CN101358197A - 一种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种杜仲毛状根诱导生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，遗传转化获得可生产桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根，其过程是用发根农杆菌遗传转化杜仲，获得了杜仲毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的杜仲毛状根能够生产桃叶珊瑚甙。本方法可以为药用成分桃叶珊瑚甙的生产提供一种新型可持续的新型药源。

Description

一种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法

技术领域

本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，具体涉及发根农杆菌遗传转化杜仲并获得产桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根的具体程序。本发明还提供利用基因工程技术获得的高产桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根及其培养的子代。

背景技术

植物次生代谢产物具有十分重要的经济学功能，在工农业生产和人们的日常生活中具有广阔的应用前景，其中在天然药物开发中的地位尤为引人瞩目，然而至今仍没有找到有效的或成熟的合成方法。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长迅速、、合成次生代谢物质能力强且遗传稳定性稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。

目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的毛状根的相关研究较多，但对遗传转化杜仲获得产环烯醚萜类药用成分毛状根的研究仍是空白。杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)为杜仲科植物，是我国特有经济林木和名贵药用植物。近年来药理上已证实杜仲在心血管系统、免疫系统、消化系统、性激素样作用和抗菌保肝防癌等方面有较好的药理作用而被广泛用于医疗事业。但由于人们超量滥挖，绝大部分地区杜仲濒临灭绝，加之杜仲生长周期长，恢复生产非一时能够见效。因而，寻找新的药源十分必要。毛状根具有生长迅速、遗传稳定、能在无激素的培养基上生长等特点，并且还能够合成与原植物含量相当或高于原植物含量的次生代谢产物，在植物细胞工程领域具有较大的优势。因此毛状根培养已成为近年来发展起来的生产药用植物有效次生代谢物的理想培养系统。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种转基因技术遗传转化杜仲获得产药用成分桃叶珊瑚甙的毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入杜仲中，获得杜仲毛状根。

本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法转化的宿主细胞，这种经转化的宿主细胞发育为毛状根。在实例中该宿主细胞是杜仲。

本发明的技术方案如下：

一种获得产桃叶珊瑚甙杜仲毛状根的方法和利用该方法获得的产桃叶珊瑚甙的杜仲毛状根，该毛状根是一种采用本发明所述方法创造的新生命体。

该方法步骤如下：

1、杜仲无菌外植体的获得；

2、采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到杜仲细胞、组织、器官或植株中；其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化；包括以下步骤：

A、活化发根农杆菌；

B、用发根农杆菌浸染杜仲无菌外植体；

C、发根农杆菌与杜仲无菌外植体的共培养，步骤如下：

I、将侵染后的杜仲外植体接种于添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的MS固体培养基上；

II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养1～5天；

D、外植体的除菌培养：

3、杜仲毛状根的获得与继代培养；

4、杜仲毛状根的分子检测，方法如下：

A、提取杜仲毛状根DNA；

B、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

C、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

D、电泳检测目标条带；

5、杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙的含量检测。

用上述方法获得的生命体，它是可生产环烯醚萜类药用成分的杜仲毛状根。

在本发明中，术语“生命体”指杜仲的细胞、组织、器官、植株。

在本发明中，术语“任何转基因方法”包括发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。

在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指用在离体培养的条件下根据毛状根的特殊形态学特征初步鉴定转化子；可以使用PCR、Southem杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。

在本发明中，术语“在适合的条件下培养杜仲毛状根”是指对经过鉴定的杜仲毛状根离体培养，并检测桃叶珊瑚甙的含量，筛选桃叶珊瑚甙含量提高的优良转化子进行培养，获得其后代。

在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入杜仲细胞获得转化毛状根，通过筛选优良无性系，获得桃叶珊瑚甙含量相对较高而稳定的毛状根无性系，为桃叶珊瑚甙的生产提供一种新型优质的可持续使用的药源。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

杜仲无菌外植体的获得

方法：利用外植体建立杜仲无菌外植体

大小均匀一致的当年生新鲜杜仲种子(弃种皮)，0.4mg·L^-1赤霉素(GA)浸泡24小时；然后用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡12分钟，无菌水冲洗5次；接着用无菌纸吸干表面水分，并将其接种在基本培养基中(培养基盛于150mL三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS+0.4mg·L^-1 GA，30g·L^-1蔗糖，pH值为5.8，再添加7.5g·L^-1的琼脂粉。在光照培养箱中培养杜仲的叶片，培养条件为：25℃，12h·d^-1光照，光照强度为55μmol·m^-2·s^-1。40天后，杜仲种子经过吸胀、露白和成苗三个阶段，诱导获得无菌的杜仲无菌幼苗，待其枝叶着生完全后可用于遗传转化。

实施例2

发根农杆菌遗传转化杜仲获得毛状根

1、发根农杆菌C58C1(西南大学生物工程与生物技术教研室培养)。使用前自超低温冰箱取出200μl，接种于25ml YEB液体培养基中(添加利福平终浓度为40mg·L^-1)，28℃，200rpm振荡培养两次，复苏菌体。

2、第二次活化培养结束两小时前加入乙酰丁香酮，使其终浓度达到100μmol·L^-1也即菌液OD₆₀₀＝0.3时，加入乙酰丁香酮，继续28℃，200rpm振荡培养，菌液OD₆₀₀＝0.5时，可用于转化。

3、室温下4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体用等体积MS液体培养基(含100μmol·L^-1乙酰丁香酮)悬浮，在28℃，200rp振荡培养30分钟，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.6左右，成为转化液，此时可用于杜仲的遗传转化；1、2、3个步骤称为活化发根农杆菌。

4、发根农杆菌与杜仲的共培养：取无菌杜仲幼嫩真叶、子叶和胚轴各30份左右，用无菌解剖针戳一些圆形伤口，放入上述转化液中，浸染5～25分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接种于添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养1～5天，培养条件为：25℃，无光照。

5、杜仲的除菌培养：共培养结束后，在无菌吸水纸上吸干外植体上多余水分，转移至无植物生长调节物的MS固体除菌培养基(添加500mg·L^-1头孢菌素以达到除菌的目的)中培养，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。10天后，在杜仲受伤的部位开始出现毛状根。

6、杜仲毛状根的获得与继代培养：外植体每隔3天转入新鲜的同样的培养基中，待转化外植体上诱导出的毛状根长到5cm左右时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2MS固体培养基上(添加500mg·L^-1头孢菌素以达到除菌的目的)继代培养；在无植物生长调节物的1/2MS固体培养基上生长的杜仲毛状根表现出毛状根特有的形态学特征：生长十分迅速、分枝很多、生长失去向地性。以后每15～20天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除；然后分别转入1/2MS、1/2MS+IBA 0.2mg·L^-1固体培养基和1/2MS液体培养基上继代培养。

实施例3

杜仲毛状根的分子检测

1、杜仲毛状根基因组DNA的提取，方法如下：

(1)取200mg液体培养两周的毛状根，过滤后用10mL蒸馏水洗涤，充分吸干，液氮速冻，研磨成粉。

(2)1.5mL Eppendorf管中，加500μL抽提buffer(3％巯基乙醇)，充分震荡65℃水浴50分钟，每5分钟颠倒混匀。

(3)4℃、12,000rpm，离心10分钟。

(4)吸上清，加500μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟钟至分层。

(5)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(6)吸上清约350μL，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

(7)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(8)吸上清约250μL，加2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，充分混匀，室温放置10分钟见有絮状DNA析出。

(9)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(10)弃上清，沉淀用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置10分钟，使乙醇挥发完全。

(11)加1μL RNAase，50μL TE，混匀，37℃水浴30-40分钟。

(12)加40μL氯仿，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

(13)室温，12,000rpm，离心10分钟。

(14)吸取上清(约35μL)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。

抽提缓冲液配方如下：

100mM            Tris-HCl(pH8.0)

2.5％(V/V)       巯基乙醇

500mM            NaCl

20mM             EDTA

1.5％(W/V)       SDS

2、杜仲毛状根中rolB和rolC基因的PCR检测

诱发并维持毛状根形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。基因检测的PCR引物：rolB(423bp)的引物为：frolB(5’-GCT CTT GCA GTG CTA GATTT-3’)，见序列表1，rrolB(5’-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3’)，见序列表2；rolC(626bp)的引物为：frolC(5’-TAA CAT GGC TGA AGA CGA CC-3’)，见序列表3，rrolC(5’-AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC-3’)，见序列表4。

反应体系均为(25μL)：ddH₂O 18μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL₂ 2.0μL，10mmol·L^-1 dNTP mix 0.25μL，10mmol/L primerl 0.25μL，10mmol/L primer 20.25μL，Taq DNA polymerase 0.25μL(1.25U)，Template基因组DNA 1.5μL。

PCR反应程序：94℃ 5min→35循环(94℃ for 40sec→55℃ for 40sec→72℃ for1min)→72℃ 8min。阳性对照为相应的工程菌，杜仲的天然叶片作为阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolb的扩增条带大小为423bp，rolc为626bp。

实施例4

杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙含量与野生根中的含量比较

1、桃叶珊瑚甙对照品的HPLC标准曲线的制作

Waters高效液相色谱仪：Waters 1525型泵，Waters 2487型检测池。色谱条件：色谱柱为COSMOSIL C₁₈-PAQ柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈-水相(85∶15)，其中水相为水-四氢呋喃(THF)-H₃PO₄(85∶12∶0.3)，流速为1.0mL/min，检测波长为210nm。标准曲线绘制：桃叶珊瑚甙标准品(购自sigma公司)，以1000、500、250、100、50、25、10、5μg·mL^-1标准液作HPLC分析。每一浓度进样三次记录图谱及色谱参数，分别以峰面积和进样量(μg·mL^-1)进行线性回归，以进样量为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2、杜仲中桃叶珊瑚甙含量的测定

通过分子检测且长势良好的杜仲毛状根称取鲜重后于50℃下烘干，称重后研磨成粉，称取150mg毛状根干粉用10mL 72％的乙醇水溶液超声破碎(60kHz)30min，过滤，重复一次，合并滤液。滤液于旋转蒸干仪上浓缩蒸干(50℃)，用甲醇(色谱级)定容至10mL，-20℃保存，作为供试样品溶液。对照为以同样方法提取的自然杜仲根及皮供试样品溶液。样液于测定前用0.45μm微孔滤膜过滤备用。

HPLC含量测定结果为：杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙的含量最高达30.105μg·g^-1 DW，高于自然根及皮；在三种培养方式中，液体培养的毛状根系生物量增长最快，桃叶珊瑚甙含量最高，1/2MS+IBA固体培养的毛状根系较1/2MS固体培养的毛状根系而言生物量大，但是其桃叶珊瑚甙含量远不如1/2MS固体培养的毛状根系。可见杜仲毛状根的诱导和培养技术是获取桃叶珊瑚甙的高效策略。

序列表

<110>西南大学

<120>一种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法

<130>无

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gctcttgcag tgctagattt    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gaaggtgcaa gctacctctc    20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

taacatggct gaagacgacc    20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aaacttgcac tcgccatgcc    20

Claims (4)

1.一种杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化杜仲的细胞、组织、器官或植株，其步骤如下：

(1)杜仲无菌外植体的获得；

(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到杜仲细胞、组织、器官或植株中；其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化；包括以下步骤：

A、活化发根农杆菌；

B、用发根农杆菌浸染杜仲无菌外植体；

C、发根农杆菌与杜仲无菌外植体的共培养，步骤如下：

I、将侵染后的杜仲外植体接种于添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮的MS固体培养基上；

II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养1～5天；

D、外植体的除菌培养：共培养结束后，在无菌吸水纸上吸干外植体上多余水分，转移至无植物生长调节物的MS固体除菌培养基中培养，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养，10天后，在杜仲受伤的部位开始出现毛状根；

(3)杜仲毛状根的获得与继代培养；

外植体每隔3天转入新鲜的同样的培养基中，待转化外植体上诱导出的毛状根长到5cm左右时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2MS固体除菌培养基上继代培养；以后每15～20天继代培养一次，继代5次后，去除农杆菌；然后分别转入1/2MS、1/2MS+IBA 0.2mg·L^-1固体培养基和1/2MS液体培养基上继代培养；

(4)杜仲毛状根的分子检测，方法如下：

A、提取杜仲毛状根DNA；

B、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

C、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

D、电泳检测目标条带；

(5)杜仲毛状根中桃叶珊瑚甙的含量检测。

2、根据权利要求1所述的杜仲毛状根诱导和培养生产药用成分桃叶珊瑚甙的方法，特征在于，在杜仲毛状根的分子检测步骤中基因检测的PCR引物：rolB的引物为：frolB(5’-GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT-3’)，见序列表1，rrolB(5’-GAA GGT GCAAGC TAC CTC TC-3’)，见序列表2；rolC的引物为：frolC(5’-TAA CAT GGC TGAAGA CGA CC-3’)，见序列表3，rrolC(5’-AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC-3’)，见序列表4；反应体系均为：ddH₂O 18μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL₂ 2.0μL，10mmol·L^-1dNTP mix 0.25μL，10mmol/L primerl 0.25μL，10mmol/L primer2 20.25μL，Taq DNA polymerase 0.25μL，Template基因组DNA 1.5μL。

3.用权利要求1或2所述方法获得产桃叶珊瑚甙的杜仲的毛状根，其特征在于其基因组中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因。

4.用权利要求3所述方法获得杜仲毛状根的后代。