CN102511398A - 蕲山药组培育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种蕲山药组培育苗方法，它包括外植体的选择与消毒、愈伤组织诱导、不定芽分化、生根培养和炼苗移栽等步骤。本发明以盆栽蕲山药的带节茎段为外植体，经体积浓度70％酒精和2wt％次氯酸钠消毒后，在MS+NAA+BA培养基上进行愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养，生根苗移栽到混合基质中培育，混合基质质量比组成为：菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。与直接播种块根和插条繁殖等传统的蕲山药育苗方法相比，本方法具有种苗遗传稳定性好、繁殖周期短与繁殖系数高、操作简单，可进行种苗工厂化生产。采用本方法不仅可以克服蕲山药生产上用种量大、成本较高和种性退化的难题，还可以通过规模化繁殖种苗，为蕲山药的优质丰产和产业化提供技术支持。

Description

蕲山药组培育苗方法

技术领域

本发明涉及一种蕲山药组培育苗方法，通过植物组织培养技术实现蕲山药种苗的规模化生产。属应用生物学、农业生物技术领域。

技术背景

山药为薯蓣科薯蓣属植物(Dioscorea spp.)块根的俗称，是传统的药食同源型经济作物，在我国已有2000多年的种植历史。我国栽培的山药主要有家山药和田薯两大类。家山药块根较小，分布不广，除蔬菜食用外，常作药用；田薯分布较广，多数品种属本种，主供蔬菜食用。蕲山药(Dioscoreae Oppositae“Qi”)属家山药种，是以医圣李时珍故里湖北省蕲春县为原产地的鄂东地区大面积种植的的地方山药良种。按块根形态，蕲山药分为三种类型，即佛手型、短棒型和马蹄型。因蕲山药部分品种的块根形似佛手，农户俗称蕲山药称为佛手山药。当地独特的土壤气候条件，孕育了蕲山药枝肥个大、肉质细腻、色白汁多、淀粉丰富、口感好的特质，蕲山药“益肾气、健脾胃、止泻痢、化痰涎、润皮毛”之功效，为《本草纲目》所推崇，历为鄂东名产。

目前，直接播种块根是生产上蕲山药常用的繁殖方法，这种传统的种植习惯，已经不能适应蕲山药优质丰产和产业化的需要，主要表现在三个方面：1)用种量大，成本较高。蕲山药种薯使用量为2,250～3,000kg/hm²，按批发价6元/kg计算，费用为13,500～18,000元/hm²。2)不利于种性的保持。出于销售和经济效益的考虑，农户习惯于将个头大、卖相好的薯块作为商品出售，而将个头小、长相不好的留作种薯，这种不科学的留种方法使得蕲山药的种性出现退化，块根形状变异。3)不利于集约化生产。由于种薯个体的差异，常导致种薯发芽或出苗的时间不相一致，成熟的时间也存在差异，给蕲山药的生产管理和采收加工带来难度。为了解决上述难题，人们曾尝试用蕲山药单茎节叶插条繁殖，进行良种育苗，但由于存在生根困难、成活率低，以及不能大规模快速繁殖整齐一致的苗木等原因，无法在生产实际中得到应用。

植物的组织培养是根据植物细胞全能性理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。由于植物组织培养具有占用空间小、不受地区、季节限制，培养周期短、可短时间大量繁殖，不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征，以及投资少，经济效益高等优势，该技术一经问世，便迅速在花卉、农作物和林木种苗生产上得到广泛应用，表现出强大的生命力。因此，借助植物的组织培养技术，建立蕲山药组培育苗方法，规模化生产蕲山药种苗，以满足蕲山药的优质丰产和产业化需要是可以实现的。

发明内容

本发明的目的是为蕲山药种苗的规模化生产提供一种结果稳定可靠的组培育苗方法，利用该方法培育蕲山药种苗具有遗传稳定性好、成本低廉、育苗周期短、繁殖系数高、操作简便的特征。

实现本发明目的的蕲山药组培育苗方法，其特征是：以蕲山药的离体器官为外植体，通过组织培养方法，培育蕲山药种苗。

本发明的蕲山药组培育苗方法，包括外植体选择与消毒、愈伤组织诱导、不定芽分化、生根培养和试管苗移栽步骤：以盆栽蕲山药的带节茎段为外植体，经体积浓度70％酒精和2wt％次氯酸钠依次消毒后，在MS+NAA+BA培养基上进行愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养，生根苗移栽到混合基质中培育，所述的混合基质质量比组成为菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。

所述的蕲山药缓培种苗方法的步骤为：

步骤1、选择外植体：选择蕲山药组织器官为外植体，经消毒剂处理后用于接种；

步骤2、愈伤组织诱导：将步骤1选择的外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导产生愈伤组织；

步骤3、愈伤组织分化不定芽：将步骤2产生的愈伤组织，接种于愈伤组织分化培养基上，诱导产生不定芽；

步骤4、生根培养：将步骤4培养的不定芽，接种于生根培养基上，培养生根苗；

步骤5、生根苗移栽：将步骤5产生的生根苗，进行炼苗后移栽至种植盆内，培养容器苗。

本发明的蕲山药种苗的组培快繁方法所需试验材料及仪器设备：

植物材料：蕲山药(Dioscoreae Oppositae“Qi”)块根；

化学试剂：(1)生长素：NAA(α-Naphthaleneacetic，α-萘乙酸，由PhytechnologyLaboratories，LLC生产)；(2)细胞分裂素：BA(Benzy Laminopurine，由PhytechnologyLaboratories，LLC生产)；(3)MS培养基；

主要仪器设备：电子天平、电热干燥箱、高压灭菌锅、超净工作台、电磁炉、磁力搅拌器、酸度计及植物培养室。

本发明的蕲山药组培育苗方法的操作步骤为：

第1步、外植体的选择与消毒

春季气温稳定在15℃以上后，选择优质的种薯栽种于花盆内，待藤茎长成后，取有节茎段为外植体，经自来水冲洗和消毒剂消毒后备用；

第2步、愈伤组织的诱导

用MS+NAA 0.5～1.0mg/L+BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L培养基诱导愈组织，培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照16h/d、光强3,000lux、培养基pH值5.5～5.8；

第3步、愈伤组织分化不定芽；

用MS+NAA 0.1～0.5mg/L+BA 0.5～0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L培养基，诱导愈伤组织分化不定芽，培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照16h/d、光强3,000lux、培养基pH值5.5～5.8；

第4步、生根培养

用MS+NAA 0.01～0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L的培养基，培养生根苗，培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照条件为小于5,000lux的自然散射光加人工辅助光源3,000lux，光照16h/d、培养基pH值5.5～5.8；

第5步、炼苗和移栽

将生根苗转入大棚内炼苗2周后，移栽至混合基质中培育，所述的混合基质组成质量比为菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。

附图说明

图1为诱导愈伤组织分化不定芽照片。

图2为诱导愈伤组织分化不定芽照片。

图3为接种于MS+NAA0.01～0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L的培养基上的培养生根苗照片。

图4为接种于MS+NAA0.01～0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L的培养基上的培养生根苗照片。

图5为大棚内炼苗2周后，移栽在盛有生根基质的培养盆内的生根苗照片。

生根基质土壤为混合基质，其质量比组成为菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。

图6为大棚内炼苗2周后，移栽在盛有生根基质的培养盆内的生根苗照片。

生根基质土壤为混合基质，其质量比组成为菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。

具体实施方式

本发明蕲山药组培育苗方法的操作步骤为：

第1步、外植体的选择与消毒

春季气温稳定在15℃以上后，选择优质的种薯栽种于花盆内，待藤茎长成后，以有节茎段为外植体，外植体用自来水冲洗干净和消毒剂消毒后备用；

第2步、愈伤组织的诱导

以MS+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L为基本培养基，进行NAA与BA配比试验。将外植体接种在不同NAA与BA配比的基本培养基上，25d后调查实验结果，筛选出诱导蕲山药愈伤组织的最适培养基。培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照16h/d、光强3,000lux、培养基pH值5.5～5.8；

第3步、愈伤组织分化不定芽

以MS+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L为基本培养基，进行NAA与BA配比试验，将愈伤组织接种在不同NAA与BA配比的基本培养基上，35d后调查实验结果，筛选出蕲山药愈伤组织分化不定芽的最适培养基。培养条件同第二步；

第4步、生根培养

以MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L为基本培养基，进行NAA浓度试验。将继代培养的不定芽接种在不同NAA浓度的基本培养基上，培养15d后调查实验结果，筛选出蕲山药不定芽生根的最适培养基。光照条件为小于5,000lux的自然散射光加人工辅助光源3,000lux，其它培养条件同第2步；

第5步、炼苗和移栽

将生根苗转移到大棚内炼苗后，栽植于混合基质。

实施例1

蕲山药组培育苗方法流程为：

1、制备外植体

取盆栽蕲山药藤茎用自来水冲洗30min后，转入超净工作台，用体积浓度70％酒精消毒5～10s，再用2wt％次氯酸钠消毒20min，然后用无菌水冲洗5～6次，将藤茎切为长1～1.5cm的带节茎段，置于无菌滤纸上吸干多余的水分后备用。

2、诱导愈伤组织

将外植体接种于MS+NAA 0.5～1.0mg/L+BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L培养基上，诱导愈组织，培养条件：温度25～28℃、相对湿度75～80％、光照16h/d、光强3，000lux、培养基pH值5.5～5.8。

3、愈伤组织分化不定芽

选择质地致密、呈淡褐色的愈伤组织，切成大小为0.5cm×0.5cm的方块，接种于MS+NAA 0.1～0.5mg/L+BA 0.5～0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L培养基上，诱导愈伤组织分化不定芽。培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照16h/d、光强3,000lux、培养基pH值5.5～5.8。结果见图1，图2。

4、生根培养

选择生长健壮、长度3～4cm、长势好的不定芽，接种于MS+NAA 0.01～0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L的培养基上，培养生根苗，培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照条件为小于5,000lux的自然散射光加人工辅助光源3,000lux，光照16h/d、培养基pH值5.5～5.8；试验结果见图3，图4。

5、生根苗移栽

待生根苗长出3～5条约1cm长的不定根时，将生根苗连同培养瓶一起置于室温下炼苗3～5d后，移除封口膜，大棚内炼苗2周后，移栽在盛有生根基质的培养盆内，进行室外培养，实验结果见图5，图6。生根土壤为混合基质，其混合基质质量比组成为菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。

从上述操作步骤可以看出，与直接播种块根和插条繁殖等传统的蕲山药育苗方法相比，本蕲山药组培育苗方法具有如下特点：

1、种苗的遗传稳定性好。本发明的理论依据是植物细胞的全能性，即一个细胞具有产生一个植株的能力。采用本发明培育的蕲山药种苗取材于同一个体的体细胞而不是性细胞，其后代遗传性非常一致，能够保持原有品种的优良性状，对蕲山药的保质保纯有着特殊作用。

2、繁殖周期短、繁殖系数高。本发明只需截取蕲山药藤茎上的一个带节茎段就能在短期内培育出大量生产上所需的优质种苗，每年可繁殖出几万甚至上百万株蕲山药种苗，农户不用预留种薯即可获得较高的经济效益。

3、实验条件容易获得，操作过程简单。采用本发明培育蕲山药种苗，所需的仪器较少且都属于常规仪器，所需药品容易购买，所涉及的外植体选择与消毒、愈伤组织诱导、不定芽分化、生根培养和试管苗移栽等操作过程，都是比较成熟的技术，操作较为简单，一般人员经过简单的培训都能掌握。

4、可用于工厂化生产蕲山药种苗。采用本发明蕲山药组培育苗技术，是在人工控制的条件下的规模化生产，不受自然环境中的季节和恶劣天气的影响，可以常年连续生产，生产效率较高。从取材→消毒接种→愈伤组织诱导→不定芽分化→不定芽生根→生根苗移栽，形成了一整套成熟的工艺流程，可进行工厂化生产。

Claims (3)

1.一种蕲山药组培育苗方法，其特征是：以蕲山药的离体器官为外植体，通过组织培养方法，培育蕲山药种苗。

2.根据权利要求1所述的蕲山药组培育苗方法，包括外植体选择与消毒、愈伤组织诱导、不定芽分化、生根培养和试管苗移栽步骤，其特征是：以盆栽蕲山药的带节茎段为外植体，经体积浓度70％酒精和2wt％次氯酸钠依次消毒后，在MS+NAA+BA培养基上进行愈伤组织诱导、不定芽分化和生根培养，生根苗移栽到混合基质中培育，所述的混合基质质量比组成为菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。

3.根据权利要求1或2所述的蕲山药组培育苗方法，其特征在于，其方法步骤依次为：

(1)春季气温稳定在15℃以上后，选择优质的种薯栽种于花盆内，待藤茎长成后，取有节茎段为外植体，经自来水冲洗和消毒剂消毒后备用；

(2)用MS+NAA 0.5～1.0mg/L+BA 0.1～0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L培养基诱导愈组织，培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照16h/d、光强3,000lux、培养基pH值5.5～5.8。

(3)用MS+NAA 0.1～0.5mg/L+BA 0.5～0.8mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L培养基，诱导愈伤组织分化不定芽，培养条件：温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照16h/d、光强3,000lux、培养基pH值5.5～5.8；

(4)用MS+NAA 0.01～0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L的培养基，培养生根苗，培养温度25～28℃、相对湿度75％～80％、光照条件为小于5,000lux的自然散射光加人工辅助光源3,000lux，光照16h/d、培养基pH值5.5～5.8；

(5)将生根苗转入大棚内炼苗2周后，移栽至混合基质中培育，所述的混合基质组成质量比为菜园土∶山沙∶泥炭＝4∶1∶1。

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