CN109937879B - 一种温山药转基因毛状根的诱导方法 - Google Patents

Abstract

一种温山药转基因毛状根的诱导方法，属于植物培养和转基因技术领域。该方法包括：1)外植体的消毒；2)外植体的培养；3)侵染液的制备；4)毛状根的诱导和繁殖；5)毛状根的繁殖。本发明以温山药带叶腋的茎段为外植体，通过对诱导培养基、分化培养基和生根培养基进行优化，通过诱导、分化和生根培养获得完整植株，再通过发根农杆菌K599(带重组质粒pRI101‑AN‑gfp)活体侵染温山药无菌苗的茎，获得转基因毛状根，并通过PCR和荧光显微观察鉴定毛状根为转基因毛状根，建立了温山药转基因毛状根诱导体系，实现了温山药的快速有效繁殖。

Description

一种温山药转基因毛状根的诱导方法

技术领域

本发明属于植物培养和转基因技术领域，具体涉及一种温山药转基因毛状根的诱导方法。

背景技术

山药在我国具有2000多年的栽培应用历史，既可作杂粮食用，也有药用价值。温山药(Dioscorea alata,cultivar“Wenshanyao”)为浙江特产的山药品种，具有健脾胃、益肺肾、补气养阴等药效，栽培历史悠久。

温山药传统繁殖方法为营养繁殖，不仅耗用大量药用部位，且由于长期营养繁殖，造成品种退化、产量降低，提高品质、增加产量，已成温山药生产中亟待解决的问题。另一方面，发根农杆菌侵染植物时，能将发根农杆菌携带的Ri质粒中的T-DNA插入并整合到植物细胞基因组中，在植物细胞感染的伤口部位产生毛状根。毛状根可以在无激素的培养基上大量自主生长，可以作为生物反应器生产植物次生代谢产物；而且，也可进一步再生完整植株。

而在现有技术中未见对温山药进行组织培养，并通过农杆菌诱导建立温山药诱导转基因毛状根的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种温山药转基因毛状根的诱导方法的技术方案。

所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：

1)外植体的消毒

取外植体进行清洗、消毒，再将叶片剪成1cm见方小块，带或不带叶腋的茎段均剪成长0.5-1cm；

2)外植体的培养

取步骤1)得到的外植体接种于诱导培养基上，每瓶接种3-5个，遮光培养15-25天，获得愈伤组织；取愈伤组织剔除愈伤四周褐化的部分，转入分化培养基上，光照培养20-30天，获得丛生芽；取丛生芽切割后的单个芽转入生根培养基上，光照培养15-20天，获得完整植株；所述诱导培养基为含2.0mg/L的2,4-D的MS培养基，所述分化培养基为含6-BA 2mg/L+IAA 0.5mg/L的MS培养基，所述生根培养基为含1.0mg/L IAA的MS培养基；诱导培养、分化培养和生根培养的培养温度均为24±2℃；

3)侵染液的制备

取重组型发根农杆菌K599经活化和培养后得到侵染液；

4)毛状根的诱导和繁殖

取转接后12-15d、生长旺盛组培苗，用灭菌的解剖针在组培苗茎上刺出多个伤口，将2-10μL侵染液滴加到伤口处，随后将侵染后的组培苗继续在24±2℃、遮光培养15-30天，得到毛状根；

5)毛状根的繁殖

待毛状根长2-3cm后，剪下毛状根并转入含500mg/L Cef+50mg/L Km的MS培养基上，每20-30d继代1次，经过3-4次继代完全杀灭农杆菌后，转入MS基本培养基繁殖毛状根。

所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于所述的步骤1)中外植体清洗、消毒具体为：外植体先用稀释的洗洁精浸泡5min，自来水冲洗干净后，用稀释5倍的次氯酸钠消毒20min，用无菌水冲洗3次，最后用无菌的滤纸吸干表面水分。

所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于所述的步骤2)中分化培养和生根培养的光照条件为：1000-2000lux。

所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于所述的步骤2)侵染液的制备具体为：将-80℃保存的重组型发根农杆菌K599含有50mg/L Km+50mg/L Str的LB培养基上划线培养；取培养后的单菌落于含有50mg/L Km+50mg/L Str的LB液体培养基中过夜培养；当农杆菌菌液OD值为1.0时，取1mL菌液于1.5mL离心管中，离心、除上清；用MS添加25mg/L AS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值为0.1，用作侵染液。

本发明以温山药带叶腋的茎段为外植体，通过对诱导培养基、分化培养基和生根培养基进行优化，通过诱导、分化和生根培养获得完整植株，再通过发根农杆菌K599(带重组质粒pRI101-AN-gfp)活体侵染温山药无菌苗的茎，获得转基因毛状根，并通过PCR和荧光显微观察鉴定毛状根为转基因毛状根，建立了温山药转基因毛状根诱导体系，实现了温山药的快速有效繁殖。

本发明获得的转基因毛状根，可为利用毛状根工厂化生产温山药的药用成分和作为反应器生产重组蛋白提供技术支撑。

附图说明

图1为温山药再生完整植株，图中A：形成愈伤组织；B，C：愈伤组织分化出丛生芽；D：再生带根系的完整植株；

图2为诱导毛状根和毛状根的繁殖，图中A，B，C：茎的伤口处诱导出的毛状根；D：繁殖的毛状根；

图3为毛状根的PCR鉴定和荧光显微观察，图中A：rolB基因引物扩增；B：gfp基因引物扩增；C：荧光下毛状根发出强烈的荧光；M：DNA标准分子量；1：普通根；2：发根农杆菌K599菌液；3-5：毛状根3个不同根系。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例

一、材料与方法

1、材料

温山药块茎由浙江省温州市天禾生物科技有限公司惠赠。块茎种植于本单位玻璃暖房中，获得实生苗。取实生苗的叶、茎段和带一个叶腋的茎段即带节的茎段，作为外植体。

2、外植体的消毒

外植体先用稀释的洗洁精浸泡5min、自来水冲洗干净后，用稀释5倍的次氯酸钠消毒20min，用无菌水冲洗3次，最后用无菌的滤纸吸干表面水分。用剪子将叶片剪成约1cm见方小块，带或不带叶腋的茎段均剪成长0.5-1cm。

3、外植体的培养

外植体诱导愈伤组织的培养基用MS基本培养基，添加不同配比的2,6-D和NAA；诱导芽的培养基用MS基本培养基，添加不同配比的6-BA和IAA；诱导生根的培养基用MS基本培养基，添加不同配比的IAA和NAA(表1)。

外植体消毒后接种于诱导培养基上，每瓶接种3-5个，遮光培养20天。取获得的愈伤组织，剔除愈伤四周褐化的部分，转入分化培养基上分化芽，光照培养25天。取获得的芽转入生根培养基上再生根系，获得完整植株，光照培养15天。培养温度均为24±2℃，光照条件均为1500lux。

4、发根农杆菌K599的活化和对活体无菌苗叶片侵染

将-80℃保存的重组型发根农杆菌K599(即带内源质粒pRi2659和外源质粒pRI101-AN-GFP(Du,S.,T.Xiang,Y.Song,L.Huang,Y.Sun and Y.Han,2015.Transgenichairy roots of Tetrastigma hemsleyanum:induction,propagation,geneticcharacteristics and medicinal components.Plant Cell Tiss.Org.,122:373-382),在LB+50mg/L Km+50mg/L Str的培养基上划线培养，28℃。取单菌落于LB+50mg/L Km+50mg/LStr的液体培养基中过夜培养，28℃、200r/min。当农杆菌菌液OD值约为1.0时，取1mL菌液于1.5mL离心管中，离心、除上清；用MS添加25mg/L AS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.1，用作侵染液。5、毛状根的诱导和繁殖

取转接后12-15d、生长旺盛组培苗，用灭菌的解剖针在组培苗茎上刺出多个伤口。用20μL微量进样器吸取2-10μL侵染液滴加到伤口处，随后将侵染后的组培苗继续在24±2℃、遮光培养。当伤口处诱导出的毛状根长约2-3cm后，剪下毛状根转入MS+500mg/L Cef+50mg/L Km培养基上。每20-30d继代1次，经过3-4次继代完全杀灭农杆菌后，转入MS基本培养基繁殖毛状根。

6、毛状根的分子鉴定和荧光显微镜观察

利用生工公司植物基因组DNA提取试剂盒提取毛状根和普通根的DNA。根据发根农杆菌K599Ri质粒pRi2659T-DNA上rolB序列(GenBank EF433766)设计引物5’-GCCAGCATTTTTGGTGAACT-3’(如SEQ ID NO.1所示)和5’-CTGGCCCATCGTTCTAAAAA-3’(如SEQID NO.2所示)，并根据gfp基因序列(GenBank U17997)设计引物5’-GTCAGTGGAGAGGGTGAAGG-3’(如SEQ ID NO.3所示)和5’-AAAGGGCAGATTGTGTGGAC-3’(如SEQID NO.4所示)，引物由生工公司合成。参照Du et al(2015)的方法，制备PCR扩增反应。用Bio/Rad公司9700型PCR仪进行扩增。PCR反应程序为：94℃预变性5min，按94℃变性45sec、55℃退火45sec、72℃延伸90sec的程序进行30个循环，循环结束后在72℃下延伸10min。扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳0.5-1h(5V/cm)，溴化乙锭染色，用Bio/Rad公司凝胶成像系统观察和拍照记录。另外，利用Zeiss荧光显微镜，在蓝色激发光下(滤光片FITC)对诱导获得的毛状根进行荧光检测，并用Zeiss荧光显微镜配套的数码成像系统拍照记录。

二、结果

1、愈伤组织的诱导、分化和再生植株

不同外植体诱导愈伤组织的情况不同。叶在MS添加2,4-D的培养基上能够诱导出愈伤组织，而在添加NAA的MS培养基上均未诱导出愈伤组织；而茎段、带叶腋的茎段在添加2,4-D或者添加NAA的MS培养基上均能诱导出愈伤组织。其中，在添加2.0mg/L的2,4-D的MS培养基上，带叶腋的茎段诱导率最高，可达95％(表1)。选择从带叶腋的茎段诱导获得的愈伤组织，经过切割分块后，转入不同激素配比的芽诱导培养基上，结果显示，在MS+6-BA2mg/L+IAA 0.5mg/L培养基上，芽分化率最高，为86.7％(表2)，且均分化为丛生芽。丛生芽切割后的单个芽在0.5-2.0mg/L的IAA的MS培养基上均能分化出根，其中在MS+1.0mg/L IAA培养基上，诱导根的效果最佳；而在含不同浓度的NAA的MS培养基上，出现基部愈伤化，未能正常分化出根(表3)。温山药再生完整植株的过程见图1。

表1愈伤组织的诱导结果

表2愈伤组织再分化芽的结果

表3生根的结果

+:每株根系1-2个；++:每株根系1-3个；+++:每株根系1-4个及以上；-:无根

2、毛状根的诱导繁殖

发根农杆菌K599侵染组培苗叶片，10-15d后切口周围可出现典型的毛状根(图2A、B和C)。待毛状根长到2-3cm时，剪取毛状根转至添加500mg/L Cef的继代培养基上，20-30d即可获得大量增殖的毛状根(图2D)。

3、毛状根的PCR分析和荧光显微观察

利用引物分别对获得的毛状根以及普通根基因组DNA和发根农杆菌K599菌液进行PCR扩增，扩增结果见图3A和B。在鉴定的3个毛状根系中，利用rolB基因引物分别扩增出与菌液扩增条带大小一致约700bp条带，利用gfp基因引物分别扩增出与菌液扩增条带大小一致约500bp条带；而普通根没有扩增出任何条带，说明获得的毛状根根系为含有外源目的基因gfp的转基因毛状根。在蓝色激发光下(滤光片：FITC)，转基因毛状根发出强烈的绿色荧光(图3C)，而普通根未见荧光，说明gfp基因在转基因毛状根中实现了正常表达。

利用毛状根作为反应器是生产药用植物次生代谢物的一条有效途径。温山药富含黄酮、山药素、皂苷和植酸胆碱等多种药用成分。本研究利用发根农杆菌K599侵染温山药活体无菌苗叶片，成功诱导出转基因毛状根，这为将来利用毛状根工厂化地生产温山药的药用成分提供了基础。特别值得一提的是，对所筛选的毛状根根系进行荧光显微观察表明，转入的外源标记基因gfp在转基因毛状根中实现了正常表达，这也为将来利用毛状根作为反应器生产重组蛋白药物提供了技术支撑。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种温山药转基因毛状根的诱导方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 1

gccagcattt ttggtgaact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

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<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

aaagggcaga ttgtgtggac 20

Claims (3)

1.一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于包括以下步骤：

1）外植体的消毒

取外植体进行清洗、消毒，将带或不带叶腋的茎段均剪成长0.5-1 cm；

2）外植体的培养

取步骤1）得到的外植体接种于诱导培养基上，每瓶接种3-5个，遮光培养15-25天，获得愈伤组织；取愈伤组织剔除愈伤四周褐化的部分，转入分化培养基上，光照培养20-30天，获得丛生芽；取丛生芽切割后的单个芽转入生根培养基上，光照培养15-20天，获得完整植株；所述诱导培养基为含2.0 mg/L的2,4-D的MS培养基，所述分化培养基为含6-BA 2 mg/L+IAA0.5 mg/L的MS培养基，所述生根培养基为含1.0 mg/L IAA的MS培养基；诱导培养、分化培养和生根培养的培养温度均为24±2℃；

3）侵染液的制备

取重组型发根农杆菌K599经活化和培养后得到侵染液，所述重组型发根农杆菌K599带内源质粒pRi2659和外源质粒pRI101-AN-GFP，具体为：将-80℃保存的重组型发根农杆菌K599 在含有50 mg/L Km+ 50 mg/L Str的LB培养基上划线培养；取培养后的单菌落于含有50 mg/L Km+ 50 mg/L Str的LB液体培养基中过夜培养；当农杆菌菌液OD值为1.0时，取1mL菌液于1.5 mL离心管中，离心、除上清；用添加25 mg/L AS的MS液体培养基悬浮菌体，离心、除上清；再用MS液体培养基稀释至OD值为0.1，用作侵染液；

4）毛状根的诱导和繁殖

取转接后12-15 d、生长旺盛组培苗，用灭菌的解剖针在组培苗茎上刺出多个伤口，将2-10 μL侵染液滴加到伤口处，随后将侵染后的组培苗继续在24±2℃、遮光培养15-30天，得到毛状根；

5）毛状根的繁殖

待毛状根长2-3 cm后，剪下毛状根并转入含500 mg/L Cef+ 50 mg/L Km的 MS培养基上，每20-30 d继代1次，经过3-4次继代完全杀灭农杆菌后，转入MS基本培养基繁殖毛状根。

2.如权利要求1所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于所述的步骤1）中外植体清洗、消毒具体为：外植体先用稀释的洗洁精浸泡5 min，自来水冲洗干净后，用稀释5倍的次氯酸钠消毒20 min，用无菌水冲洗3次，最后用无菌的滤纸吸干表面水分。

3.如权利要求1所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法，其特征在于所述的步骤2）中分化培养和生根培养的光照条件为：1000-2000lux。

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