CN100393198C

CN100393198C - 一种获得产鬼臼毒素西藏八角莲的毛状根的方法、毛状根及后代

Info

Publication number: CN100393198C
Application number: CNB2005100572815A
Authority: CN
Inventors: 李春燕; 兰小中
Original assignee: Xizang Agriculture and Animal Husbandry College
Current assignee: Xizang Agriculture and Animal Husbandry College
Priority date: 2005-09-21
Filing date: 2005-09-21
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2025-09-21
Also published as: CN1748481A

Abstract

本发明提供了一种利用基因工程技术遗传转化西藏八角莲，获得生产鬼臼毒素的西藏八角莲的毛状根的方法。涉及包含发根农杆菌遗传转化西藏八角莲的方法，遗传转化获得可生产鬼臼毒素的西藏八角莲毛状根。其过程是用发根农杆菌遗传转化西藏八角莲，获得了西藏八角莲毛状根，经分子检测确为遗传转化的毛状根，HPLC检测表明遗传转化获得的西藏八角莲毛状根能够生产鬼臼毒素。本方法可以为鬼臼毒素的生产提供一种新型可持续的新型药源。

Description

一种获得产鬼臼毒素西藏八角莲的毛状根的方法、毛状根及后代

技术领域

本发明涉及分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种利用转基因技术获得产鬼臼毒素西藏八角莲毛状根的方法，具体涉及发根农杆菌遗传转化西藏八角莲并获得产鬼臼毒素的西藏八角莲毛状根的具体过程。本发明还提供利用基因工程获得的产鬼臼毒素的西藏八角莲毛状根及其培养的子代、再生植株、植物组织或种子。

背景技术

植物次生代谢产物具有极其复杂的化学结构，至今仍没有找到有效的或经济的合成方法。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。

目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的毛状根的相关研究较多，但对遗传转化西藏八角莲获得产鬼臼毒素毛状根的研究仍是空白。西藏八角莲为我国西藏所特有的小檗科植物，含有重要的抗癌(或抑癌)药物成分鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素，对于皮肤癌、宫颈癌有显著疗效，其衍生物对乳癌、子宫癌、结肠癌有一定的治愈功效，具有重要的药用价值和开发利用前景。

正是因为西藏八角莲具有这些重要的药用价值和良好的市场开发前景，市场对西藏八角莲的需求越来越大，科研人员对野生资源的采集次数越来越频繁，采集的数量越来越多，加之农牧民地毯式的过度采集，导致原本稀少的西藏八角莲的野生种群日益缩小，根据目前我们野外资源调查获得的数据来看，西藏八角莲的种群已经在3年前的基础上缩小了三分之二以上，其濒危境地实在令人担忧。此外，传统提取工艺主要依靠利用原材料粗粉进行乙醇渗滤、浓缩、沉淀、过滤、蒸干、乙醚处理等方法来获得鬼臼毒素等，这种方法的获得率很低，造成对原材料的极大浪费，加重了对野生西藏八角莲的破坏程度。总的来看，传统提取鬼臼毒素的方法是以牺牲野生资源为代价，因为，随着传统方法应用的不断扩大，野生资源的破坏程度就会不断加重。然而，无论是从可持续发展，还是从保护生物多样性的角度出发，经济的发展不能以牺牲自然资源环境为代价，我们有必要加大对西藏八角莲这种濒危物种采取有效的保护措施，自然生长状态下的西藏八角莲无法得到有效的保护，所以，我们利用遗传转化的先进手段，培育西藏八角莲的毛状根优良无性系，不仅可以获得其次生代谢产物鬼臼毒素和脱氧鬼臼毒素，产生良好的经济效益，更为重要的是，通过遗传转化获取次生代谢产物，减少了对野生植物资源的依赖，使濒危物种得以有效的保护，具有较大的生态效益。

本发明利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒(西藏大学农牧学院林学系植物生理教研室培养)的T-DNA导入西藏八角莲细胞获得转化毛状根，通过筛选优良无性系，获得鬼臼毒素及其衍生物含量相对较高而稳定的毛状根无性系，为鬼臼毒素的生产提供优质新型药源。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种转基因技术遗传转化西藏八角莲获得产鬼臼毒素毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入西藏八角莲中，获得西藏八角莲毛状根；

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法转化的宿主细胞，这种经转化的宿主细胞发育为毛状根。在实例中该宿主细胞是西藏八角莲。

本发明的技术方案如下：

一种获得产鬼臼毒素西藏八角莲毛状根的方法，

其步骤如下：

(1)西藏八角莲无菌外植体的获得：获得植物的无菌外植体已有多种现有技术，本发明可采用其中任何一种手段，但最好的手段是本发明实施例中显示的方法。

(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到西藏八角莲细胞、组织、器官、植株中：

(3)在特定的条件下筛选和鉴定毛状根：

(4)在适合的条件下培养西藏八角莲毛状根，用于生产鬼臼毒素：

利用该方法获得的产鬼臼毒素的西藏八角莲毛状根，该毛状根是一种采用本发明所用方法创造的新生命体。

在本发明中，术语“生命体”指西藏八角莲的细胞、组织、器官、植株。

在本发明中，术语“任何转基因方法”包括发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。

在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指用在离体培养的条件下根据毛状根特殊的形态学特征初步鉴定转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。

在本发明中，术语“在适合的条件下培养西藏八角莲毛状根”是指对经过鉴定的西藏八角莲毛状根离体培养，并检测鬼臼毒素含量，筛选鬼臼毒素含量提高的优良转化子进行培养，获得其后代。

在本发明中，我们采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化西藏八角莲，获得了产鬼臼毒素的西藏八角莲毛状根，为鬼臼毒素的生产提供了一种新型优质的可持续使用的药源。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

西藏八角莲无菌外植体的获得

方法一：利用外植体建立西藏八角莲无菌外植体

采取西藏八角莲(西藏大学农牧学院林学系藏药材种植园提供)根状茎萌发出来的幼芽，流水冲洗1小时；然后用2％(M/V)NaClO溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡15分钟，用无菌水冲洗6次：然后接种在添加无菌丛生芽诱导培养基中(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS基本培养基，添加植物生长调节物2.0mg/L BA(苄基腺嘌呤)，0.3mg/L NAA(萘乙酸)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养西藏八角莲的幼芽，培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为55μmol.m^-2.s^-1。40天后，即可获得无菌的西藏八角莲无菌外植体，等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化。

方法二：利用西藏八角莲种子在无菌条件下萌发获得无菌外植体

采取西藏八角莲成熟的种子(西藏大学农牧学院林学系藏药材种植园提供)，用2％(M/V)NaClO溶液浸泡20分钟，用无菌水冲洗3次；再用0.1％(M/V)升汞(HgCl₂)溶液浸泡30分钟，用无菌水冲洗6次；在无菌条件下去除其坚硬的种皮；将西藏八角莲胚接种在种子萌发培养基上(培养基盛于150ml的三角瓶中，于121℃灭菌20分钟)，该培养基配方为：MS基本培养基，添加植物生长调节物1.0mg/L BA(苄基腺嘌呤)，0.1mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，30g/L蔗糖和0.6g/L PVP(聚乙烯吡咯烷酮)调节培养基pH值为5.8，再添加5％琼脂粉。在光照培养箱中培养西藏八角莲的幼芽，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。待种子萌动后，改变培养条件为：25℃，12小时光照，光照强度为25μmol.m^-2.s^-1。等到叶片长到3cm×3cm大小时可用于遗传转化。

实施例2

发根农杆菌遗传转化西藏八角莲获得毛状根

1、发根农杆菌A4，R1000，R1601(西藏大学农牧学院林学系植物生理教研室培养)。使用前自冰箱取出，接种于50ml YEB液体培养(添加卡那霉素达到终浓度为100mg/L)，28℃，200rpm振荡培养两次；

2、第二次活化OD₆₀₀达0.3时，加100μmol/mL乙酰丁香酮，使其在农杆菌中的最终浓度为100μmol/mL，继续28℃，200rpm振荡培养，OD₆₀₀达0.6时，室温下4000rpm离心10分钟；

3、弃上清，菌体用MS液体培养基悬浮，乙酰丁香酮最终浓度为100μmol/mL，稀释到原体积的5倍，在28℃，200rpm振荡培养，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.3左右；称转化液；可用于西藏八角莲的遗传转化；1、2、3个步骤称为活化发根农杆菌；

4、发根农杆菌与无菌西藏八角莲外植体的共培养：取无菌西藏八角莲顶芽、侧芽、叶、茎、根等植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm²左右，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，浸染10分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2天，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。

5、西藏八角莲的除菌培养：共培养结束后转移至无植物生长调节物的MS固体培养基(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的)中培养，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养。10天后，在西藏八角莲受伤的部位开始出现毛状根。

6、西藏八角莲毛状根的获得与继代培养：待从西藏八角莲转化外植体上诱导出的毛状根长到2cm左右是，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2MS固体培养基上(添加250mg/L头孢菌素以达到除菌的目的)继代培养：在无植物生长调节物的1/2MS固体培养基上生长的西藏八角莲毛状根表现出毛状根特有的形态学特征：生长十分迅速、分枝很多、生长失去向地性。以后每25天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除；然后仅在1/2MS固体培养基上继代培养方可。

实施例3

西藏八角莲毛状根的分子检测

1、西藏八角莲毛状根基因组DNA的提取，方法如下：

1)取少量西藏八角莲毛状根，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer。

2)用小玻棒充分研磨后放于60℃水浴50min，其间经常颠倒混匀；

3)12000rpm，室温离心10分钟；

4)取上清液，加500ul饱和酚[Tris-HCl(pH8.0)饱和，吸取下层]，轻轻混匀，4℃静置5分钟至分层；

5)12000rpm，室温离心10min；

6)吸上清(约250微升)，加2倍体积的无水乙醇(-20℃储存)，充分混匀，室温静置至DNA析出；

7)8000rpm，4℃离心5分钟；

8)用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置，使乙醇挥发完全。

9)加50ul TE(100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH8.0)，溶解DNA。37℃水浴1小时。

10)加40ul氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，静置5分钟至分层。

11)12000rpm，室温离心10分钟。

12)吸取上清(约35ul)到新Eppendorf管中，-20℃保存，用于PCR检测。

抽提缓冲液配方如下：

100mM Tris-HCl(pH8.0)

2.5％(v/v) 巯基乙醇

500mM NaCl

20mM EDTA

1.5％(w/v) SDS

2、西藏八角莲毛状根中rolB和rolC基因的PCR检测，方法如下：

诱发并维持毛状根形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上。rolB基因检测使用的上游引物为frolb(5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’)，下游引物为rrolb(5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’)；rolC基因检测使用的上游引物为(5’CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’)，下游引物为rrolc(5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’)。

检测rolB和rolC的PCR程序为：94℃5min→34循环(94℃ for 40sec→56℃ for 40sec→72℃ for 1min)→72℃6min。阳性对照为相应的工程菌，西藏八角莲的天然叶片作为阴性对照。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。rolb的扩增条带大小为423bp，rolc为626bp。

实施例4

西藏八角莲毛状根中鬼臼毒素和西藏八角莲野生根中的含量比较

1.标准曲线的制备

参照刘蕾等人建立的方法(1997年)。

2、西藏八角莲中鬼臼毒素含量的测定

精密称取西藏八角莲毛状根和野生根干燥粉末(40目)各1g左右，分别在沙氏提取器中用95％乙醇回流提至无色(12h)，回收乙醇，用95％乙醇定量转移至5ml容量瓶中并定容至刻度，分别精密吸取毛状根样品液20μl和野生根样品液10μl点于硅胶GF254(20cm×10cm)板上，用氯仿∶甲醇(9.5∶0.5)展开，用鬼臼毒素作对照，在紫外灯下定位，刮下相对应的斑点，放入10ml具塞试管中，准确加入新配制的变色酸(0.1g/ml)0.5ml，以下操作同标准曲线制备(以薄层板上空白硅胶同样操作为空白)，离心，取上清液在570nm处测吸收度，根据回归方程计算含量。结果为：西藏八角莲毛状根中含鬼臼毒素1.55％，野生根中含鬼臼毒素1.06％。

Claims

1.一种获得产鬼臼毒素西藏八角莲毛状根的方法，特征在于采用转基因技术，用发根农杆菌遗传转化西藏八角莲的器官，其步骤如下：

(1)西藏八角莲无菌外植体的获得：

(2)采用转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到西藏八角莲器官中，

其中转基因方法选择发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化或生殖细胞浸泡法介导基因转化，步骤包括：

A、活化发根农杆菌；

B、发根农杆菌浸染西藏八角莲无菌外植体；

C、发根农杆菌与西藏八角莲无菌外植体的共培养；

D、西藏八角莲的除菌培养；

(3)西藏八角莲毛状根的获得与继代培养；

(4)西藏八角莲毛状根的分子检测；

(5)西藏八角莲毛状根中鬼臼毒素的检测；

其中：发根农杆菌与西藏八角莲无菌外植体的共培养的步骤如下：

(1)将发根农杆菌接种于50ml YEB液体培养，YEB液体添加卡那霉素达到终浓度为100mg/L，28℃，200rpm振荡培养两次；

(2)第二次活化OD₆₀₀达0.3时，加100μmol/mL乙酰丁香酮，使其在农杆菌中的最终浓度为100μmol/mL，继续28℃，200rpm振荡培养，OD₆₀₀达0.6时，室温下4000rpm离心l0分钟；

(3)弃上清，菌体用MS液体培养基悬浮，乙酰丁香酮最终浓度为100μmol/mL，稀释到原体积的5倍，在28℃，200rpm振荡培养，使菌液浓度达到的OD₆₀₀＝0.3；

称转化液，用于西藏八角莲的遗传转化；

(4)取无菌西藏八角莲顶芽、侧芽、叶、茎、根植物不同部位，将茎切成1cm小段，或将叶片切成2cm²，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，浸染10分钟后取出，用无菌卫生纸吸干，接入添加100μmol/mL乙酰丁香酮的MS固体培养基中共培养2天，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养；

(5)西藏八角莲的除菌培养：共培养结束后转移至无植物生长调节物的MS固体培养基中培养，培养条件为：25℃，黑暗条件下培养，10天后，在西藏八角莲受伤的部位开始出现毛状根；

(6)待从西藏八角莲转化外植体上诱导出的毛状根长到2cm时，分别切下单条的毛状根，接种在无植物生长调节物的1/2 MS固体培养基上继代培养；以后每25天继代培养一次，继代5次后，农杆菌可以去除；然后仅在1/2 MS固体培养基上继代培养；

西藏八角莲毛状根的分子检测手段如下；

(1)西藏八角莲毛状根基因组DNA的提取：

1)取少量西藏八角莲毛状根，放入1.5ml的Eppendorf管中，加500微升抽提buffer；

3)12000rpm，室温离心10分钟；

4)取上清液，加500ul饱和酚，用pH8.0的Tris-HCl进行饱和，吸取下层，轻轻混匀，4℃静置5分钟至分层；

5)12000rpm，室温离心10min；

6)吸上清250微升，加2倍体积的无水乙醇，-20℃储存，充分混匀，室温静置至DNA析出；

7)8000rpm，4℃离心5分钟；

8)用75％的乙醇洗2次，稍离心，吸净残余乙醇，室温放置，使乙醇挥发完全；

9)加50ul TE，其中100ug/ml RNaseA，50mM Tris.Cl，10mM EDTA，pH 8.0，溶解DNA，37℃水浴1小时；

10)加40ul氯仿一异戊醇混合液，其中氯仿∶异戊醇＝24∶1，轻轻混匀，静置5分钟至分层；

11)12000rpm，室温离心10分钟；

12)吸取上清35ul到新Eppendoff管中，-20℃保存，用于PCR检测；

抽提缓冲液配方如下：

100mM Tris-HCl pH8.0

2.5％v/v 巯基乙醇

500mM NaCl

20mM EDTA

1.5％w/v SDS

(2)西藏八角莲毛状根中rolB和rolC基因的PCR检测：

诱发并维持毛状根形态的rolB和rolC基因是来源于发根农杆菌的Ri质粒上，rolB基因检测使用的上游引物为frolb 5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’，下游引物为rrolb5’-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’；rolC基因检测使用的上游引物为5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’，下游引物为rrolc 5’-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’；

检测rolB和rolC的PCR程序为：94℃ 5min→34循环，94℃ for40sec→56℃ for40 sec→72℃for 1min→72℃ 6min；阳性对照为相应的工程菌，西藏八角莲的天然叶片作为阴性对照；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测，rolb的扩增条带大小为423 bp，rolC为626 bp。

2.用权利要求1所述方法获得的西藏八角莲毛状根，其特征在于它是生产鬼臼毒素的西藏八角莲的毛状根，其基因组中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因。

3.用权利要求1所述方法获得西藏八角莲毛状根的继代培养毛状根。