盏花花药培养诱导愈伤，以灯盏花幼叶诱导愈伤、继代和生根等探究，就不同激素及其不同浓度对灯盏花愈伤诱导的影响进行了更深层次的研究，以初步建立系统的灯盏花植物组织培养体系。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法，包括如下步骤：
步骤(1)，外植体的处理：取灯盏花幼嫩且叶缘完整无病害叶片，清洗并灭菌，然后将其切成小块；
步骤(2)，愈伤组织诱导培养：
将步骤(1)得到的叶片小块接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待愈伤组织膨大变绿，得到愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L；
步骤(3)，不定芽诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块后，接种至愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，然后将继代培养得到的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待芽生长健壮至2-3cm，得到灯盏花不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(4)，不定根诱导培养：
将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待根生长至2-3cm，得到生根苗；
所述的不定根诱导培养基为1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(5)，炼苗移栽：
将生根苗置于温室炼苗3d，取出生根苗清洗并消毒，将消毒后的生根苗假植到3-5cm厚的有机质土的苗盘中，在其上边覆盖一层塑料薄膜，并保持土面高水分，8-10d后揭开塑料薄膜，每3d浇水一次，并使用质量浓度为0.1％的农用复合肥水溶液每7d浇灌一次，揭膜后20d即可成苗定植于大田。
本发明农用复合肥优选采用史丹利用复合肥。
进一步，优选的是，步骤(1)中，清洗的方法为：
用洗涤剂搓洗叶面，自来水冲洗30min后，用多菌灵水溶液浸泡40min，自来水冲洗1h，将多菌灵冲洗干净后备用；
灭菌的方法为：
将清洗后的叶片放入体积浓度为75％的酒精中消毒30s，用无菌水冲洗干净后，在无菌操作台中将叶片用镊子转到浓度为0.1％的升汞溶液中边浸泡边摇晃，8min后取出，再次用无菌水清洗干净，再转到浓度为2％次氯酸钠溶液中不断摇晃10-15min，无菌水清洗干净后，吸干叶片外表附着的水分。
进一步，优选的是，步骤(1)中，将叶片切成1cm×1cm的小块。
进一步，优选的是，步骤(2)中，培养时，光照强度为800-1000LX；培养时间为30-40d。
进一步，优选的是，步骤(3)中，将步骤(2)得到的愈伤组织切成直径为0.4-0.6cm小块。
进一步，优选的是，步骤(3)中，继代培养时，光照强度为1300-1500LX；培养时间为40-50d；
接种至不定芽诱导培养基中培养时，光照强度为1300-1500LX；培养时间为40-60d。
进一步，优选的是，步骤(4)中，将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基培养时，光照强度为1300-1500LX；培养时间为40-50d。
进一步，优选的是，步骤(5)中，炼苗时间为3d；清洗并消毒的具体方法为：清水漂洗后，用0.1g/L多菌灵溶液浸泡消毒；保持土面高水分时，要求土面的湿度保持在50％-70％。
为了使灯盏花植物组织快速繁殖、建立再生苗体系，以及将次生代谢产物和组培苗投入工厂生产。并且还为灯盏花分子研究、遗传转化体系的建立提供数据支撑和理论基础。通过对愈伤组织、不定芽、不定根诱导进行三因素三水平试验设计。由SPSS软件进行分析方差分析结果表明：不同因素浓度(2,4-D、IAA、6-BA、NAA、KT、浓缩硅(东立信生物工程有限公司)对灯盏花诱导情况的影响极显著。Y7(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L)培养基配方的出愈伤情况最优；F9(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L)培养基配方诱导出不定芽情况最优；S7(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L)为不定根诱导最适培养基。在这几种处理中，Y7的因素组合对灯盏花愈伤诱导效果最好，出愈率达80％。F9的因素浓度配比对灯盏花愈伤诱发不定芽的影响最显著，不定芽诱导率为78％。S7所用的因素配比对灯盏花不定芽生根的影响最显著，不定根诱导率为87％。
本发明主要以现代生物科学理论的基础，结合栽培、育种等多个学科的原理，采用先进的生物技术和基因工程措施，以灯盏花为研究对象，本发明完成了灯盏花植物组织快速繁殖、建立再生苗体系，为次生代谢产物和组培苗投入工厂生产提供了基础。并且还为灯盏花分子研究、遗传转化体系的建立提供数据支撑和理论基础。以更好的认识灯盏花生命活动的规律，控制其生长发育，加快野生灯盏花材料的驯化繁殖，为人类生产实践服务。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
(1)组培时间上培养时间缩短，愈伤组织在加入浓缩硅后褐化现象消失，苗更健壮，抗逆行增强；
(2)愈伤组织在加入浓缩硅后褐化现象消失，苗更健壮，抗逆行增强；
(3)在本发明中，2,4-D与IAA在细胞水平上刺激了灯盏花叶片细胞的伸长生长，促进木质、韧皮部细胞分化，调节愈伤组织的形态建成；6-BA和NAA的共同作用，抑制了灯盏花叶片中叶绿素的分解，促进细胞分裂与扩大，不断生长，诱导形成不定芽；6-BA与KT的相互作用能促进细胞分裂，延缓离体组织衰老；诱导芽和不定根的分化及调整气孔张合度；
(4)在对灯盏花再生体系探究试验中，以1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.5mg/L+IAA 0.5mg/L为基础培养基进行培养，经过形态观察发现，在灯盏花叶片切片诱导愈伤组织培养时，长出的愈伤组织发生了褐化现象，后经过F7、F8、F9处理组培养基培养一段时间后的愈伤组织未出现褐化与玻璃化，数据分析后发现，硅离子肥(浓缩硅)在高浓度下可以防止褐化和玻璃化，且诱导出的不定芽叶片长势更好、更健康，未出现黄化；
(5)在试验中还发现，施硅离子肥后的灯盏花叶片颜色更绿，生长更健康。提高了抗病性和避免重金属离子的毒害，此外，施硅离子肥还增加了灯盏花茎秆的韧性，提高抗倒伏的能力，亦可以防止根系腐烂和早衰，从而促进灯盏花的营养生长；灯盏花再生苗的建立，为相关基因功能验证提供了数据支撑和材料；
(7)为灯盏乙素合成路径进一步探索的相关试验提供材料与方法，对一些野生灯盏花资源进行保护；通过再生植株的探究与建立，使一些具有高产药用成分的灯盏花种质资源进行稳定遗传；
(8)本发明方法能够为灯盏花分子研究、遗传转化体系的建立提供数据支撑和理论基础。
附图说明
图1为实验处理Y7因素组合诱导的愈伤组织图；；
图2为实验处理F9因素组合诱导的不定芽图；
图3为实验处理S7因素组合诱导的不定根图；其中，(a)为主视图，(b)为仰视图；
图4为移栽前生根苗的示意图；(a)为部分生根苗洗净后的示意图，(b)为局部放大图；
图5为假植到苗盘的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，外植体的处理：取灯盏花幼嫩且叶缘完整无病害叶片，清洗并灭菌，然后将其切成小块；
步骤(2)，愈伤组织诱导培养：
将步骤(1)得到的叶片小块接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待愈伤组织膨大变绿，得到愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L；
步骤(3)，不定芽诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块后，接种至愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，然后将继代培养得到的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待芽生长健壮至2.2-2.8cm，得到灯盏花不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(4)，不定根诱导培养：
将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待根生长至2.2-2.8cm，得到生根苗；
所述的不定根诱导培养基为1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(5)，炼苗移栽：
将生根苗置于温室炼苗3d，取出生根苗清洗并消毒，将消毒后的生根苗假植到4cm厚的有机质土的苗盘中，在其上边覆盖一层塑料薄膜，并保持土面高水分，9d后揭开塑料薄膜，每3天浇水一次，并使用质量浓度为0.1％的农用复合肥水溶液每7d浇灌一次，揭膜后20d即可成苗定植于大田。
实施例2
一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，外植体的处理：取灯盏花幼嫩且叶缘完整无病害叶片，清洗并灭菌，然后将其切成小块；
步骤(2)，愈伤组织诱导培养：
将步骤(1)得到的叶片小块接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待愈伤组织膨大变绿，得到愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L；
步骤(3)，不定芽诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块后，接种至愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，然后将继代培养得到的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待芽生长健壮至2-2.5cm，得到灯盏花不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(4)，不定根诱导培养：
将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待根生长至2-2.5cm，得到生根苗；
所述的不定根诱导培养基为1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(5)，炼苗移栽：
将生根苗置于温室炼苗3d，取出生根苗清洗并消毒，将消毒后的生根苗假植到3cm厚的有机质土的苗盘中，在其上边覆盖一层塑料薄膜，并保持土面高水分，8d后揭开塑料薄膜，每3天浇水一次，并使用质量浓度为0.1％的农用复合肥水溶液每7d浇灌一次，揭膜后20d即可成苗定植于大田。
步骤(1)中，清洗的方法为：
用洗涤剂搓洗叶面，自来水冲洗30min后，用多菌灵水溶液浸泡40min，自来水冲洗1h，将多菌灵冲洗干净后备用；
灭菌的方法为：
将清洗后的叶片放入体积浓度为75％的酒精中消毒30s，用无菌水冲洗干净后，在无菌操作台中将叶片用镊子转到浓度为0.1％的升汞溶液中边浸泡边摇晃，8min后取出，再次用无菌水清洗干净，再转到浓度为2％次氯酸钠溶液中不断摇晃10mim，无菌水清洗干净后，吸干叶片外表附着的水分。
步骤(1)中，将叶片切成1cm×1cm的小块。
步骤(2)中，培养时，光照强度为800LX；培养时间为30d。
步骤(3)中，将步骤(2)得到的愈伤组织切成直径为0.4cm小块。
步骤(3)中，继代培养时，光照强度为1300LX；培养时间为40d；
接种至不定芽诱导培养基中培养时，光照强度为1300LX；培养时间为40d。
步骤(4)中，将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基培养时，光照强度为1300LX；培养时间为40d。
步骤(5)中，炼苗时间为3d；清洗并消毒的具体方法为：清水漂洗后，用0.1g/L多菌灵溶液浸泡消毒；保持土面高水分时，要求土面的湿度保持在50％-60％。
实施例3
一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，外植体的处理：取灯盏花幼嫩且叶缘完整无病害叶片，清洗并灭菌，然后将其切成小块；
步骤(2)，愈伤组织诱导培养：
将步骤(1)得到的叶片小块接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待愈伤组织膨大变绿，得到愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L；
步骤(3)，不定芽诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块后，接种至愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，然后将继代培养得到的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待芽生长健壮至2.5-3cm，得到灯盏花不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(4)，不定根诱导培养：
将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待根生长至2.5-3cm，得到生根苗；
所述的不定根诱导培养基为1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(5)，炼苗移栽：
将生根苗置于温室炼苗3d，取出生根苗清洗并消毒，将消毒后的生根苗假植到5cm厚的有机质土的苗盘中，在其上边覆盖一层塑料薄膜，并保持土面高水分，10d后揭开塑料薄膜，每3天浇水一次，并使用质量浓度为0.1％的农用复合肥水溶液每7d浇灌一次，揭膜后20d即可成苗定植于大田。
步骤(1)中，清洗的方法为：
用洗涤剂搓洗叶面，自来水冲洗30min后，用多菌灵水溶液浸泡40min，自来水冲洗1h，将多菌灵冲洗干净后备用；
灭菌的方法为：
将清洗后的叶片放入体积浓度为75％的酒精中消毒30s，用无菌水冲洗干净后，在无菌操作台中将叶片用镊子转到浓度为0.1％的升汞溶液中边浸泡边摇晃，8min后取出，再次用无菌水清洗干净，再转到浓度为2％次氯酸钠溶液中不断摇晃15mim，无菌水清洗干净后，吸干叶片外表附着的水分。
步骤(1)中，将叶片切成1cm×1cm的小块。
步骤(2)中，培养时，光照强度为1000LX；培养时间为40d。
步骤(3)中，将步骤(2)得到的愈伤组织切成直径为0.6cm小块。
步骤(3)中，继代培养时，光照强度为1500LX；培养时间为50d；
接种至不定芽诱导培养基中培养时，光照强度为1500LX；培养时间为60d。
步骤(4)中，将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基培养时，光照强度为1500LX；培养时间为50d。
步骤(5)中，炼苗时间为5d；清洗并消毒的具体方法为：清水漂洗后，用0.1g/L多菌灵溶液浸泡消毒；保持土面高水分时，要求土面的湿度保持在60％-70％。
实施例4
一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，外植体的处理：取灯盏花幼嫩且叶缘完整无病害叶片，清洗并灭菌，然后将其切成小块；
步骤(2)，愈伤组织诱导培养：
将步骤(1)得到的叶片小块接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待愈伤组织膨大变绿，得到愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L；
步骤(3)，不定芽诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织切成小块后，接种至愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，然后将继代培养得到的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待芽生长健壮至2-3cm，得到灯盏花不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(4)，不定根诱导培养：
将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待根生长至2-3cm，得到生根苗；
所述的不定根诱导培养基为1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤(5)，炼苗移栽：
将生根苗置于温室炼苗3d，取出生根苗清洗并消毒，将消毒后的生根苗假植到4cm厚的有机质土的苗盘中，在其上边覆盖一层塑料薄膜，并保持土面高水分，9d后揭开塑料薄膜，每3天浇水一次，并使用质量浓度为0.1％的农用复合肥水溶液每7d浇灌一次，揭膜后20d即可成苗定植于大田。
步骤(1)中，清洗的方法为：
用洗涤剂搓洗叶面，自来水冲洗30min后，用多菌灵水溶液浸泡40min，自来水冲洗1h，将多菌灵冲洗干净后备用；
灭菌的方法为：
将清洗后的叶片放入体积浓度为75％的酒精中消毒30s，用无菌水冲洗干净后，在无菌操作台中将叶片用镊子转到浓度为0.1％的升汞溶液中边浸泡边摇晃，8min后取出，再次用无菌水清洗干净，再转到浓度为2％次氯酸钠溶液中不断摇晃13mim，无菌水清洗干净后，吸干叶片外表附着的水分。
步骤(1)中，将叶片切成1cm×1cm的小块。
步骤(2)中，培养时，光照强度为900LX；培养时间为35d。
步骤(3)中，将步骤(2)得到的愈伤组织切成直径为0.5cm小块。
步骤(3)中，继代培养时，光照强度为1400LX；培养时间为45d；
接种至不定芽诱导培养基中培养时，光照强度为1400LX；培养时间为50d。
步骤(4)中，将步骤(3)得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基培养时，光照强度为1400LX；培养时间为45d。
步骤(5)中，炼苗时间为4d；清洗并消毒的具体方法为：清水漂洗后，用0.1g/L多菌灵溶液浸泡消毒；保持土面高水分时，要求土面的湿度保持在50％-70％。
应用实例
1 实验方法
1.1 外植体的处理
以采摘实验室种子萌发栽培而来的生长旺盛的灯盏花为外植体，取幼嫩且叶缘完整无病害叶片，用洗涤剂轻轻搓洗叶面，自来水冲洗30min后，用多菌灵水溶液浸泡40min，自来水冲洗1h，将多菌灵冲洗干净后备用。
将清洗后的叶片放入事先紫外灭菌两小时以上的超净工作台中，将叶片放入75％的酒精中消毒30s后即刻取出，用无菌水冲洗，再将叶片放入0.1％的升汞溶液中边浸泡边轻轻摇晃，8min后取出，再次用无菌水清洗，后转入2％次氯酸钠溶液中不断摇晃10-15min，无菌水清洗4-5次，放在无菌滤纸上，吸干材料外表附着的水分。将灯盏花材料放在无菌滤纸上，用刀将其叶片切成1cm×1cm的小块。
1.2实验材料的预处理及灭菌
(1)配制基础培养基：培养基配方为1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+硅离子肥+不同浓度的激素。诱导不同的灯盏花愈伤、不定芽、不定根采用不同的激素配比。
(2)实验材料灭菌：超净工作台在使用前两小时用75％酒精擦拭，并开启紫外线照射灭菌。配好的培养基在高温灭菌锅(121℃20min)灭菌，总时长两小时，使用的镊子、刀片等也要用高温灭菌锅灭菌，且同时放在超净工作台内紫外灭菌两小时。
1.3外植体接种
将切好的灯盏花叶片1cm×1cm的小块，均匀接种在制备好的培养基上，每瓶培养基5片，叶片背面接触培养基。接种完后放在温度25℃组培室进行观察，观察瓶内不同因素浓度组合对灯盏花愈伤组织、不定芽及不定根的影响，通过对培养基内的灯盏花生长发育情况进行观察分析，探究促进灯盏花愈伤组织、不定芽及不定根作用最好的因素组合。
1.4愈伤组织诱导因素设计
试验以实验室种子萌发栽培而来的生长旺盛的灯盏花为外植体，以1/2MS为基础培养基，以激素2,4-D、IAA、硅离子肥及其组合对灯盏花愈伤组织诱导的影响为研究对象。设计三因素三水平的实验方案优化灯盏花愈伤体系。
本试验将三种因素设置成不同的3个浓度水平，其中2,4-D浓度水平为0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L，IAA浓度水平为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，浓缩硅浓度0.2ml/L、0.5ml/L、0.8ml/L，蔗糖15g/L，琼脂7.5g/L。将三因素三浓度组成9组并设置CK，与1/2MS基础培养基配成诱导培养基。接种正常生长的灯盏花叶片每瓶5片，每组培养基20瓶。在温度为25℃、光照强度为800-1000LX；培养时间为30-40d后转接到继代培养基中。定期观察灯盏花愈伤的生长情况，试验设计见表1。
表1影响灯盏花愈伤组织诱导的因素设计
注：CK为对照组
1.5不定芽诱导因素设计
将愈伤组织分切成直径0.5cm大小，转接到最优诱导培养基Y7中继代培养40-50d，以诱导出的生长旺盛、长势优良的愈伤进行诱芽实验。每组培养基20瓶，每瓶5颗。以1/2MS为基础培养基，以激素6-BA、NAA、硅离子肥为研究对象。设计三因素三水平的实验方案，优化灯盏花不定芽再生体系。
本试验将三种因素设置成不同的3个浓度水平，其中6-BA浓度水平为0.2mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L，NAA浓度水平为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，浓缩硅浓度水平为0.5ml/L、1.0ml/L、1.5ml/L，蔗糖15g/L，琼脂7.5g/L，活性炭0.5g/L。将三种因素的不同浓度分别组合成不同的9组与1/2MS基础培养基配成诱芽培养基并设置CK，接种愈伤后放入在温度为25℃、光照为1300-1500LX的条件下培养40-50d，定期观察灯盏花不定芽的生长情况。实验设计见表2。
表2影响灯盏花不定芽诱导的因素设计
注：CK为对照组
1.6灯盏花诱根因素设计
将所有未发或发芽的愈伤组织转移至最优诱芽培养基F9中培养，待其发芽且形成完整的茎叶，采用上述健康完整的灯盏花不定芽，进行生根诱导培养实验设计，并设置空白对照，见表3。
以1/2MS为基础培养基，以因素6-BA、KT和浓缩硅为研究对象。将因素浓度水平设置为6-BA：0.2mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L，KT：0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L，浓缩硅：0.5ml/L、1.0ml/L、1.5ml/L，蔗糖15g/L，琼脂7.5g/L，活性炭0.5g/L。将三种因素的不同浓度分别组合成9组并设置CK，与1/2MS基础培养基配成诱根培养基。接入正常生长的灯盏花不定芽每瓶5棵，每组培养基20瓶，在温度为25℃、光照为1300-1500LX的条件下培养40-50d。定期观察灯盏花不定根生长情况。
表3影响灯盏花诱导不定根的因素设计
注：CK为对照组
1.7炼苗移栽
将生根苗置于温室炼苗3-4d，取出生根苗，清水漂洗后，用0.1g/L多菌灵溶液浸泡消毒，将消毒后的生根苗假植到3-5cm厚的有机质土的苗盘中，在其上边覆盖一层塑料薄膜；并保持土面高水分(湿度保持在50％-70％)，8-10d后揭开塑料薄膜，适当施肥，经过20d的苗圃假植后即可成苗定植与大田。
2结果与分析
2.1影响灯盏花愈伤组织诱导因素设计的分析
根据诱导愈伤组织的因素设计，每组培养基20瓶每瓶5颗，培养40d后进行统计并记录。统计结果详见表4。
根据实验结果统计可以得出Y7(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D 0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L)培养基配方出愈伤情况最优，总出愈率达80％，其次为Y9(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D 0.7mg/L+IAA 1.5mg/L+浓缩硅0.5ml/L)出愈率达到75％、第三为Y3(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D 0.3mg/L+IAA 1.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L)出愈率为74％。
由表4可知，处理间F＝1580.398，概率P＝0.0001＜0.01，说明处理间差异极显著，即不同因素浓度(2,4-D、IAA、浓缩硅)对灯盏花出愈伤情况有极显著的作用。
表4灯盏花愈伤诱导情况多重比较
由表4可知处理Y7的出愈率最高，显著地高于处理Y2、Y4、Y6、Y8、CK；处理Y2、Y4、Y6、Y8没有显著性。极显著地高于Y1、CK，因此，在这几种处理中，Y7的因素组合对灯盏花愈伤诱导效果是最好的。愈伤长势情况如图1。
2.2影响灯盏花不定芽诱导因素设计的分析
根据灯盏花不定芽诱导的因素设计，每组培养基20瓶，每瓶5棵正常生长的不定芽，当不定芽在温度为25℃、光照为1500LX的条件下培养40d，观察并记录灯盏花愈伤的发芽情况，其实验结果统计见表5，用SPSS软件进行统计分析，结果见表5。
根据表5实验结果统计可以得出F9(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L)培养基配方诱导出不定芽情况最优，不定芽诱导率达78％，其次为F6(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA1.5mg/L+浓缩硅1ml/L)不定芽诱导率达到71％、第三为F7(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+NAA 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L)不定芽诱导率为59％。
通过表5可知，处理间p值＝0.0001＜0.01，说明不同因素(即6-BA、NAA、浓缩硅)配比对灯盏花愈伤诱导发生不定芽的影响极显著。
表5灯盏花不定芽诱导情况多重比较
通过表5可知，处理组F9的不定芽诱导率最高，显著高于F7，极显著的高于除F7以外其他各处理组，说明F9的因素浓度配比对灯盏花愈伤诱发不定芽的影响最显著。不定芽诱导率最高为78％。不定芽的发生情况见图2。
2.3影响灯盏花不定根诱导因素设计的分析
根据灯盏花不定根诱导的因素设计，以1/2MS为基础培养基，以因素6-BA、KT和硅离子肥为研究对象。每组培养基20瓶，每瓶5棵正常生长的组培苗，放入恒温弱光组培室培养40d后。观察灯盏花不定根的生长情况并记录，其实验结果见表6，用SPSS软件进行方差分析，结果见表6。
由表6实验结果统计可以得出S7(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L)培养基配方诱导出不定根情况最优，总生根率达87％，其次为S6(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+KT1.5mg/L+浓缩硅1ml/L)生根率达到77％、第三为S9(1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+KT 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L)不定根诱导率为66％。
通过表6可知，处理间p值＝0.0001＜0.01，说明不同因素(即6-BA、KT、浓缩硅)配比对灯盏花诱导生根的影响极显著。
表6灯盏花不定根诱导生根的多重比较
通过表6可知，处理组S7不定根诱导率最高，显著地高于S6，极显著地高于S1、S2、S3、S4、S5、S8、S9和CK，且S3、S4、S9不具有显著性。说明S7所用的因素配比对灯盏花不定芽生根的影响最显著，不定根诱导率最高为87％，发芽生根情况见图3。
2.4炼苗及移栽
将生根苗置于温室内炼苗，3d后将组培瓶内的生根苗取出，用清水漂洗干净，再用0.1g/L多菌灵溶液浸泡2至3分钟进行消毒，再用清水涮洗2至3次，阴干叶片水分，处理后的灯盏花苗如图4示。
将经过多菌灵消毒后的生根苗假植到铺有机制土3-5cm厚的苗床上，按时浇水，适当施肥，保持土面含有较高的水分，经过20-30天的苗圃假植后即可成苗定植于大田内，苗圃移栽如图5所示。
前人研究表明，一株灯盏花成苗，需历时一年的时间，而本发明仅需6-7个月。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），外植体的处理：取灯盏花幼嫩且叶缘完整无病害叶片，清洗并灭菌，然后将其切成小块；
步骤（2），愈伤组织诱导培养：
将步骤（1）得到的叶片小块接种至愈伤组织诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待愈伤组织膨大变绿，得到愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D0.7mg/L+IAA 0.5mg/L+浓缩硅0.8ml/L；
步骤（3），不定芽诱导培养：
将步骤（2）得到的愈伤组织切成小块后，接种至愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，然后将继代培养得到的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待芽生长健壮至2-3cm，得到灯盏花不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为：1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.8mg/L+NAA 1mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤（4），不定根诱导培养：
将步骤（3）得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基中，于25℃条件下进行培养，待根生长至2-3cm，得到生根苗；
所述的不定根诱导培养基为1/2MS基础培养基+蔗糖15g/L+琼脂7.5g/L+活性炭0.5g/L+6-BA 0.2mg/L+KT 1.5mg/L+浓缩硅1.5ml/L；
步骤（5），炼苗移栽：
将生根苗置于温室炼苗3d，取出生根苗清洗并消毒，将消毒后的生根苗假植到3-5cm厚的有机质土的苗盘中，在其上边覆盖一层塑料薄膜，并保持土面高水分，8-10d后揭开塑料薄膜，每3天浇水一次，并使用质量浓度为0.1%的农用复合肥水溶液每7d浇灌一次，揭膜后20d即可成苗定植于大田。
2.根据权利要求1所述的灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，步骤（1）中，清洗的方法为：
用洗涤剂搓洗叶面，自来水冲洗30min后，用多菌灵水溶液浸泡40min，自来水冲洗1h，将多菌灵冲洗干净后备用；
灭菌的方法为：
将清洗后的叶片放入体积浓度为75%的酒精中消毒30s，用无菌水冲洗干净后，在无菌操作台中将叶片用镊子转到浓度为0.1%的升汞溶液中边浸泡边摇晃，8min后取出，再次用无菌水清洗干净，再转到浓度为2%次氯酸钠溶液中不断摇晃10-15min，无菌水清洗干净后，吸干叶片外表附着的水分。
3.根据权利要求1所述的灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，步骤（1）中，将叶片切成1cm×1cm的小块。
4.根据权利要求1所述的灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，步骤（2）中，培养时，光照强度为800-1000LX；培养时间为30-40d。
5.根据权利要求1所述的灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）得到的愈伤组织切成直径为0.4-0.6cm小块。
6.根据权利要求1所述的灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，步骤（3）中，继代培养时，光照强度为1300-1500LX；培养时间为40-50d；
接种至不定芽诱导培养基中培养时，光照强度为1300-1500LX；培养时间为40-60d。
7.根据权利要求1所述的灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，步骤（4）中，将步骤（3）得到的灯盏花不定芽至不定根诱导培养基培养时，光照强度为1300-1500LX；培养时间为40-50d。
8.根据权利要求1所述的灯盏花植物组织培养及植株再生方法，其特征在于，步骤（5）中，炼苗时间为3-5d；清洗并消毒的具体方法为：清水漂洗后，用0.1g/L多菌灵溶液浸泡消毒；保持土面高水分时，要求土面的湿度保持在50%-70%。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06153730A (ja) * | 1992-11-24 | 1994-06-03 | Mitsubishi Agricult Mach Co Ltd | イグサのカルス再分化法 |
| CN105075860A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-11-25 | 云南植物药业有限公司 | 一种灯盏花组培育苗方法 |
| CN106119276A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-16 | 云南纳博生物科技有限公司 | 一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06153730A (ja) * | 1992-11-24 | 1994-06-03 | Mitsubishi Agricult Mach Co Ltd | イグサのカルス再分化法 |
| CN105075860A (zh) * | 2015-08-06 | 2015-11-25 | 云南植物药业有限公司 | 一种灯盏花组培育苗方法 |
| CN106119276A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-16 | 云南纳博生物科技有限公司 | 一种建立农杆菌介导灯盏花高效转染体系的方法 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| Callus induction and adventitious shoot regeneration from petiole of Erigeron breviscapus;Zhang L等;Plant production science;20071231;第10卷(第3期);第343-345页 * |
| Regenerating plants from in vitro culture of Erigeron breviscapus leaves;Xing Z Y等;African Journal of Biotechnology;20101231;第9卷(第26期);第4022-4024页 * |
| 灯盏细辛的组织培养与快速繁殖;吴毅歆等;植物学通报;20051231;第22卷(第1期);第54-57页 * |
| 灯盏细辛离体叶片再生植株的研究;董志渊等;中国林副特产;20140831(第4期);第5-8页 * |
| 灯盏花组培快繁与植株再生;林丽飞;陶发清;胡先奇;金秋;吴丹;白学贵;熊力军;;安徽农业科学;20090210(04);第1580-1581页 * |
| 灯盏花组织培养初步研究;杨耀文, 钱子刚, 段敏;云南中医学院学报;20020630(02);第12-13页 * |
| 灯盏花组织培养研究;杨生超;吕红;杨建文;杨允辉;;种子;20060525(05);第24-26页 * |
| 药用植物灯盏细辛组织培养分析;赵瑜君等;分子植物育种;20230303;第21卷(第15期);第5058-5065页 * |
| 药用植物灯盏花组织培养体系的建立;林丽飞等;西南大学学报（自然科学版）;20091231;第31卷(第12期);第82-86页 * |
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| Publication number | Publication date |
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