CN110951774A - 一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，以丹红杨嫩叶作为基因受体材料进行农杆菌介导，从而获得转基因植株。主要步骤包括：丹红杨嫩叶的获得、农杆菌培养、农杆菌侵染、丹红杨不定芽的筛选及分化、植株再生与炼苗移栽。该方法操作简单、可靠性高，为现代生物技术应用于丹红杨品种改良开辟新的途径。

Description

一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法
技术领域
本发明属于生物技术和现代农业技术领域，涉及植物组织培养和遗传转化方法，具体为一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法。
背景技术
丹红杨是中国林科院培育成功的新一代速生抗虫杨良种，其母本为美洲黑杨50号，父本为美洲黑杨36号，1991年人工控制授粉获得种子，经过苗期初选后，1994年在河南焦作营造家系林，1999年在苏北、豫北焦作市营造区试林，2001年选育成功，2003年底通过国家良种认定，2004年初被授予新品种保护权。
丹红杨在焦作丹红杨种苗基地试验3年，经实地观测，丹红杨具有以下突出特点：
(一)生长快。基地试验林3年生胸径达到19.7厘米，比中林46大3.8厘米，比107大3.3厘米，比2025大3.5厘米，相应的材积分别大67.3％、59.7％、62.8％。
焦作丹红杨种苗基地6年生丹红杨比107材积大49.4％(丹红杨平均胸径34厘米，平均单株材积0.78m3，107平均胸径24.5厘米，平均单株材积0.3370m3，丹红杨材积大79.4％)。
(二)干形通直圆满。丹红杨的父母本都是通直圆满，所以丹红杨的干形比107、中林46杨，干形都要好，几乎接近水杉。
(三)丹红杨树皮比较粗糙，所以，比107，46杨抗溃疡病(一般树皮粗糙的比树皮光滑的抗溃疡病)。
(四)天牛危害比107，108，46杨轻(丹红杨是韩一凡研究员选育的抗桑天牛的品种)。
(五)树高生产量大，分枝均匀，枝条细，适合培育无节良材。
(六)生根量大，造林和育苗成活率高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，利用组织培养技术，离体杨树幼叶能形成不定芽，经诱导生根后成长为再生植株。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，包括以下步骤：
1)用无菌苗培养基培养丹红杨幼苗获得叶片，培养温度25℃，每天光照16小时；
2)将含有双元植物表达载体PCAMBIA2300-PtCLE的农杆菌EHA105单克隆于含卡那霉素和利福平的YM培养基上划线培养，将农杆菌菌体置于液体培养基中，加入乙酰丁香酮制得侵染液；
3)将叶片横向剪2-3刀，剪开的幅度为叶片的三分之二宽度，添加侵染液进行浸染，用滤纸吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上培养；
4)将叶片转入筛选培养基培养，将生成的不定芽移入壮苗培养基继续培养；
5)选取健壮的不定芽，移入生根培养基，根系形成后将幼苗移入生长培养基，待根系发达，苗长到6cm以上时进行移栽。
进一步的，所述的无菌苗培养基为：1/2MS+IBA0.05mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
进一步的，所述的卡那霉素和利福平的浓度分别为50mg/L和25mg/L。
进一步的，所述的液体培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
进一步的，所述的浸染液中菌体OD600为0.3～0.6。
进一步的，所述的乙酰丁香酮得添加浓度为100μmol/L。
进一步的，所述的共培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，p H5.8，培养条件为温度25℃，光照每天16小时。
进一步的，所述的筛选培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L，pH5.8，培养条件为培养温度25℃，每天光照16小时。
进一步的，所述的壮苗培养基为：MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.001mg/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，p H5.8。
进一步的，所述的生根培养基为：1/2WPM+IBA0.5mg/L+NAA0.02mg/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
进一步的，所述的生长培养基为：WPM+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
本发明的有益效果为：
本发明利用组织培养技术，离体杨树嫩叶能形成不定芽，经诱导生根后成长为再生植株。以丹红杨嫩叶作为基因受体材料，通过农杆菌介导的遗传转化再生体系具有方法简单，可靠性高，易操作的特点，将为现代生物技术应用于丹红杨品种改良开辟新的途径。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，以丹红杨幼叶作为基因受体材料进行农杆菌介导，从而获得转基因植株。主要步骤包括：丹红杨嫩叶的获得、农杆菌培养、农杆菌侵染、丹红杨不定芽的筛选及分化、植株再生与炼苗移栽。基本过程如下：
步骤1.扩繁无菌丹红杨幼苗，收集嫩叶，获得基因受体材料；
步骤2.已构建质粒、单克隆农杆菌培养；
步骤3.农杆菌侵染；
步骤4.丹红杨不定芽的筛选与分化；
步骤5.丹红杨的再生与炼苗移栽。
所述步骤1操作方法如下：
用无菌苗培养基培养丹红杨幼苗获得叶片，培养温度25℃，每天光照16小时。
选取丹红杨幼叶第2至4叶，叶片长度为25-35毫米。
丹红杨无菌苗培养基为：1/2MS+IBA0.05mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
所述步骤2操作方法如下:
将含有双元植物表达载体PCAMBIA2300-PtCLE的农杆菌EHA105单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线，28℃培养3天。收集农杆菌菌体，将其悬浮于WPM液体培养基中，不断晃动30min后至菌体OD600为0.3-0.6，即为侵染液用于转化。侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
WPM液体培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
所述步骤3操作方法如下:
侵染时各具体参数如下：根据叶片的大小，横向剪2-3刀，剪开的幅度为叶片的三分之二宽度，40张叶片加100毫升侵染液，侵染时间15分钟；用滤纸吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上培养时间2-4天。共培养条件：温度25℃，光照每天16小时。
共培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8。
所述步骤4操作方法如下:
将共培养后的叶片转入筛选培养基，培养温度25℃，每天光照16小时，每2周换培养基一次，四周后逐渐有少量的不定芽生成。将不定芽移入壮苗培养基培养约3周，选取高度约20毫米的健壮芽进行生根培养。壮苗培养条件为温度25℃，每天光照16小时。
筛选培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L，pH5.8。
壮苗培养基为：MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.001mg/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
所述步骤5操作方法如下:
选取健壮的不定芽，移入生根培养基。培养温度25℃，光照每天16小时。一周后根系形成，即可将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16小时，待根系发达，苗长到6cm以上时进行移栽，栽培基质为泥炭土：蛭石＝1:1(v/v)，至于光照培养箱内培养1月，即可转移至遮阴大棚培养，2月后可进入野外林地栽培。
生根培养基组成为：1/2WPM+IBA0.5mg/L+NAA0.02mg/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
生长培养基组成为：WPM+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
实施例1
1)用无菌苗培养基培养丹红杨幼苗获得叶片，培养温度25℃，每天光照16小时。选取丹红杨嫩叶第2-4张叶片，叶片长度为25毫米。
2)将含有双元植物表达载体PCAMBIA2300-PtCLE的农杆菌EHA105单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线，28℃培养3天。收集农杆菌菌体，将其悬浮于WPM液体培养基中，不断晃动30min后至菌体OD600为0.3，即为侵染液用于转化。侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
3)侵染时各具体参数如下：根据叶片的大小，横向剪2刀，剪开的幅度为叶片的三分之二宽度，40张叶片加100毫升侵染液，侵染时间15分钟；用滤纸吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上培养时间2天。共培养条件：温度25℃，光照每天16小时。
4)将共培养后的叶片转入筛选培养基，培养温度25℃，每天光照16小时，每2周换培养基一次，四周后逐渐有少量的不定芽生成。将不定芽移入壮苗培养基培养约3周，选取高度约20毫米的健壮芽进行生根培养。壮苗培养条件为温度25℃，每天光照16小时。
5)选取健壮的不定芽，移入生根培养基。培养温度25℃，光照每天16小时。一周后根系形成，即可将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16小时，待根系发达，苗长到6cm以上时进行移栽，栽培基质为泥炭土：蛭石＝1:1(v/v)，至于光照培养箱内培养1月，即可转移至遮阴大棚培养，2月后可进入野外林地栽培。
实施例2
1)用无菌苗培养基培养丹红杨幼苗获得叶片，培养温度25℃，每天光照16小时。选取丹红杨嫩叶第2-4叶，叶片长度为35毫米。
2)将含有双元植物表达载体PCAMBIA2300-PtCLE的农杆菌EHA105单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线，28℃培养3天。收集农杆菌菌体，将其悬浮于WPM液体培养基中，不断晃动30min后至菌体OD600为0.6，即为侵染液用于转化。侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
3)侵染时各具体参数如下：根据叶片的大小，横向剪3刀，剪开的幅度为叶片的三分之二宽度，40张叶片加100毫升侵染液，侵染时间15分钟；用滤纸吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上培养时间4天。共培养条件：温度25℃，光照每天16小时。
4)将共培养后的叶片转入筛选培养基，培养温度25℃，每天光照16小时，每2周换培养基一次，四周后逐渐有少量的不定芽生成。将不定芽移入壮苗培养基培养约3周，选取高度约20毫米的健壮芽进行生根培养。壮苗培养条件为温度25℃，每天光照16小时。
5)选取健壮的不定芽，移入生根培养基。培养温度25℃，光照每天16小时。一周后根系形成，即可将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16小时，待根系发达，苗长到6cm以上时进行移栽，栽培基质为泥炭土：蛭石＝1:1(v/v)，至于光照培养箱内培养1月，即可转移至遮阴大棚培养，2月后可进入野外林地栽培。
实施例3
1)用无菌苗培养基培养丹红杨幼苗获得叶片，培养温度25℃，每天光照16小时。选取丹红杨幼叶第2-4叶，叶片长度为30毫米。
2)将含有双元植物表达载体PCAMBIA2300-PtCLE的农杆菌EHA105单克隆于含卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YM培养基上划线，28℃培养3天。收集农杆菌菌体，将其悬浮于WPM液体培养基中，不断晃动30min后至菌体OD600为0.5，即为侵染液用于转化。侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
3)侵染时各具体参数如下：根据叶片的大小，横向剪3刀，剪开的幅度为叶片的三分之二宽度，40张叶片加100毫升侵染液，侵染时间15分钟；用滤纸吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上培养时间3天。共培养条件：温度25℃，光照每天16小时。
4)将共培养后的叶片转入筛选培养基，培养温度25℃，每天光照16小时，每2周换培养基一次，四周后逐渐有少量的不定芽生成。将不定芽移入壮苗培养基培养约3周，选取高度约20毫米的健壮芽进行生根培养。壮苗培养条件为温度25℃，每天光照16小时。
5)选取健壮的不定芽，移入生根培养基。培养温度25℃，光照每天16小时。一周后根系形成，即可将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16小时，待根系发达，苗长到6cm以上时进行移栽，栽培基质为泥炭土：蛭石＝1:1(v/v)，至于光照培养箱内培养1月，即可转移至遮阴大棚培养，2月后可进入野外林地栽培。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用无菌苗培养基培养丹红杨幼苗获得叶片，培养温度25℃，每天光照16小时；
2)将含有双元植物表达载体PCAMBIA2300-PtCLE的农杆菌EHA105单克隆于含卡那霉素和利福平的YM培养基上划线培养，将农杆菌菌体置于液体培养基中，加入乙酰丁香酮制得侵染液；
3)将叶片横向剪2-3刀，剪开的幅度为叶片的三分之二宽度，添加侵染液进行浸染，用滤纸吸干叶片上残留的侵染液，叶片移至共培养基上培养；
4)将叶片转入筛选培养基培养，将生成的不定芽移入壮苗培养基继续培养；
5)选取健壮的不定芽，移入生根培养基，根系形成后将幼苗移入生长培养基，待根系发达，苗长到6cm以上时进行移栽；
所述的液体培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
所述的共培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8。
所述的筛选培养基为：WPM+6BA0.1mg/L+TDZ0.001mg/L+KT1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L，pH5.8。
2.根据权利要求1所述的一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，所述的无菌苗培养基为：1/2MS+IBA 0.05mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，所述的卡那霉素和利福平的浓度分别为50mg/L和25mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，所述的浸染液中菌体OD600为0.3～0.6。
5.根据权利要求1所述的一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，所述的乙酰丁香酮得添加浓度为100μmol/L。
6.根据权利要求1所述的一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，所述的壮苗培养基为：MS+6-BA0.2mg/L+TDZ0.001mg/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
7.根据权利要求1所述的一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，所述的生根培养基为：1/2WPM+IBA0.5mg/L+NAA0.02mg/L+卡那霉素20mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。
8.根据权利要求1所述的一种丹红杨遗传转化及转基因植株再生的方法，其特征在于，所述的生长培养基为：WPM+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。
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