CN103468739A - 一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法。以怀地黄无菌苗初展开叶片去叶脉后剪成的叶盘作为根癌农杆菌感染的受体，经农杆菌侵染、共培养、抗性愈伤诱导、抗性芽分化、抗性芽生根，最终获得地黄的转基因植株。本发明方法简单，培养周期短，转化效率高，成功实现了怀地黄的遗传转化，为外源基因在怀地黄中稳定表达奠定了基础，对地黄的遗传改良和分子生物学研究有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法。
背景技术
地黄（Rehmannia glutinosa L.）为玄参科多年生草本植物，以块根入药，是著名“四大怀药”之一。因其用药历史悠久、临床疗效确切，已成为构建我国现代大中药产业链重点推荐研究利用的大宗药材之一（黄璐琦等, 中国科技投资, 2010, 5: 67-69）。目前在河南省焦作地区种植面积已经超过1.5万公顷，产值数十亿元。然而，由于地黄生产上多以块根进行无性繁殖，更易遭受病原菌和病毒侵袭而发病。而且，地黄生产上存在非常严重的连作障碍问题，造成地黄产量和品质明显下降，种植过地黄的土地须隔8-10年方可再种。培育脱毒地黄虽然能够提高地黄的产量，但并没有改变地黄的遗传特性，病毒复侵速度快，2-3代就要更换一次种苗，成本高。这些都在很大程度上影响了地黄生产的稳定发展，也制约了地黄产业链现代化的进程。近年来，由于高通量DNA测序技术的发展，地黄的基因转录本不断被解析，可获取的与地黄产量形成和活性成分合成调控的基因信息越来越多。因此，通过遗传转化的方法对地黄的遗传特性进行修饰，对于获得产量高、活性成分含量高和抗病虫能力强的优良地黄品种具有较强的现实意义。
地黄是较早开展组织培养技术的药用植物之一，然而，有关怀地黄遗传转化的研究却很少。付建喜等（河南农业科学, 2007, 10: 72-76）报道用发根农杆菌侵染地黄子叶、叶柄和茎，获得了转基因地黄植株。然而，由于发根农杆菌转化的转基因植株普遍表现地上部分节间缩短、地下部分以须根为主（张荫麟等，中国中药杂志, 1997, 5: 274-275），而且Ri质粒改造技术滞后，限制了其在植物基因组的遗传修饰方面的应用。韩国的Park等（Biotechnology letters, 2002, 7: 547-550）虽然最早报道获得了根癌农杆菌介导的地黄转化植株，然而，作为转化受体的地黄种质不明，且转化程序较复杂。臧亚超（河北农业大学硕士学位论文, 2012）虽也获得了地黄转基因植株，但由于抑菌抗生素浓度过高（氨苄青霉素600 mg/L），再生芽分化慢，转化效率也很低。因此，构建转化程序简单、转化效率高、重复性好的怀地黄遗传转化再生体系仍是地黄种质遗传改良中亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有地黄遗传转化技术的不足，提供一种以怀地黄初展开的叶片为转化外植体受体，通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，把外源基因导入怀地黄受体细胞，经过筛选再生获得怀地黄转基因植株的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，以怀地黄无菌苗初展开叶片去叶脉后剪成叶盘作为根癌农杆菌感染的受体，经农杆菌侵染、共培养、抗性愈伤诱导、抗性芽分化、抗性芽生根，最终获得地黄的转基因植株。
叶盘被农杆菌侵染后先接种在无筛选抗生素的培养基上共培养48-72 h，之后接种到含有潮霉素或卡那霉素的筛选培养基上获得抗性愈伤和抗性芽，再把抗性芽接种到增殖培养基上增殖，在生根培养基上生根，获得转基因地黄植株。
优选的，怀地黄无菌苗的准备如下：将田间挖取的直径约1-2 cm的怀地黄块根洗净，依次用酒精和HgCl2消毒，之后无菌水冲洗5-6次；将带芽眼的部分切成1.5-2 cm小块放入MS基本培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，15 d后把再生芽转至新的MS基本培养基，30 d继代一次。
优选的，根癌农杆菌菌株的活化与侵染菌液的制备如下：把鉴定正确的根癌农杆菌在YEB固体培养基上划线活化，于27℃下，暗培养48 h；挑取单克隆菌落接种到20-30 mL YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养24 h；取100 μL上述菌液接种到50 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养，菌液浓度至OD600=0.4-0.8，于4℃，4000 rpm条件下离心10 min收集菌体，弃上清，用侵染培养基悬浮至OD600=0.5获得侵染菌液待用。
所述的YEB液体培养基为：YEB基本培养基+卡那霉素50 mg/L+利福霉素50mg/L+蔗糖5 g/L；所述的YEB固体培养基还含有琼脂粉15 g/L；所述的侵染培养基为：MS基本培养基+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L。
所述的YEB基本培养基为：牛肉浸膏5 g/L+胰蛋白胨5 g/L+酵母提取物1 g/L +MgSO4·7H2O 0.5g/L。
优选的，将怀地黄无菌苗的叶片去掉主脉，剪成长宽约0.5-1.0 cm的叶盘，置于制备好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，接种到无筛选抗生素的培养基上暗培养，所述的培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1mg/L+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。
优选的，共培养后的叶盘转接到含抗生素的筛选培养基上，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，2周后更换一次培养基，3-4周后把抗性愈伤转接到新的含抗生素的筛选培养基上，2-3周长出抗性芽；所述含抗生素的筛选培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+特美汀200 mg/L+ 潮霉素 10-15 mg/L或卡那霉素50-75 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉9 g/L。
优选的，将长2-3 cm的抗性芽转接到丛生芽分化培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，进行抗性芽扩繁；把长2-3 cm的丛生芽剪下转接入生根培养基中诱导生根；所述的丛生芽分化培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤0.2 mg/L+α-萘乙酸0.01mg/L+特美汀200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L；所述的生根培养基为：MS基本培养基+α-萘乙酸0.01mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。
更为优选的，所述方法步骤如下：
（1）怀地黄无菌苗的准备：将田间挖取的直径1-2 cm的怀地黄块根洗净，用体积浓度为70%的酒精表面消毒30 s，然后用质量浓度为0.1%的HgCl2消毒10-15 min，无菌水冲洗5-6次；将带芽眼的部分切成1.5-2 cm小块放入MS基本培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，15 d后把再生芽转至新的MS基本培养基，30 d继代一次；
（2）菌株的活化与侵染菌液的制备：把鉴定正确的根癌农杆菌在YEB固体培养基上划线活化，于27℃下，暗培养48 h，挑取单克隆菌落接种到20-30 mL YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养24 h，取100 μL的菌液接种到50 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养，菌液浓度至OD600=0.4-0.8，于4℃，4000 rpm条件下离心10 min收集菌体，弃上清，用侵染培养基悬浮至OD600=0.5待用；
（3）侵染和共培养：将怀地黄无菌苗的叶片去掉主脉，剪成长宽约0.5-1.0 cm的小块即叶盘，置于制备好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，接种到共培养培养基上暗培养48-72 h；
（4）外植体的抗性愈伤诱导和再生芽分化：共培养后的叶盘转接到含抗生素的筛选培养基上，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，3-4周后把抗性愈伤转接到新的筛选培养基上，2-3周长出抗性芽；
（5）再生芽增殖和生根：将长2-3 cm的抗性芽转接到丛生芽分化培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，进行抗性芽扩繁；把长2-3 cm的丛生芽剪下转接入生根培养基中诱导生根。
对转基因植株的分子鉴定时，取所获得的抗性再生植株的叶片，采用PCR方法进行外源导入基因的检测或进行导入报告基因蛋白质产物活性检测。
所述的侵染培养基在制备时pH值调至7.0，各种植物培养基制备时pH值均调至5.8，121℃高压灭菌20 min，但培养基温度降至50-60℃时，添加特美汀、潮霉素或卡那霉素，混匀分装后备用。
本发明的特点是：以无菌苗的叶片为转化外植体受体，且无菌苗可以连续继代，不需要对外植体的表面消毒，简化了转化程序；遗传转化可常年进行，不受季节影响；以特美汀为农杆菌抑制剂，抑菌效果好，成本低；转化周期短，一般侵染后6-8周可获得转基因植株；转化效率高，以潮霉素为筛选剂转化率约21%，以卡那霉素为筛选剂转化率可达24%。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
本发明方法简单，培养周期短，转化效率高，成功实现了怀地黄的遗传转化，使外源基因在怀地黄中稳定表达奠定了基础，对地黄的遗传改良和分子生物学研究有十分重要的意义。
附图说明
图1为本发明以怀地黄叶片为外植体通过根癌农杆菌介导的怀地黄遗传转化的结果图。A为叶片接种；B为抗性愈伤诱导；C为再生芽分化，D为再生芽增殖；E为再生地黄生根；F为转基因地黄盆栽。
图2为本发明转基因怀地黄的PCR检测图。图中M为DL2000分子Marker；泳道1为阴性对照（未进行遗传转化的“温85-5”植株）；泳道2阳性对照（质粒载体pCAMBIA1301）；泳道3至13为采用实施例1中技术方案遗传转化后不同的地黄植株。
图3为抗性愈伤与转基因地黄GUS活性检测图。A为GUS活性检测实验；B为抗性愈伤；C-D为分化再生芽；E为再生植株；F为再生植株叶片；I为未转化野生型地黄叶片GUS染色结果。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
以下所用的MS基本培养基、乙酰丁香酮、6-苄氨基嘌呤和α-萘乙酸均为为Sigma公司产品，潮霉素为Merk公司产品，胰蛋白胨和酵母提取物为Oxoid公司产品，特美汀为上海尘前生物科技有限公司产品，卡那霉素、利福霉素、琼脂粉、X-gluc均为上海生工生物工程公司产品，其它试剂均为国产分析纯。PCR扩增特异引物由上海生工生物工程公司合成。根癌农杆菌LBA4404、载体pCAMBIA1301和pBi121均由福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室提供。
实施例1
农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，步骤如下：
1）将田间挖取的怀地黄优良品种“温85-5”的块根洗净，自来水冲洗12 h，用70%的酒精表面消毒30 s，无菌水冲洗3次，然后用0.1%的HgCl2消毒10 min，无菌水冲洗6次，置于无菌滤纸上晾干。将带芽眼的部分切成长1.5 cm小块放入MS基本培养基中，14 h/d、4000 lux光照，于25±1℃下培养，15 d后把再生芽转至新的MS基本培养基，30 d继代一次。
2）把含载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌LBA4404在YEB固体培养基上划线活化，于27℃下，暗培养48 h，挑取单克隆菌落接种到20 mL YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养24 h，取100 μL的菌液接种到50 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养，菌液浓度至OD600=0.5，于4℃，4000 rpm条件下离心10 min收集菌体，弃上清，用无菌的侵染培养基悬浮菌体至OD600=0.5待用；所述的YEB液体培养基为：YEB基本培养基+卡那霉素50 mg/L+利福霉素50mg/L+蔗糖5 g/L；所述的YEB固体培养基还含有琼脂粉15 g/L；所述的侵染培养基为：MS基本培养基+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L。
3）将怀地黄无菌苗的叶片去掉主脉，剪成长宽0.5×0.5 cm的小块，置于制备好的侵染菌液中浸泡5 min，用无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，接种到无筛选抗生素的培养基上暗培养48 h；无筛选抗生素的培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1mg/L+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。
4）共培养后的叶盘转接到含12 mg/L潮霉素的筛选培养基上（图1A），14 h/d、4000 lux光照，于25±1℃下培养，4周后长出抗性愈伤（图1B）。单独把抗性愈伤转接到新的筛选培养基上，3周后长出抗性芽（图1C）；所述筛选培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+特美汀200 mg/L+ 潮霉素 12 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂粉9 g/L。
5）将长2 cm的抗性芽转接到丛生芽分化培养基中，14 h/d、4000 lux光照，于25±1℃下培养3周，进行抗性芽扩繁（图1D）。把长2 cm的丛生芽剪下转接入生根培养基中10d，诱导生根（图1E）。待根伸长2 cm时把组培瓶口打开，添加1 cm深的无菌水炼苗1周左右，移栽到营养土中在温室里继续生长（图1F）；所述的丛生芽分化培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤0.2 mg/L+α-萘乙酸0.01mg/L+特美汀200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L；所述的生根培养基为：MS基本培养基+α-萘乙酸0.01mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。
6）取所获得的抗性再生植株的叶片，采用CTAB法提取叶片的基因组DNA，用潮霉素标记基因特异引物5’-ATCGAAATTGCCGTCAACC-3’/ 5’-ACAGCGTCTCCGACCTGAT-3’进行PCR鉴定，结果11个抗性植株中有9个扩增出794 bp的特异片段（图2）。GUS染色参照Jefferson等（The EMBO journal, 1987, 13: 3901-3907）的方法进行，并做适当修改。将抗性愈伤、再生芽和幼苗浸没在β-葡萄糖苷酶（GUS）染色液[50 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.5 mmol /L铁氰化钾，0.5 mmol/L亚铁氰化钾，10 mmol/L EDTA-Na2，0.1%（v/v） Triton X-100，10 mmol/L X-gluc]中，37℃暗培养24 h，分别用50%、70%和100%乙醇去除叶绿素，显微镜下观察，结果愈伤、芽和叶片显示蓝色，证实已经获得了地黄转基因植株（图3）。
实施例2
重复实施例1，有以下不同点：步骤3）中叶盘置于制备好的侵染菌液中浸泡10 min，步骤4）中筛选培养基中潮霉素的浓度为15 mg/L。
实施例3
重复实施例1，有以下不同点：步骤2）农杆菌包含的质粒载体为pBi121，步骤4）筛选培养基中以卡那霉素为筛选剂，浓度为50 mg/L。
实施例4
重复实施例1，有以下不同点：步骤2）农杆菌包含的质粒载体为pBi121，步骤3）叶盘置于制备好的侵染菌液中浸泡10 min，步骤4）筛选培养基中以卡那霉素为筛选剂，浓度为75 mg/L。
Claims (10)
1.一种农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，以怀地黄无菌苗初展开叶片去叶脉后剪成的叶盘作为根癌农杆菌感染的受体，经农杆菌侵染、共培养、抗性愈伤诱导、抗性芽分化、抗性芽生根，最终获得地黄的转基因植株。
2.如权利要求1所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，叶盘被农杆菌侵染后先接种在无筛选抗生素的培养基上共培养48-72 h，之后接种到含有潮霉素或卡那霉素的筛选培养基上获得抗性愈伤和抗性芽，再把抗性芽接种到增殖培养基上增殖，在生根培养基上生根，获得转基因地黄植株。
3.如权利要求2所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，怀地黄无菌苗的准备如下：将田间挖取的直径1-2 cm的怀地黄块根洗净，依次用酒精和HgCl2消毒，之后用无菌水冲洗5-6次；将带芽眼的部分切成长1.5-2 cm小块放入MS基本培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，15 d后把再生芽转至新的MS基本培养基，30 d继代一次。
4.如权利要求2所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，根癌农杆菌菌株的活化与侵染菌液的制备如下：把鉴定正确的根癌农杆菌在YEB固体培养基上划线活化，于27℃下，暗培养48 h；挑取单克隆菌落接种到20-30 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养24 h；取100 μL上述菌液接种到50 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养，菌液浓度至OD600=0.4-0.8，于4℃，4000 rpm条件下离心10 min收集菌体，弃上清，用侵染培养基悬浮至OD600=0.5获得侵染菌液待用。
5.如权利要求4所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，所述的YEB液体培养基为：YEB基本培养基+卡那霉素50 mg/L+利福霉素50 mg/L+蔗糖5 g/L；所述的YEB固体培养基还含有琼脂粉15 g/L；所述的侵染培养基为：MS基本培养基+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L。
6.如权利要求5所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，将怀地黄无菌苗的叶片去掉主脉，剪成长宽约0.5-1.0 cm的叶盘，置于制备好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，接种到无筛选抗生素的培养基上暗培养，所述的培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+乙酰丁香酮100 μmol/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。
7.如权利要求6所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，共培养48-72 h后的叶盘转接到含抗生素的筛选培养基上，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，2周后更换一次培养基，3-4周后把长出的抗性愈伤转接到新的筛选培养基上，2-3周长出抗性芽；所述含抗生素的筛选培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤2.0 mg/L+α-萘乙酸0.1 mg/L+特美汀200 mg/L+ 潮霉素 10-15 mg/L或卡那霉素50-75 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。
8.如权利要求2所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，将长2-3 cm的抗性芽转接到丛生芽分化培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，进行抗性芽扩繁；把长2-3 cm的丛生芽剪下转接入生根培养基中诱导生根；所述的丛生芽分化培养基为：MS基本培养基+6-苄氨基嘌呤0.2 mg/L+α-萘乙酸0.01 mg/L+特美汀200 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L；所述的生根培养基为：MS基本培养基+α-萘乙酸0.01 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂粉9 g/L。
9.如权利要求1-8任一所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
（1）怀地黄无菌苗的准备：将田间挖取的直径约1-2 cm的怀地黄块根洗净，用体积浓度为70%的酒精表面消毒30 s，然后用质量浓度为0.1%的HgCl2消毒10-15 min，无菌水冲洗5-6次；将带芽眼的部分切成1.5-2 cm小块放入MS基本培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，15 d后把再生芽转至新的MS基本培养基，30 d继代一次；
（2）菌株的活化与侵染菌液的制备：把鉴定正确的根癌农杆菌在YEB固体培养基上划线活化，于27℃下，暗培养48 h，挑取单克隆菌落接种到20-30 mL YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养24 h，取100 μL的菌液接种到50 mL的YEB液体培养基中，于27℃下，180 rpm振荡培养，菌液浓度至OD600=0.4-0.8，于4℃，4000 rpm条件下离心10 min收集菌体，弃上清，用侵染培养基悬浮至OD600=0.5待用；
（3）侵染和共培养：将怀地黄无菌苗的叶片去掉主脉，剪成长宽约0.5-1.0 cm的小块即叶盘，置于制备好的侵染菌液中浸泡5-10 min，用无菌滤纸吸去叶盘上多余的菌液，接种到无筛选抗生素的培养基上暗培养48-72 h；
（4）外植体的抗性愈伤诱导和再生芽分化：共培养后的叶盘转接到含抗生素的筛选培养基上，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，2周后更换一次培养基，3-4周后把抗性愈伤转接到新的筛选培养基上，2-3周长出抗性芽；
（5）再生芽增殖和生根：将长2-3 cm的抗性芽转接到丛生芽分化培养基中，14 h/d、3000-4000 lux光照，于25±1℃下培养，进行抗性芽扩繁；把长2-3 cm的丛生芽剪下转接入生根培养基中诱导生根。
10.如权利要求9所述的农杆菌介导的怀地黄遗传转化方法，其特征在于，所述的侵染培养基在制备时pH值调至7.0，各种植物培养基制备时pH值均调至5.8，121℃高压灭菌20 min，等培养基温度降至50-60℃时，添加特美汀、潮霉素或卡那霉素，混匀分装后备用。
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