CN103031360A

CN103031360A - 似活的非可培养状态的可培养细菌及其制备方法

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Publication number: CN103031360A
Application number: CN2012104036022A
Authority: CN
Inventors: 李影; 段锐; 钱爱东; 张文慧; 李莹
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2012-10-22
Publication date: 2013-04-10

Abstract

本发明公开了的似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌，是能准确获取具有稳定遗传性状的VBNC细菌研究模型，解决了VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，使得研究者无法做更为深入地研究的瓶颈问题，从而为客观揭示VBNC形成机制奠定基础。似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌，是在不良环境中能持续存活的“菌种”，作为益生菌制剂及疫苗等方面，提高保质期具有广阔的应用前景。本发明还公开了似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌的制备和鉴定方法。

Description

似活的非可培养状态的可培养细菌及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌及其制备方法。

背景技术

细菌VBNC状态是指细菌在不良环境中，细胞缩成球形，用常规方法（平板法、最大可能近似值法）培养时，不能生长繁殖，但仍然是活的一种特殊存在形式。

细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable, VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，目前，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年发表在Applied and Environmental Microbiology 刊物上的一篇题为《Resuscitation of Salmonella enterica Serovar Typhimurium and Enterohemorrhagic Escherichia coli from the Viable but Nonculturable State by Heat-Stable Enterobacterial Autoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30％牛血清和50μmol/L去甲肾上腺素的SAPI培养基，基中SAPI培养基成份较为复杂，由6.25mmol/L NH₄NO₃，1.84mmol/L KH₂PO₄，3.35mmol/L KCl，1.01mmol/L MgSO₄，2.77mmol/L(pH=7.5)葡萄糖等组成。主要复苏步骤如下：首先将SAPI培养基6000 r/min，离心15min，上清液过滤除菌。然后将滤后的上清液涂于羊血琼脂平板上，37℃厌氧培养48h，以检测培养基中是否有杂菌污染。最后将可能含有10²～10³ 个CFU/mL浓度的VBNC沙门氏菌无菌接种于SAPI中，37℃厌氧培养至OD₆₂₀＝0.4时，细菌数量增多，浓度可接近10⁸个CFU/mL。通过此法可以使维持VBNC长达1年的细菌恢复为可培养状态。

细菌VBNC状态自20世纪80年代发现至今，一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一。现阶段，人们已在VBNC细菌诱导、检测、致病性等方面取得重要成果，并且在分子水平上也对该状态有了进一步地了解和认识。但是摆在现阶段的一个瓶颈问题，即VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，这使得研究者无法做更为深入地研究。也就是说，只有准确捕获VBNC状态，才能对该状态细菌进行系统研究。然而遗憾的是，在VBNC领域中至今尚未获得具有稳定遗传性状的研究模型。也正因如此，有关VBNC状态发生机制的研究也只停留在某一（些）已知基因（如大肠杆菌、霍乱弧菌的毒力基因）在正常与VBNC状态下表达情况的比较，尚未能对VBNC发生机制做客观评述。因而，凭借VBNC特异性基因建立针对VBNC细菌检测方法的研究也只能停滞不前。尽管应用高通量的基因芯片技术能合理躲避瓶颈问题，可对VBNC发生机制进行深入研究，但是繁杂的工作以及大量的资金投入亦会使更多的研究者却步。

发明内容：

本发明目的是解决VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，使得研究者无法做更为深入地研究的问题，而提供一种VBNC细菌的研究模型，似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌及其鉴定方法。

似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌的鉴定方法，它包括：用常规的进入VBNC状态诱导方法诱导，可培养的既为似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌;

同时设立对照组，所述的对照组为和待检细菌相同种类的标准细菌；对照组用常规方法培养不可培养；

所述的不可培养，连续常规培养3次，每次平板菌落数均为0。

所述的常规的进入VBNC状态诱导方法为在适合该种细菌的液体培养基中，4℃培养。

似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌，它是通过上述方法中的任意一种方法鉴定的可培养细菌。

似活的非可培养状态（VBNC）的可培养鼠伤寒沙门氏菌，保藏号为CGMCC No. 6578 。

所述的似活的非可培养状态（VBNC）的可培养鼠伤寒沙门氏菌，它是由鼠伤寒沙门氏菌ATCC 10708，在亚硝基胍（NTG）作用下，至死率在85～95%的条件下，诱变获得的；

所述的似活的非可培养状态（VBNC）的可培养鼠伤寒沙门氏菌，在液体LB培养基中，4℃培养，进入VBNC状态后，对照组鼠伤寒沙门氏菌ATCC 10708用常规培养方法培养不可培养，可培养的即为似活的非可培养状态（VBNC）的鼠伤寒沙门氏菌可培养。

本发明人，多年从事活的非可培养状态（VBNC）细菌的研究，细菌VBNC状态是指细菌在不良环境中，细胞缩成球形，用常规方法（平板法、最大可能近似值法）培养时，不能生长繁殖，但仍然是活的一种特殊存在形式。发现了一种进入VBNC后，却仍然可用常规方法培养的细菌，也就是说本发明人发现了一种细菌的另一种活的存在状态，它具有所有的非可培养状态（VBNC）细菌的表征，具备了VBNC细菌相关基因，不用经过细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable, VBNC)的复苏过程（例如：用SAPI培养基复苏），用常规方法培养既可培养。本发明人将其命名为似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌，筒称：似VBNC的可培养细菌。本发明人获得了多株似VBNC的可培养细菌，其中，似活的非可培养状态（VBNC）的可培养鼠伤寒沙门氏菌MVS株和似活的非可培养状态（VBNC）的可培养乳酸菌MVR株，已于2012年9月18日，送至中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为CGMCC No.6578和CGMCC No.6579。

本发明提供的似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌，是能准确获取具有稳定遗传性状的VBNC细菌研究模型，解决了VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，使得研究者无法做更为深入地研究的瓶颈问题，从而为客观揭示VBNC形成机制奠定基础。似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌，是在不良环境中能持续存活的“菌种”，作为益生菌制剂及疫苗等方面，提高保质期具有广阔的应用前景。本发明还提供了似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌的制备和鉴定方法。

附图说明

图1为预扩增产物琼脂糖凝胶检测，其中，M：分子量标记；1：VBNC细菌突变体；2：正常细菌；3：阴性对照；

图2 选择性扩增产物琼脂糖凝胶检测，其中，M：分子量标记；1,2：阴性对照；3,4：正常细菌；5,6：VBNC细菌突变体；

图3 选择性扩增产物PAGE检测，其中，M：分子量标记；1：阴性对照；2：正常细菌；3：VBNC细菌突变体；

图4 分子量标记为200bp和700bp的DHPLC图谱；

图5 阴性对照组的DHPLC图谱；

图6未经NTG处理的正常细菌选择性扩增产物的DHPLC图谱；

图7 VBNC细菌突变体的选择性扩增产物的DHPLC图谱；

图8 VBNC细菌突变体DHPLC图谱鉴定结果；

图9选择性扩增产物PAGE检测，其中，M：分子量标记；1：阴性对照；2：乳酸杆菌；3：VBNC乳酸杆菌突变体。

具体实施方式

实施例1 鼠伤寒沙门氏菌化学诱变。

一、实验组

1. 菌株培养。将鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)标准株（ATCC 10708）纯培养物接种至含有100ml LB液体培养基的三角烧瓶中，37℃，180r/min，通气振荡培养过夜，当OD₆₀₀接近0.6时，停止培养。

2. 鼠伤寒沙门氏菌悬液制备。取浓度为5×10⁸个/ml的细菌培养液2ml， 6000rpm，离心5min，弃上清，灭菌生理盐水洗菌体2次，2ml磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液（0.93%的柠檬酸，0.11M磷酸二氢钠，pH 5.2）悬浮菌体。

3. 亚硝基胍（NTG）诱变鼠伤寒沙门氏菌。取1ml细菌悬浮液，加入100μl NTG（工作浓度为1mg/ml），此剂量对细菌的致死率为92%。充分混合后，在30℃条件下作用30min，反应结束后用0.1M磷酸缓冲液［pH7.0］终止反应；将经NTG处理和处理的菌液进行10倍稀释，涂布于SS固体培养基中，37℃培养。

二、对照组

将鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)标准株（ATCC 10708）纯培养物接种10倍稀释，涂布于SS固体培养基中，37℃培养。

实施例2 似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌的制备。

1. VBNC状态诱导。

将在沙门、志贺菌属固体培养基（SS）上生长出的，实验组和对照组的单菌落，接种到100ml的液体LB中，37℃振荡培养至OD₆₀₀接近0.6时，停止培养。取1mL菌液至无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水洗菌体2次，然后将菌液再次转移至含有100ml液体LB中，4℃培养。

3. VBNC状态检测。

按专利200810051106.9提供方法检测，即取待检菌液50μl，加入SYTO9和PI各25μl，吹吸混匀，避光染色15～20min。然后将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，吸取适量菌体滴在微孔滤膜上，待液体刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用力压片，使细菌充分固定在膜上。最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用落射荧光显微镜于暗室观察。对照组及实验组均在荧光显微镜可见呈现绿色荧光的菌体，证明两组均进入VBNC状态。

3. 可培养能力测定。取待检菌液50μl，用灭菌的L型玻璃棒将菌液均匀涂布在LB固体培养基上。然后将平板正向培养30min后，再倒置于37℃中，培养20～28h。经NTG处理的菌体仍能在平板上生长（实验组）。对照组连续培养3次，无生长能力。

实施例3：VBNC沙门氏菌突变体鉴定。

1. 基因组DNA双酶切。分别取正常条件（37℃，LB液体培养18h）培养的沙门氏菌和疑似VBNC细菌突变体的基因组DNA，用MseI和 EcoRI两种酶对基因组DNA进行酶切。酶切反应体系：DNA模板2μl，MseI和 EcoRI各 3U，双酶共用Buffer 2μl，100×BSA（10mg/ml）0.2μl，补水至20μl。37℃酶切5h，65℃变性20min。

2. 双酶切产物与接头连接。酶切产物20μl，EcoRI接头R、EcoRI接头F、 MseI接头R、MseI接头F各1μl，T₄DNA连接酶5U，T₄DNA连接酶 Buffer 2μl，补水至50μl。16℃连接过夜。

3. 预扩增。连接产物2μl，预扩增引物P1和P2各10pmol，dNTP 2μl，Ex Taq酶5U，PCR Buffer 2μl，补水至50μl。反应程序：94℃预变性5min→94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，30个循环→72延伸10min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上均呈弥散状，见图1。

4. 选择性扩增。20倍稀释的预扩增产物2μl，选择性扩增引物P1和P2各10pmol，dNTP 2.5μl，Ex Taq酶2.5U，PCR Buffer 2.5μl，补水至25μl。反应程序：94℃预变性5min→94℃ 30s，65℃ 30s（0.7℃/循环）共12个循环，72℃ 60s→94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s 共18个循环→72℃，10min。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分布多条条带，正常沙门氏菌与VBNC沙门氏菌突变体指纹图谱不相同，但重复性较好，而阴性对照组仅出现引物二聚体，见图2。

5. 8%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。PAGE凝胶在电压为100V，恒定功率为50W、温度为50℃条件下预电泳约50min。而后吸取1×TBE缓冲液冲冼加样孔，将2μL 6×电泳上样缓冲溶液点在Parafilm膜上，并与5μL选择性扩增产物混合，加至加样孔内。设电压为50V，恒定功率50W，直到二甲苯青迁移至凝胶底部，停止电泳。最后用溴化乙锭染色30min。产物在PAGE凝胶上可随机分布众多清晰条带，数量远超过琼脂糖凝胶（图3），并且VBNC沙门氏菌突变体与正常菌的图谱可见明显差异。

6. DHPLC鉴定。取VBNC沙门氏菌和正常沙门氏菌的选择性扩增产物、选择性扩增的阴性对照组、含有100bp和700bp片段的分子量标记各10μl置于离心管中，并放于同一检测盘内。设定DHPLC仪器的流动相参数，即缓冲溶液A 浓度为50%, 缓冲溶液B 浓度为50%。流速为0.9ml/min，并选用荧光检测器。DHPLC图谱显示：含有分子量标记的样品出现两个峰，分别为100bp和700bp（图4）；阴性对照组仅出现引物二聚体，故只在近100bp处出现色谱峰（图5）；VBNC细菌突变体（图6）与正常菌（图7）的色谱峰数量及出峰时间均存在明显差异（图8）。

实施例3 植物乳酸杆菌化学诱变

乳酸杆菌（L）是吉林农业大学预防兽医学实验室从自然发酵酸牛奶中分离，经16sRNA鉴定为植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）。由吉林农业大学预防兽医学实验室保存。

1）似活的非可培养状态的可培养乳杆菌MVR株的获得。

实验组：取5×10⁸个/ml的乳酸杆菌（L）菌体悬浮液1ml，加入100μl NTG（1mg/ml），充分混合后，在30℃条件下作用30min，反应结束后用0.1M磷酸缓冲液［pH7.0］终止反应，NTG用量以致死率达到80%～95%为宜。

对照组：未经NTG处理的乳酸杆菌（L）悬浮液。

实验组、对照组的菌液进行10倍稀释，涂布于MRS固体培养基中，37℃培养。

将单菌落接种到100ml的液体MRS中，振荡培养至OD₆₀₀接近0.8时，取1ml菌液至pH 2. 0～3. 0，MRS 液体培养基中, 4℃兼性厌氧培养。在VBNC诱导过程中，取经NTG和未经NTG处理的菌液涂布于固体MRS中，37℃培养，

未经NTG处理的乳酸杆菌作为对照组在35d 内可培养菌数显著下降，连续培养3d，无细菌生长，按专利200810051106.9提供方法检测，即取待检菌液50μl，加入SYTO9和PI各25μl，吹吸混匀，避光染色15～20min。然后将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，吸取适量菌体滴在微孔滤膜上，待液体刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用力压片，使细菌充分固定在膜上。最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用落射荧光显微镜于暗室观察。而荧光显微镜观察全部为呈现绿色荧光的活菌，表明对照组已于第35d进入VBNC状态。而经NTG处理的实验组的可培养菌数在整个观察期内一直具备可培养能力。采用AFLP法，对实验组、对照组的基因组DNA，用MseI和 EcoRI两种酶对对基因组DNA进行酶切，酶切产物与接头连接后，依次进行预扩增和选择性扩增。选择性扩增的模板是预扩增产物，在扩增前要对预扩增产物做20倍稀释，最后选择性扩增产物用8%中性聚丙烯酰胺凝胶EB染色检测。图9可见每条泳道上随机分布的清晰条带，而且条带数目适中，谱带质量较高，产物多集中在50bp~750bp。而且实验组与对照组间存在多条差异条带，说明两者基因组DNA存在多态性。由此证明乳酸杆菌在NTG诱变后，其基因组发生了突变。实验组中获得经NTG处理的VBNC乳酸杆菌突变体，命名为似活的非可培养状态可培养乳杆菌MVR株，已于2012年9月18日，送至中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6579。

Claims

1.似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，它包括：用常规的进入VBNC状态诱导方法诱导，可培养的为似活的非可培养状态的可培养细菌。

2.根据权利要求1所述的似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，其特征在于：同时设立对照组，所述的对照组为和待检细菌相同种类的标准细菌；对照组用常规方法培养不可培养。

3.根据权利要求2所述的似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，其特征在于：所述的不可培养，连续常规培养3次，每次平板菌落数均为0。

4.根据权利要求1、2或3所述的似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，其特征在于：所述的常规的进入VBNC状态诱导方法为在适合该种细菌的液体培养基中，4℃培养。

5.似活的非可培养状态的可培养细菌，它是通过权利要求1的鉴定方法鉴定的可培养细菌。

6.似活的非可培养状态的可培养鼠伤寒沙门氏菌，保藏号为CGMCC No. 6578。

7.根据权利要求6所述的似活的非可培养状态的可培养鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于，它是鼠伤寒沙门氏菌ATCC 10708，在亚硝基胍作用下，至死率在85～95%的条件下，诱变获得的。

8.根据权利要求7所述的所述的似活的非可培养状态的可培养鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于：在液体LB培养基中，4℃培养，进入VBNC状态后，对照组鼠伤寒沙门氏菌ATCC 10708用常规培养方法培养不可培养，可培养的即为似活的非可培养状态的鼠伤寒沙门氏菌可培养。