CN1653888A - 淮山(山药)组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种淮山(山药)种苗的组织培养方法。所述方法，包括外植体——块芽的获取；块芽的消毒；接种和大棚假植等步骤。本发明的创新点在于：1.以块芽为外植体。该方法具有种苗病毒少，接种有效率高，遗传性稳定等特点；2.改进组培程序，省略诱导生根的环节，具体做法是把高度达4～5厘米的健壮的芽苗从基部切下，将芽苗基部切口在50毫克/升的NAA溶液中浸泡后，直接扦插入已消毒的细沙中假植，并施以稀释的MS无机盐溶液作养分，所述改进可以减少组培的综合生产成本。本发明，能使淮山优质组培苗真正走出实验室，实现大规模工厂化生产。

Description

淮山(山药)组织培养方法

技术领域：

本发明涉及一种淮山(也称怀山，山药，下同)种苗的组织培养方法。

背景技术：

淮山是一种食药兼用，工业用途广泛的薯蓣属植物，在传统中医学上备受重视，在现代营养学理念上也深受青睐。淮山生长周期短，一般为150～180天；种植面积广，全国除了西藏及西北黄土高原外，其他各省都有栽培，以河南、山西、江西、广西、江苏、山东、湖南比较集中。全球年需求量超过三千万吨，近年来价格有上扬的趋势。

淮山(山药)传统繁殖采用顶芽、薯块、零余子的繁殖法，这些方法成本大，且容易遭到病毒侵害，造成种性退化，产量减少，品质下降。

采用组织培养技术繁殖植物可以得到很高繁殖速率，植物组织培养技术是利用植物细胞全能性(即每一个细胞都潜在着发育成一个新个体的能力)。采取植物上的细胞团，分生组织或营养器官的微小部分，通过人工配制不同营养成分和激素调控，使这些组织细胞形成成千上万小植株并且保存了母体内全部优良遗传性状，这种方法可以在短时间内获得大量试管苗。由于生产幼苗是在试管内进行并摆放在有光照条件下的恒温房间内，四季都可以进行，而且在极少的面积内进行大规模生产，因而不占用土地。

据调查，目前有关淮山离体培养、愈伤组织诱导、组织培养及快速繁殖方面已有报道，其外植体有叶片、茎段、块茎、零余子等，其种苗的组织培养流程通常为：

选取外植体→外植体消毒→接种→转接(继代培养)→诱导生根→炼苗→移栽大棚→大田栽种。

现有淮山组织培养方法存在如下缺陷：

1、常规采用的外植体存在缺陷。常规采用的外植体有叶片、茎段、零余子，综合考虑材料获取的难易，材料成本，工作周期等因素。茎段是最常见的外植体。不论叶片、茎段、块茎还是零余子都生长在野外田间，其表面滋生着各种杂菌，有的菌类甚至长入组织内部，致使表面消毒剂很难杀死组织内部的菌类(消毒剂毒性太强也影响其结构组织)而导致材料在接种之后容易产生污染，从而影响组培成效。至于零余子催苗长成的茎段也存在两大明显缺陷：(1)打破零余子休眠困难，时间成本大，不能大规模生产。(2)外植体(茎尖)小，接种有效率低。所以采用上述的外植体不能实现大规模工厂化生产。

2、培养流程工序复杂，成本高，也难于实现大规模工厂化生产。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有淮山种苗组培方法的不足之处，提供一种可以快速、能实现大规模工厂化生产的淮山种苗的组织培养方法。

本发明目的的实现，第一是选取淮山块茎催生出来的块芽作为外植体进行接种培养；第二是改进生产程序，省略诱导生根的环节；第三是完善培养基配方，提高繁殖系数。

本发明提供的淮山种苗的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体——块芽的获取：块芽即是从块茎上生长出来的小芽，获取块芽包括以下步骤：

(A)选取健壮、表面无病虫害的块茎，用200倍新洁尔灭或0.1％高锰酸钾消毒，每隔10分钟左右喷洒一次，至少3次，然后用自来水冲洗干净，晾干，再切成每块10～12cm放在通风处让创面收干；

(B)6小时后放在已消毒的湿沙中沙藏催芽，可以通过控温，温度保持在20～30℃之间，特别是冬季，可通过日晒，浇温水，提高室温等方式提高块芽生长速度，即使是处于块茎休眠期的冬天，在20天内也可以获得块芽，块芽在块茎上以不同时间先后长出，每块块茎可以获得上百个块芽；

(2)块芽的消毒：块芽长出来后，当直径大约为0.6cm时，用已消毒刀片切下，并切去根须，先用少量洗洁精液浸泡，再用自来水冲洗干净，进入接种室，将已清洁的块芽放在超净工作台上，用75％酒精消毒10秒，再用无菌水冲洗至少3次，然后用0.1％升汞加几滴湿润剂吐温80，灭菌4～6分钟，分两次进行，每次灭菌后都要用无菌水冲洗至少5次，灭菌完成即可进行外植体接种；

(3)接种：接种包括以下工序：

(A)将事先配好的培养基按常规方法灭菌后冷却、凝固待用，培养基由基本培养基(MS)附加2～3％的蔗糖、0.5～3.0mg/L的苄基腺嘌呤(6-BA)和0.01～0.1mg/L的萘乙酸(NAA)构成；

(B)将接种工具(刀、镊子、无菌盘等)在火焰上烧灼消毒后待冷却使用；

(C)用镊子将块芽夹到无菌盘中，接种到已灭菌的培养基中，然后放进培养室中培养、观察，20～30天，可长出芽苗；

(4)大棚假植：在芽的增殖继代过程或在继代增殖培养结束时，把高度达4～5厘米的健壮的芽苗从基部切下，并切除基部可能带有的愈伤组织；将芽苗基部切口在50毫克/升的NAA溶液中浸泡1～2小时后，直接扦插入已消毒的细沙中假植，并施以稀释的MS无机盐溶液作养分，2～3周即可见到叶色转绿并有相当数量的新根萌发，待生长稳定，可移栽于大田。

本发明，其创新性和优点主要表现在：

1、优选外植体，以块芽为外植体，适合大规模工厂化生产。该方法具有种苗病毒少，对培养基吸收快，接种有效率提高15％～20％，生长快，繁殖系数提高10％～15％(请见表1)，栽种之后高产高品质的优点，适合大规模工厂化生产，表现在：(1)省工省本，可以一次性成批处理，减少去田间野外取外植体的工作量，一小块块茎即可长出上百个块芽。(2)获取外植体不受季节限制，一年四季均有大量块芽可取。(3)易消毒，接种有效率相对茎段和零余子作外植体明显提高20％～35％。(4)外植体形态好，生长速度快，遗传性稳定，是高产高质的保证。

2、改进组培程序，省略诱导生根的环节。本发明将分割开的芽苗直接移入温棚进行假植，减少传统方法中诱导芽苗生根的程序，实行该处理虽然成活率从原来的大约90％降低至80％左右，但由于省略了一道无菌操作和培养工序，可以减少培养基及其配制成本，减少无菌操作的人工费用和该过程可能造成的污染的损失以及大量减少培养室的使用面积，从而大幅度地减少了综合生产成本。

3、优化了组培配方。本发明，优化继代培养基配方，通过大量的实验(请见表2)，优选出继代培养基配方：由基本培养基(MS)附加2～3％的蔗糖、2.0mg/L的苄基腺嘌呤(BA)和0.1mg/L的萘乙酸(NAA)构成，其繁殖系数比有关的技术报道提高10％～15％。

                         表1  不同外植体接种效果比较

                     表2 不同培养基对繁殖系数及周期的影响

培养基代号	基本培养基	蔗糖含量(％)	激素配比(mg/L)	繁殖系数	周期(天)
						1	MS	2～3	KT0.5+NAA0.1	2	30
2	MS	2～3	KT1.0+NAA0.1	3	30
						3	MS	2～3	KT2.0+NAA0.1	4	30
4	MS	2～3	KT3.0+NAA0.1	2	32
						5	MS	2～3	BA0.5+IBA0.1	3	30
6	MS	2～3	BA1.0+IBA0.1	4	30
						7	MS	2～3	BA2.0+IBA0.1	5	30
8	MS	2～3	BA3.0+IBA0.1	4	30
						9	MS	2～3	BA0.5+NAA0.1	4	30
10	MS	2～3	BA1.0+NAA0.1	5	28
						11	MS	2～3	BA2.0+NAA0.1	6.5	20～25
12	MS	2～3	BA3.0+NAA0.1	5	30

表中：KT为激动素；IBA为吲哚丁酸；NAA为萘乙酸；BA为苄基腺嘌呤。

总之，本发明在组织培养技术上突破传统对外植体的选取，改进传统组织培养生产的程序，以及完善培养基的配方，组培方法简单，成本低，使淮山优质组培苗真正走出实验室，实现大规模工厂化生产。

具体实施方式：

一种淮山种苗的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体——块芽的获取：获取块芽包括以下步骤：

(A)选取健壮、表面无病虫害的块茎，用200倍新洁尔灭或0.1％高锰酸钾消毒，每隔10分钟左右喷洒一次，喷洒5次，然后用自来水冲洗干净，晾干，再切成每块10～12cm放在通风处让创面收干；

(B)6小时后放在已消毒的湿沙中沙藏催芽，温度保持在20～30℃之间，20天内可获得块芽，块芽在块茎上以不同时间先后长出，每块块茎可以获得上百个块芽；

(2)块芽的消毒：块芽长出来后，当直径大约为0.6cm时，用已消毒刀片切下，并切去根须，先用少量洗洁精液浸泡，再用自来水冲洗干净，进入接种室，将已清洁的块芽放在超净工作台上，用75％酒精消毒10秒，再用无菌水冲洗3次，然后用0.1％升汞加几滴湿润剂吐温80，灭菌4～6分钟，分两次进行，每次灭菌后都要用无菌水冲洗5次，灭菌完成即可进行外植体接种；

(3)初次接种：

(A)将事先配好的培养基按常规方法灭菌后冷却、凝固待用，培养基由基本培养基(MS)附加2％的蔗糖、0.5mg/L的苄基腺嘌呤(6-BA)和0.01mg/L的萘乙酸(NAA)构成；

(B)将接种工具(刀，镊子，无菌盘等)在火焰上烧灼消毒后待冷却使用；

(C)用镊子将块芽夹到无菌盘中，接种到已灭菌的培养基中，打开瓶盖之前和拧紧瓶盖之前都要把瓶口向上稍倾斜对着酒精灯烘一下，时刻保持无菌操作，如此反复操作直至所有材料接种完成，贴上标签，注明种类、接种日期等，放进培养室中培养、观察，20～30天，可长出芽苗；

(4)继代转接：

将事先配好的培养基按常规方法灭菌后冷却、凝固待用，转接培养基由基本培养基附加2～3％的蔗糖、2.0mg/L的苄基腺嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸构成；其他步骤与步骤(3)初次接种的(B)和(C)相同；

(5)大棚假植：在芽苗的增殖继代过程或在继代增殖培养结束时，把高度达4～5厘米的健壮的芽苗从基部切下，并切除基部可能带有的愈伤组织；将芽苗基部切口在50毫克/升的NAA溶液中浸泡1.5小时后，直接扦插入已消毒的细沙中假植，并施以稀释的MS无机盐溶液作养分，2～3周即可见到叶色转绿并有相当数量的新根萌发，待生长稳定，可移栽于大田。

本发明未提及的温度、湿度、光照等条件与现有技术相同。

Claims (2)

1、一种淮山(山药)组织培养方法，包括以下步骤：

(1)外植体——块芽的获取，获取块芽包括以下步骤：

(A)选取健壮、表面无病虫害的块茎，用200倍新洁尔灭或0.1％高锰酸钾消毒，每隔10分钟左右喷洒一次，至少3次，然后用自来水冲洗干净，晾干，再切成每块10～12cm放在通风处让创面收干；

(B)6小时后放在已消毒的湿沙中沙藏催芽，温度保持在20～30℃之间，20天左右可以获得块芽；

(2)块芽的消毒：块芽长出来后，直径大约0.6cm左右，用已消毒刀片切下，并切去根须，先用少量洗洁精液浸泡，再用自来水冲洗干净；进入接种室，将已清洁的块芽放在超净工作台上，用75％酒精消毒10秒，再用无菌水冲洗至少3次，然后用0.1％升汞加几滴湿润剂吐温80，灭菌4～6分钟，分两次进行，每次灭菌后都要用无菌水冲洗至少5次，灭菌完成即可进行外植体接种；

(3)接种：包括以下程序：

(A)将事先配好的培养基按常规方法灭菌后冷却、凝固待用，培养基由基本培养基(MS)附加2～3％的蔗糖、0.5～3.0mg/L的苄基腺嘌呤(6-BA)和0.01～0.1mg/L的萘乙酸(NAA)构成；

(B)将接种工具(刀、镊子、无菌盘等)都在火焰上烧灼消毒后待冷却使用；

(C)用镊子将块芽夹到无菌盘中，接种到已灭菌的培养基中，然后放进培养室中培养，20～30天，可长出芽苗；

(4)大棚假植：在芽的增殖继代过程或在继代增殖培养结束时，把高度达4～5厘米的健壮的芽苗从基部切下，并切除基部可能带有的愈伤组织；将芽苗基部切口在50毫克/升的NAA溶液中浸泡1～2小时后，直接扦插入已消毒的细沙中假植，并施以稀释的MS无机盐溶液作养分，2～3周即可见到叶色转绿并有相当数量的新根萌发，待生长稳定后，移栽于大田。

2、根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征为：所述培养基由基本培养基附加2～3％的蔗糖、2.0mg/L的苄基腺嘌呤和0.1mg/L的萘乙酸构成。