CN112931227A - 一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法 - Google Patents
一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法，属于木本植物组织培养技术领域。本发明提供的以杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5‑2mg/L6‑BA+1.0‑2.0mg/LIAA+25‑35g/L蔗糖+8‑10g/L琼脂，pH为5.8‑6。本发明提供的可以通过杜仲的根、茎、种胚多个部位进行植株再生的方法，具有更广泛的应用范围，可以根据需要，选择相应的部位进行再生，得到的组培再生幼苗具有相应的优良性状，培育出的组培苗苗龄，生长状态保持一致且良好，不易染菌，不易褐化，分化率和生根率较高。
Description
技术领域
本发明属于木本植物组织培养技术领域，尤其涉及一种杜仲各部位全株诱导植物再生及构建转基因植株再生体系的方法。
背景技术
杜仲(学名Eucommia ulmoides Oliver)，又名胶木，为杜仲科杜仲属植物，树高可达20米，胸径约50厘米，是我国野生药用和经济植物资源。我国每年对于天然橡胶的需求量极高，每年消费的天然橡胶量位列世界首位。我国天然橡胶主要以海南的三叶橡胶为原材料。三叶橡胶为热带植物，在我国适合其生长的地区很少，只能在海南，西双版纳等地区栽培，并且产量已经达到上限，所以目前我国三叶橡胶资源匮乏。为了满足国内的橡胶需求，我国严重依赖于进口橡胶。而杜仲植物的果实、树皮、叶和根中均含有丰富的结构为反式聚异戊二烯的杜仲胶，具有热塑性、热弹性和橡胶弹性等优点，可以作为海南三叶橡胶的替代资源，成为我国天然橡胶的战略储备资源。由于杜仲具有较高经济价值，近年来大批量的培养也成为现在比较值得关注的问题，但杜仲属于木本植物，传统的种植对生长环境条件要求较高，生长周期长。现阶段杜仲胶的产量过低而生产成本相对过高，这在很大程度上制约了杜仲胶的应用和产业的发展。
如今植物组培技术日益成熟，可以从植物中分离出具有优良性状或携带目的基因的组织、器官、细胞或原生质体等，在人工控制条件下进行培养，获得再生的完整植株。但目前杜仲的植物组培技术还停留在扦插，嫁接等阶段。扦插，嫁接的植物组培技术存在生根率、出芽率低等弊端，所以杜仲的植物组培技术还有待完善。建立各个部位的再生体系，可以高效，快速得到完整的杜仲组培植株。因此建立杜仲各个部位的再生体系，对于推动我国杜仲产业的发展十分重要。
植物组织再生技术可以通过对植株的不同部位再生幼苗，由此得到性状优良，苗龄一致，长势均一的杜仲组培苗。不同部位再生出的幼苗具有不同的性状特点，再生效率也各不相同。因此可以根据需要，挑选不同的植株部位进行再生，最终得到所需性状的植株。例如一些植物基因具有组织特异性，可以针对不同组织基因的表达情况进行幼苗再生，得到相关基因表达量较高的植株。再比如，植株不同部位积累的次生代谢产物有可能不同，可以通过单个部位的植物组织再生，得到某种次生代谢产物积累较高的再生植株。所以植物各部位全株诱导植物再生的方法，为相关的科学研究提供良好的技术手段，也对于生产实践领域具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，以杜仲根，茎，种胚为外植体高效诱导获得杜仲再生苗，并且成活率高、周期短，可显著提高杜仲的再生效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L 6-BA+1.0-2.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
优选的，所述以杜仲种胚诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+4.5-5.5mg/L 2,4-D+0.4-0.6mg/L ZT+480-520mg/L脯氨酸+480-520mg/L谷氨酰胺+14-16g/L葡萄糖+28-30g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
优选的，所述以杜仲茎部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
优选的，所述以杜仲根部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+2-2.5mg/L 6-BA+1-1.5mg/L NAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/L LH+30-40g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
优选的，所述生根培养的培养基为：基础培养基+30-35g/L蔗糖，pH为5.8-6。
本发明还提供了一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法，包括如下步骤：将含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液注射到上述任意一项所述方法获得的杜仲再生幼苗的茎部，待杜仲幼苗茎部伤口处的愈伤组织分化为再生毛状根，以再生毛状根为外植体，组织培养，直至获得完整的杜仲转基因幼苗。
优选的，所述注射的位置位于幼苗原始毛状根系上方0.5-1.5cm处的茎部。
优选的，所述组织培养的愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2-2.5mg/L 6-BA+1-1.5mg/L NAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。
优选的，所述组织培养的愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.0-1.5mg/L 6-BA+1.0-1.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。
优选的，所述组织培养的生根培养基为：基础培养基+30-35g蔗糖，pH为5.8-6。
本发明的有益效果：
本发明可以通过杜仲的根，茎，种胚多个部位进行植株再生，具有更广泛的应用范围。而且可以根据需要，选择相应的部位进行再生，得到的组培再生幼苗具有相应的优良性状。经本发明的方法培育出的组培苗苗龄一致，生长状态保持一致且良好，不会染菌，不易褐化，分化率和生根率均较高。
本发明提供的获得杜仲转基因植株再生体系的方法，通过发根农杆菌注射完成杜仲根系转基因，并通过根系的再生体系，将其快速高效的培养成为转基因植株，操作简单，转化率和成活率都很高。
附图说明
图1为杜仲根部再生不同阶段的生长状态，其中A为转基因根愈伤组织诱导，B为愈伤组织生长，C为愈伤组织分化前期出现个别小芽，D为愈伤组织分化后期长出很多嫩芽，E为芽继续分化为幼苗，F为幼苗生根；
图2为杜仲茎部再生不同阶段的生长状态，A为茎部愈伤组织诱导，B为愈伤组织生长，C为愈伤组织分化前期出现个别小芽，D为愈伤组织分化后期长出很多嫩芽，E为芽继续分化为幼苗，F为幼苗生根；
图3为杜仲种胚再生不同阶段的生长状态，A为种胚愈伤组织诱导，B为愈伤组织生长，C为愈伤组织分化前期出现个别小芽，D为愈伤组织分化后期长出很多嫩芽，E为芽继续分化为幼苗，F为幼苗生根；
图4为杜仲转基因毛状根系的RT-PCR和蛋白质印迹分析，CK为对照，T1和T2表示两个转基因系；
图5为杜仲根，茎，种胚的愈伤组织诱导率、分化率、生根率和杜仲根部转基因结果。
具体实施方式
本发明提供了一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L 6-BA+1.0-2.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
在本发明中，以杜仲种胚诱导获得再生植株，为植物遗传育种、次生代谢产物提供原料。以植物茎部诱导获得再生植株，为提高木本植物材性、生长量等以及植物抗倒伏能力相关研究提供技术手段。以植物根部诱导获得再生植株，为植物抗逆反应机制以及植物与根际微生物之间的相互作用等研究奠定基础。以发根农杆菌介导的Hairy root杜仲根系转基因，并通过根系的再生体系，将其快速高效的培养成为转基因植株，为基因系统功能分析，基因功能的验证提供技术支撑。本发明以杜仲种胚、茎部或根部诱导、分化、生根获得杜仲再生植株的不同阶段的生长状态示意图分别如图1、图2和图3所示。
在本发明中，以杜仲种胚诱导获得愈伤组织时，对于杜仲种胚材料的处理方式没有特殊限定，采用本领域常规获取和处理种胚材料的方式均可，在本发明优选的实施例中，对杜仲种胚材料进行如下处理：先剪去种胚两端尖端，再将剩余部分正中间划出伤口待用，更优选的，对杜仲种胚材料进行处理之前还需进行如下消毒处理：取当年成熟饱满的杜仲种子，正中间剪开杜仲种子外壳，无菌环境下，在75％的酒精中浸泡30s，次氯酸钠中浸泡5分钟，无菌水清洗5次。在本发明中，以杜仲种胚诱导获得愈伤组织的诱导培养基优选为：基础培养基+4.5-5.5mg/L 2,4-D+0.4-0.6mg/L ZT+480-520mg/L脯氨酸+480-520mg/L谷氨酰胺+14-16g/L葡萄糖+28-30g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6，更优选为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，所述ZT均为灭菌后加入。
在本发明中，以杜仲茎部诱导获得愈伤组织时，对于杜仲茎部的来源以及处理方式没有特殊限定，在本发明优选的实施例中，选择30d苗龄的杜仲组培幼苗为实验材料，更优选的需对杜仲茎部材料进行如下处理：无菌环境下，将组培瓶中的杜仲植株取出，分离出茎，将所有叶片剪掉，留下茎段，在每个芽点上下各5mm位置垂直于茎方向剪开待用。在本发明中，以杜仲茎部诱导获得愈伤组织的诱导培养基优选为：基础培养基+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6，更优选为基础培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。
在本发明中，以杜仲根部诱导获得愈伤组织时，对于杜仲根部的处理方式没有特殊限定，在本发明优选的实施例中，采用如下处理方式：无菌环境下，将杜仲植株分离出根，切割成4-6mm的根段待用。在本发明中，以杜仲根部诱导获得愈伤组织的诱导培养基优选为：基础培养基+2-2.5mg/L 6-BA+1-1.5mg/L NAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/L LH+30-40g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6，更优选为：基础培养基+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。
在本发明中，以杜仲种胚、茎部和/或根部为外植体，分别在杜仲的种胚、茎部和/或根部愈伤组织诱导培养基中进行杜仲愈伤组织的诱导，25-30天后，待愈伤组织生长成熟，转移至愈伤组织分化培养基中继续培养。在本发明中，所述分化培养基优选为基础培养基+1.5mg/L 6-BA+2.0mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。30-60天愈伤组织分化成幼苗，最后转移至生根培养基中，30-35天生根。在本发明中，所述生根培养基优选为：基础培养基+30-35g/L蔗糖，pH为5.8-6，更优选为基础培养基+30g/L蔗糖，pH＝5.8。在本发明所述杜仲各部位全株诱导植物再生的方法中，杜仲愈伤组织诱导，分化，生根培养的温度优选为23-27℃，更优选为24-26℃，光照周期优选为16h，光照强度优选为1800Lx。本发明对于各培养基中的基础培养基的组分没有特殊限定，采用本领域常规基础培养基均可，在本发明具体的实施例中，所述基础培养基包括：硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、碘化钾、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、肌醇、琼脂、蔗糖。
本发明还提供了一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法，包括如下步骤：将含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液注射到上述任意一项所述方法获得的杜仲再生幼苗的茎部，待杜仲幼苗茎部伤口处的愈伤组织分化为再生毛状根，以再生毛状根为外植体，组织培养，直至获得完整的杜仲转基因幼苗。
本发明对于目标基因和载体的种类没有特殊限定，采用本领域常规目标基因和相应的载体均可，在本发明具体实施例中，为了方便后续对转基因根进行筛选，将目的基因设定为绿色荧光蛋白(GFP)，相应的载体选择pROK2。在本发明中，所述发根农杆菌的菌株优选的包括K599、MSU440、C58C1或ArA4，更优选的为K599。本发明对于将含目标基因重组载体导入至发根农杆菌的具体方式没有特殊限定，采用本领域常规导入方式均可。导入成功后，将含重组载体的发根农杆菌的菌液离心，将沉积的菌体重悬，可得含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液，在本发明中，所述发根农杆菌悬浮液的OD600值优选为0.1-0.5，更优选为0.2-0.4，最优选为0.3。
本发明对于注射的量没有特殊限定，采用本领域常规注射用量均可。在本发明中，注射的位置优选为位于幼苗原始毛状根系上方0.5-1.5cm处的茎部，更优选为位于幼苗原始毛状根系上方1-1.5cm处的茎部。注射后，继续在原本基质中生长，培养方法同注射前，培养温度优选为25℃，光照周期优选为16h，光照强度优选为1800Lx。注射后12-15d，杜仲幼苗茎部伤口处生长出愈伤组织，继续培养7-10d，愈伤组织分化为再生毛状根。
将再生毛状根剪下作为外植体，以再生毛状根为外植体进行组织培养之前，优选的再生毛状根要在无菌环境下进行消毒，所述消毒的方式优选为，超净台中，将再生毛状根在75％的酒精中浸泡30s，次氯酸钠中浸泡5分钟，无菌水清洗5次。消毒完毕后，可将毛状根分段剪开待用。作为一种实施方式，所述根段剪的长度为0.9-1.1cm。
将备好的杜仲转基因根材料进行组织培养，所述组织培养的温度优选为23-27℃，更优选为25-26℃，光照周期优选为16h，光照强度优选为1800Lx。将备好的杜仲转基因根材料在无菌环境下接种到愈伤组织诱导培养基中，7-10d诱导出愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基优选为：基础培养基+2-2.5mg/L 6-BA+1-1.5mg/L NAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，更优选为：基础培养基+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂PH＝5.8。
切取生长健壮的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，10-15d后愈伤组织增大，表面出现点状凸起，随后长出1cm左右的芽，等待小芽生长；将正在分化的愈伤组织每隔10-15d，转移至相同的分化培养基中继续分化，最终分化出转基因杜仲幼苗。所述愈伤组织分化培养基优选为：基础培养基+1.0-1.5mg/L 6-BA+1.0-1.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，更优选为：基础培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂PH＝5.8。
待分化培养基中转基因幼苗生长到5-7cm，选取生长健壮的幼苗，转接到生根培养基中进行生根。所述生根培养基优选为：基础培养基+30-35g蔗糖，pH为5.8-6，更优选为：基础培养基+30g蔗糖，PH＝5.8。
本发明对于上述愈伤组织诱导培养基、愈伤组织分化培养基和生根培养基中的基础培养基没有特殊限定，在本发明具体的实施例中，所述基础培养基的组分包括：硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、碘化钾、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、肌醇、琼脂、蔗糖。
本发明提供的杜仲各部位全株诱导植物再生的方法以及转基因植株再生体系的构建方法，杜仲根，茎，种胚的愈伤组织诱导率、分化率、生根率及杜仲根部转基因结果统计如图5所示。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取当年成熟饱满的杜仲种子，正中间剪开杜仲种子外壳，先剪去种胚两端尖端，再将剩余部分正中间划出伤口待用。接种于种胚愈伤组织诱导培养基中：基础培养基+4.5mg/L 2,4-D+0.4mg/L ZT(灭菌后加入)+480mg/L脯氨酸+480mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，培养温度为25℃，光照强度1800lx，每天光照时间16h，30天后统计愈伤组织状态，愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织苗数/总苗数×100％。其中基础培养基的组分为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.25mg/L，硫酸亚铁27.85mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L。
实施例2
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。
实施例3
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5.5mg/L 2,4-D+0.6mg/L ZT(灭菌后加入)+520mg/L脯氨酸+520mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。
对比例1
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+3mg/L 2,4-D+0.2mg/L ZT(灭菌后加入)+420mg/L脯氨酸+420mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。
对比例2
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+3.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L ZT(灭菌后加入)+440mg/L脯氨酸+440mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。
对比例3
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+4mg/L 2,4-D+0.3mg/L ZT(灭菌后加入)+460mg/L脯氨酸+460mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。
对比例4
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+6mg/L 2,4-D+0.7mg/L ZT(灭菌后加入)+550mg/L脯氨酸+550mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。
对比例5
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+7mg/L 2,4-D+0.9mg/L ZT(灭菌后加入)+600mg/L脯氨酸+600mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。不同杜仲种胚愈伤组织诱导培养基对杜仲种胚愈伤组织诱导的影响结果如表1所示。
表1不同种胚愈伤组织诱导培养基对杜仲种胚愈伤组织诱导的影响
实施例4
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+14g/L葡萄糖+28g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH＝5.9，其余均同实施例1。
实施例5
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+16g/L葡萄糖+29g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH＝6，其余均同实施例1。
实施例6
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+15g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例1。
对比例6
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+12g/L葡萄糖+26g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH＝5.6，其余均同实施例1。
对比例7
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+13g/L葡萄糖+27g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.7，其余均同实施例1。
对比例8
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+18g/L葡萄糖+32g/L蔗糖+12g/L琼脂，pH＝6.2，其余均同实施例1。
对比例9
与实施例1的不同之处在于种胚愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+5mg/L 2,4-D+0.5mg/L ZT(灭菌后加入)+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+20g/L葡萄糖+35g/L蔗糖+15g/L琼脂，pH＝7，其余均同实施例1。不同杜仲种胚愈伤组织诱导培养基对杜仲种胚愈伤组织诱导的影响结果如表2所示。
表2不同种胚愈伤组织诱导培养基对杜仲种胚愈伤组织诱导的影响
实施例7
将15天苗龄的杜仲组培苗取出，在无菌环境下，将所有叶片剪掉，留下茎段，在每个芽点上下各5mm位置垂直于茎方向剪开待用。接种于茎部愈伤组织诱导培养基中：基础培养基+1mg/L 6-BA+1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，培养温度为25℃，光照强度1800lx，每天光照时间约为16h，30天后统计愈伤组织状态，愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织苗数/总苗数×100％。基础培养基的配方同实施例1。
实施例8
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例7。
对比例10
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例7。
对比例11
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例7。
对比例12
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2mg/L 6-BA+2mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例7。不同杜仲茎部愈伤组织诱导培养基对杜仲茎部愈伤组织诱导的影响结果如表3所示。
表3不同茎部愈伤组织诱导培养基对杜仲茎部愈伤组织诱导的影响
实施例9
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1mg/L 6-BA+1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例7。
实施例10
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1mg/L 6-BA+1mg/L IAA+35g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH＝6，其余均同实施例7。
对比例13
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1mg/L 6-BA+1mg/L IAA+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH＝5，其余均同实施例7。
对比例14
与实施例7的不同之处在于茎部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1mg/L 6-BA+1mg/L IAA+37g/L蔗糖+12g/L琼脂，pH＝6.5，其余均同实施例7。不同杜仲茎部愈伤组织诱导培养基对杜仲茎部愈伤组织诱导的影响结果如表4所示。
表4不同茎部愈伤组织诱导培养基对杜仲茎部愈伤组织诱导的影响
实施例11
将15天苗龄的杜仲组培苗取出，在无菌环境下，剪下杜仲的根部，分别剪下主根和侧根的根尖部分从根的最先端到着生根毛的一段幼嫩部位，剪下大约4-6mm，接种于根部愈伤组织诱导培养基中：基础培养基+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，培养温度25℃，光照强度1800lx，每天光照时间为16h，30天后统计愈伤组织状态，愈伤组织诱导率＝诱导出愈伤组织苗数/总苗数×100％。基础培养基的配方同实施例1。
实施例12
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2.5mg/L6-BA+1.5mg/L NAA+800mg/L脯氨酸+600mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例11。
对比例15
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA+500mg/L脯氨酸+300mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例11。
对比例16
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1.5mg/L6-BA+1.3mg/L NAA+600mg/L脯氨酸+400mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例11。
对比例17
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+3mg/L 6-BA+2.5mg/L NAA+900mg/L脯氨酸+700mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例11。不同杜仲根部愈伤组织诱导培养基对杜仲根部愈伤组织诱导的影响结果如表5所示。
表5不同根部愈伤组织诱导培养基对杜仲根部愈伤组织诱导的影响
实施例13
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2.0mg/L6-BA+1mg/L NAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例11。
实施例14
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2.0mg/L6-BA+1mg/L NAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+35g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH＝6，其余均同实施例11。
对比例18
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2.0mg/L6-BA+1mg/L NAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH＝5.5，其余均同实施例11。
对比例19
与实施例11的不同之处在于根部愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2.0mg/L6-BA+1mg/L NAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+37g/L蔗糖+12g/L琼脂，pH＝6.2，其余均同实施例11。不同杜仲根部愈伤组织诱导培养基对杜仲根部愈伤组织诱导的影响结果如表6所示。
表6不同根部愈伤组织诱导培养基对杜仲根部愈伤组织诱导的影响
实施例15
切取实施例11生长健壮的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+2mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，30-60天后愈伤组织增大，表面出现点状凸起，随后长出1cm左右的芽，等待小芽生长。培养温度为25℃，光照强度1800lx，每天光照时间为16h，40天后统计愈伤组织分化状态，愈伤组织分化率(％)＝分化出芽的愈伤组织数/愈伤组织总数。基础培养基的配方同实施例1。
实施例16
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例15。
对比例20
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例15。
对比例21
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例15。
对比例22
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+2.5mg/L 6-BA+2mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例15。不同杜仲愈伤组织分化培养基对杜仲茎部愈伤组织分化的影响结果如表7所示。
表7不同愈伤组织分化培养基对杜仲根部愈伤组织分化的影响
实施例17
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+2mg/L IAA+35g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例15。
实施例18
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+2mg/L IAA+35g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH＝6，其余均同实施例15。
对比例23
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+2mg/L IAA+28g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH＝5，其余均同实施例15。
对比例24
与实施例15的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+2mg/L IAA+37g/L蔗糖+12g/L琼脂，pH＝6.5，其余均同实施例15。不同杜仲愈伤组织分化培养基对杜仲茎部愈伤组织分化的影响结果如表8所示。
表8不同愈伤组织分化培养基对杜仲根部愈伤组织分化的影响
实施例19
待实施例15分化培养基中小苗生长到5cm左右，选取生长健壮的芽，剪下转接到生根培养基中进行生根；生根培养基为：基础培养基+30g/L蔗糖，pH＝5.8，培养温度25℃，光照强度1800lx，每天光照时间为16h，40天后统计生根状态，生根率(％)＝幼苗生根数/幼苗总数。基础培养基的配方同实施例1。
实施例20
与实施例19的不同之处在于生根培养基为：基础培养基+35g/L蔗糖，pH＝6，其余均同实施例19。
对比例25
与实施例19的不同之处在于生根培养基为：基础培养基+25g/L蔗糖，pH＝4.5，其余均同实施例19。
对比例26
与实施例19的不同之处在于生根培养基为：基础培养基+40g/L蔗糖，pH＝7.5，其余均同实施例19。不同杜仲生根培养基对杜仲生根的影响结果如表9所示。
表9不同生根培养基对杜仲生根的影响
实施例21
分别切取实施例1和实施例7中生长健壮的愈伤组织进行分化、生根培养，其实验过程同实施例15-20和对比例20-26，最终经实验验证，种胚愈伤组织和茎部愈伤组织在分化培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L6-BA+1.0-2.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6和生根培养基为：基础培养基+30-35g/L蔗糖，pH为5.8-6的培养基中，能够达到最佳的愈伤组织分化率和生根率。
实施例22
将当年生的杜仲良种剥去种皮，播种于湿润的土壤中(长*宽*高＝9*9*10cm；营养土：蛭石：珍珠岩＝3：1：1)，光照周期为16h，光照强度1800Lx。以PROK2为载体，构建目的基因GFP的基因表达载体，将其转入K599农杆菌中(OD600＝0.3)，即可对生长15d的杜仲幼苗进行农杆菌注射，注射部位位于杜仲原始根上方1cm处，30天左右长出毛状根。通过RT-PCR和蛋白质印迹法测试目标基因是否被成功导入到这些毛状根中，结果如图4所示。统计转基因根的诱导率，转基因根诱导率(％)＝诱导出转基因根苗数/总苗数。
实施例23
与实施例22的不同之处在于含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液的OD600为0.1，注射部位位于杜仲原始根上方0.5cm处，其余均同实施例22。
实施例24
与实施例22的不同之处在于含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液的OD600为0.5，注射部位位于杜仲原始根上方1.5cm处，其余均同实施例22。实施例22-24的转基因根诱导率的结果如表10所示。
表10不同浓度发根农杆菌，不同注射位置下杜仲转基因根诱导率
实施例25
将实施例22长出的杜仲转基因根剪下，在无菌环境下，75％酒精浸泡30s，次氯酸钠浸泡5分钟，无菌水清洗5次，然后将转基因根剪成每段4mm，接种于根部愈伤组织诱导培养基中：基础培养基+2.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA+700mg/L脯氨酸+500mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，培养温度25℃，光照强度1800lx，每天光照时间为16h，30天后统计愈伤组织状态，愈伤组织诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的根段数/所有根段数。基础培养基同实施例1。
实施例26
与实施例25的不同之处在于愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2.5mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+800mg/L脯氨酸+600mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例25。
对比例27
与实施例25的不同之处在于愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+500mg/L脯氨酸+300mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例25。
对比例28
与实施例25的不同之处在于愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+0.7mg/L NAA+600mg/L脯氨酸+400mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例25。
对比例29
与实施例25的不同之处在于愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+3mg/L 6-BA+2.5mg/L NAA+900mg/L脯氨酸+700mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例25。转基因根不同愈伤组织培养基对杜仲愈伤组织诱导的影响如表11所示。
表11不同愈伤组织诱导培养基对杜仲根部愈伤组织诱导的影响
实施例27
切取实施例25生长健壮的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，30-60天后愈伤组织增大，表面出现点状凸起，随后长出1cm左右的芽，等待小芽生长，培养温度25℃，光照强度1800lx，每天光照时间为16h，40天后统计愈伤组织分化状态，愈伤组织分化率(％)＝分化出芽的愈伤组织数/愈伤组织总数。基础培养基同实施例1。
实施例28
与实施例27的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例27。
对比例30
与实施例27的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例27。
对比例31
与实施例27的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+0.5mg/L 6-BA+1mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例27。
对比例32
与实施例27的不同之处在于愈伤组织分化培养基为：基础培养基+0.5mg/L 6-BA+2mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8，其余均同实施例27。不同愈伤组织分化培养基所得的愈伤组织分化率如表12所示。
表12不同愈伤组织分化培养基对杜仲愈伤组织分化的影响
实施例29
待实施例27分化培养基中小苗生长到5cm左右，选取生长健壮的芽，剪下转接到生根培养基中进行生根，生根培养基为：基础培养基+30g/L蔗糖，pH＝5.8，温度为25℃，光照强度1800lx，每天光照时间为16h，40天后统计再生植株生根状态，生根率(％)＝幼苗生根数/幼苗总数。基础培养基同实施例1。
实施例30
与实施例29的不同之处在于生根培养基为：基础培养基+35g/L蔗糖，pH＝6，其余均同实施例29。
对比例33
与实施例29的不同之处在于生根培养基为：基础培养基+25g/L蔗糖，pH＝4.5，其余均同实施例29。
对比例34
与实施例29的不同之处在于生根培养基为：基础培养基+40g/L蔗糖，pH＝7.5，其余均同实施例29。不同生根培养基对杜仲生根的影响如表13所示。
表13不同生根培养基对杜仲生根的影响
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种杜仲各部位全株诱导植物再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：以杜仲种胚、茎部和/或根部诱导获得愈伤组织，愈伤组织分化培养、生根培养获得完整的杜仲再生植株；所述分化培养的培养基为：基础培养基+0.5-2mg/L 6-BA+1.0-2.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述以杜仲种胚诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+4.5-5.5mg/L 2,4-D+0.4-0.6mg/L ZT+480-520mg/L脯氨酸+480-520mg/L谷氨酰胺+14-16g/L葡萄糖+28-30g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述以杜仲茎部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+0.5-1.0mg/L 6-BA+0.5-1.0mg/L IAA+25-35g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述以杜仲根部诱导获得愈伤组织的诱导培养基为：基础培养基+2-2.5mg/L 6-BA+1-1.5mg/L NAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/L LH+30-40g/L蔗糖+8-10g/L琼脂，pH为5.8-6。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养的培养基为：基础培养基+30-35g/L蔗糖，pH为5.8-6。
6.一种杜仲转基因植株再生体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将含目标基因重组载体的发根农杆菌悬浮液注射到权利要求1-5任意一项所述方法获得的杜仲再生幼苗的茎部，待杜仲幼苗茎部伤口处的愈伤组织分化为再生毛状根，以再生毛状根为外植体进行组织培养，直至获得完整的杜仲转基因幼苗。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述注射的位置位于幼苗原始毛状根系上方0.5-1.5cm处的茎部。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述组织培养的愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+2-2.5mg/L 6-BA+1-1.5mg/LNAA+700-800mg/L脯氨酸+500-600mg/L LH+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述组织培养的愈伤组织分化培养基为：基础培养基+1.0-1.5mg/L 6-BA+1.0-1.5mg/L IAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH＝5.8。
10.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述组织培养的生根培养基为：基础培养基+30-35g蔗糖，pH为5.8-6。
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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