CN107232064A - 促进罗汉果cyp23基因表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种促进罗汉果CYP23基因表达的方法，包括：在组织培养、移植、坐果过程中增加茉莉酸的诱导因子，本发明具有促进罗汉果CYP23基因表达，从而促进罗汉果甜苷V含量的积累的作用。

Description

促进罗汉果CYP23基因表达的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种促进罗汉果CYP23基因表达的方法。

背景技术

罗汉果是我国特有珍贵药用和甜料植物，为葫芦科(Cucurbitaceae)罗汉果属(Siraitia)多年生藤本植物，具有止咳祛痰、凉血舒胃、润肠通便等作用。其主要成分甜苷V是世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300-400倍，是一种低热量、纯天然的甜味剂及理想的保健品，此外还有抗氧化、免疫调节、抗癌、降血糖等作用。

甜苷V目前还不能化学合成，主要依靠提取获得。罗汉果对生境要求苛刻，只适宜在广西生长，且栽培中不能连作，果实中甜苷V含量低，无法满足市场需求，因此亟待探索提高甜苷V含量的新途径、新方法。

罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质，本课题组前期根据罗汉果转录组数据，已推导出甜苷V可能的生物合成途径。罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)，二者是通过甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。来源于上述两途径的IPP或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(FPP)，然后经角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(CS)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在CYP450酶和葡萄糖基转移酶的作用下，形成罗汉果甜苷V。

异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，CYP450酶基因的表达对罗汉果甜苷V的生物合成起着决定性作用。过表达CYP450酶基因，可以促进罗汉果甜苷V的积累；相反，如果抑制CYP450酶基因的表达，罗汉果甜苷V的产量将显著降低。然而，CYP450酶基因是个超基因家族，本课题组前期研究发现，CYP23与罗汉果甜苷V的合成途径有一定关联。现有技术中未见有促进罗汉果CYP23基因表达来提高罗汉果中甜苷V含量的报道。

发明内容

作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在罗汉果种植的育苗阶段和坐果阶段，喷洒含有茉莉酸的溶液可以刺激并诱导罗汉果中CYP23基因的表达，从而促进CYP450酶基因表达，促进罗汉果甜苷V的生物合成和累积。基于这种发现，完成了本发明。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种通过茉莉酸对罗汉果组培、育苗、果实发育进行干涉处理来促进CYP23基因表达基因表达的方法，可以有效促进罗汉果中甜苷V含量积累。

本发明还有一个目的是通过组织培养和人工授粉来促进优良植株的选育和规模化种植，进一步促进罗汉果甜苷V的产量。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进罗汉果CYP23基因表达的方法，包括：将优质罗汉果植株的幼叶进行组织培养，获得罗汉果组培苗，所述组织培养包括愈伤组织诱导增殖培养和不定芽分化、增殖与萌发培养，其中愈伤组织诱导增殖培养在诱导培养基1中完成，不定芽分化、增殖与萌发培养在诱导培养基2中完成，所述诱导培养基1中茉莉酸浓度为50～400μmol/L，所述诱导培养基2中茉莉酸浓度为100～500μmol/L；在所述罗汉果组培苗移栽10～15日后的在根部滴灌诱导液1，每隔5天一次，共进行6次，其中所述诱导液1中茉莉酸为10～20mg/L；植株开花授粉后10天，连续喷洒7天的诱导液2，其中所述诱导液2中茉莉酸为50～100mg/L。

优选的是，其中，所述诱导培养基1中还包括基础培养基1，其配方为MS+1mg/L BA+0.1mg/L 2,4–D+2％蔗糖+0.7％琼脂；所述诱导培养基2中还包括基础培养基2，其配方为MS+0.5mg/L BA+0.1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂。

优选的是，其中，所述诱导培养基1或诱导培养基2的制备方法如下：将茉莉酸配制成10000μmol/L的茉莉酸母液，通过无菌的孔径0.20-0.45μm的硝酸纤维素膜进行过滤杀菌，将杀菌后的母液添加到所述基础培养基1或基础培养基2中，使得茉莉酸达到所需的浓度。

优选的是，其中，所述组织培养包括：将所述幼叶切成直径约1cm的叶圆片，在洗衣粉的水溶液中浸泡数分钟，后用蒸馏水冲洗干净，再在超净工作台土，用70％酒精浸30～40秒取出，随后用HgCl₂水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3～5次；将所述叶圆片接种在诱导培养基1上诱导愈伤组织，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；将所述小块接种在诱导培养基2上进行分化不定芽，继续进行继代增殖。

优选的是，其中，所述组培苗移栽包括：将组培苗用0.1％的高锰酸钾或10～50mg/L的新洁尔灭溶液浸泡灭菌；将灭菌的组培苗移栽到灭菌的介质中，其中所述介质由20～30重量份蛭石、15～20重量份珍珠岩、10～15重量份粘沙、15～20重量份谷壳、10～15重量份锯木屑、以及10～15重量份磨菇渣组成；移栽后在叶面喷洒10毫克/千克的ABT生根粉溶液一次，然后进行遮光5日。

优选的是，其中，所述诱导液1还包括100mg/L甘草次酸，诱导液1滴灌量为每株20g/d。

优选的是，其中，所述诱导液2还包括300mg/L的芦丁素，诱导液2喷洒量为每株500g/d。

优选的是，其中，还包括人工喷雾授粉，其方法为：在授粉日当天，采摘刚刚开放的雄花，将蕊柱连同花粉剪下倒入喷雾液内，充分摇晃，让花粉脱离柱头溶入喷雾液内，最终使得喷雾液呈明显的黄色，过滤，倒入农用喷雾器内，对着雌花柱头进行喷洒，喷洒量为每株开花的雌花植株2～5L喷雾液。

优选的是，其中，所述喷雾液的配方为：0.1～0.3g/L硼酸+0.2％氨基酸水肥+0.02～0.06 2,4–D+0.01～0.03g/L甘草次酸+水。

本发明至少包括以下有益效果：

由于生长过程中加入了茉莉酸的溶液，长期内以刺激并诱导罗汉果中CYP23基因的表达，从而促进CYP450酶基因表达，促进罗汉果甜苷V的生物合成，提高其产量；

由于组织培养开始刺激罗汉果CYP23基因表达的方法，因此植株对于该成分敏感，在授粉挂果后喷洒茉莉酸的溶液，对于促进基因表达的反馈更加敏感，可以增加罗汉果中甜苷V的累积；

由于增加甘草次酸和芦丁素，因此辅助茉莉酸对于CYP23基因表达的协同刺激，从而对罗汉果中甜苷V的累积有促进作用。

由于统一人工授粉，使得果实可以在后期诱导液喷洒时，同时接受刺激，有效的促进CYP23基因的集中表达，从而进一步提高罗汉果甜苷V的含量，并且有利于统一采摘管理等；

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实例1>

配置诱导培养基：根据配方：MS+1mg/L BA+0.1mg/L 2,4–D+2％蔗糖+0.7％琼脂+50μmol/L茉莉酸，配置诱导培养基1；MS+0.5mg/L BA+0.1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂+100μmol/L茉莉酸，配置诱导培养基2；

组织培养：将优质罗汉果植株的幼叶进行组织培养，将所述幼叶切成直径约1cm的叶圆片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分钟，后用蒸馏水冲洗干净，再在超净工作台上，用70％酒精浸30秒取出，随后用HgCl₂水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3次；将所述叶圆片接种在诱导培养基1上诱导愈伤组织，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；将所述小块接种在诱导培养基2上进行分化不定芽，继续进行继代增殖获得组培苗。

移植种植：将组培苗用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡灭菌；将灭菌的组培苗移栽到灭菌的介质中，其中所述介质由20重量份蛭石、15重量份珍珠岩、10重量份粘沙、15重量份谷壳、10重量份锯木屑、以及10重量份磨菇渣组成；移栽后在叶面喷洒10毫克/千克的ABT生根粉溶液一次，然后进行遮光5日，在所述罗汉果组培苗移栽10～15日后的在根部滴灌诱导液1，每隔5天一次，共进行6次，其中所述诱导液1中茉莉酸为10mg/L；

授粉后喷洒：植株开花授粉后10天，连续喷洒7天的诱导液2，其中所述诱导液2中茉莉酸为50mg/L。

<实例2>

配置诱导培养基：根据配方：MS+1mg/L BA+0.1mg/L 2,4–D+2％蔗糖+0.7％琼脂+400μmol/L茉莉酸，配置诱导培养基1；MS+0.5mg/L BA+0.1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂+400μmol/L茉莉酸，配置诱导培养基2；

组织培养：将优质罗汉果植株的幼叶进行组织培养，将所述幼叶切成直径约1cm的叶圆片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分钟，后用蒸馏水冲洗干净，再在超净工作台上，用70％酒精浸30秒取出，随后用HgCl₂水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3次；将所述叶圆片接种在诱导培养基1上诱导愈伤组织，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；将所述小块接种在诱导培养基2上进行分化不定芽，继续进行继代增殖获得组培苗。

移植种植：将组培苗用10mg/L的新洁尔灭溶液浸泡灭菌；将灭菌的组培苗移栽到灭菌的介质中，其中所述介质由20重量份蛭石、15重量份珍珠岩、10重量份粘沙、15重量份谷壳、10重量份锯木屑、以及10重量份磨菇渣组成；移栽后在叶面喷洒10毫克/千克的ABT生根粉溶液一次，然后进行遮光5日，在所述罗汉果组培苗移栽10～15日后的在根部滴灌诱导液1，每隔5天一次，共进行6次，其中所述诱导液1中茉莉酸为20mg/L；

授粉后喷洒：植株开花授粉后10天，连续喷洒7天的诱导液2，其中所述诱导液2中茉莉酸为100mg/L。

<实例3>

配置诱导培养基：根据配方：MS+1mg/L BA+0.1mg/L 2,4–D+2％蔗糖+0.7％琼脂+200μmol/L茉莉酸，配置诱导培养基1；MS+0.5mg/L BA+0.1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂+200μmol/L茉莉酸，配置诱导培养基2；

组织培养：将优质罗汉果植株的幼叶进行组织培养，将所述幼叶切成直径约1cm的叶圆片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3分钟，后用蒸馏水冲洗干净，再在超净工作台上，用70％酒精浸30秒取出，随后用HgCl₂水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3次；将所述叶圆片接种在诱导培养基1上诱导愈伤组织，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；将所述小块接种在诱导培养基2上进行分化不定芽，继续进行继代增殖获得组培苗。

移植种植：将组培苗用0.1％的高锰酸钾溶液浸泡灭菌；将灭菌的组培苗移栽到灭菌的介质中，其中所述介质由20重量份蛭石、15重量份珍珠岩、10重量份粘沙、15重量份谷壳、10重量份锯木屑、以及10重量份磨菇渣组成；移栽后在叶面喷洒10毫克/千克的ABT生根粉溶液一次，然后进行遮光5日，在所述罗汉果组培苗移栽10～15日后的在根部滴灌诱导液1，每隔5天一次，共进行6次，其中所述诱导液1中茉莉酸为15mg/L；

授粉后喷洒：植株开花授粉后10天，连续喷洒7天的诱导液2，其中所述诱导液2中茉莉酸为75mg/L。

<实例4>

在实施例3的基础上，所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，所述诱导液1中还包括100mg/L甘草次酸。

<实例5>

在实施例3的基础上，所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，所述诱导液2中还包括有300mg/L的芦丁素。

<实例6>

在实施例3的基础上，增加人工授粉，在授粉日当天，采摘刚刚开放的雄花，将蕊柱连同花粉剪下倒入喷雾液内，充分摇晃，让花粉脱离柱头溶入喷雾液内，最终使得喷雾液呈明显的黄色，过滤，倒入农用喷雾器内，对着雌花柱头进行喷洒，喷洒量为每株开花的雌花植株2～5L喷雾液，其中，所述喷雾液的配方为：0.1/L硼酸+0.2％氨基酸水肥+0.022,4–D+0.01g/L甘草次酸+水。

为了说明本发明的效果，发明人提供比较实验如下：

<比较例1>

在调配物质诱导培养基时，诱导培养基1中茉莉酸的含量为0、500μmol/L，其余参数与实例2中的完全相同，工艺过程也完全相同。

<比较例2>

在调配物质诱导培养基时，诱导培养基2中茉莉酸的含量为0μmol/L，其余参数与实例2中的完全相同，工艺过程也完全相同。

<比较例3>

在移植种植时，诱导液1的中茉莉酸的含量为0，其余参数与实例2中的完全相同，工艺过程也完全相同。

<比较例4>

在授粉时，诱导液2的中茉莉酸的含量为0，其余参数与实例2中的完全相同，工艺过程也完全相同。

<空白组>

参照实施例1，其中各个步骤中均不添加茉莉酸其余参数与实例1中的完全相同，工艺过程也完全相同。

测量方法：

1、CYP23基因表达量测定方法：利用ABI7500实时荧光定量PCR仪，采用qRT-PCR检测CYP23基因的表达。

步骤一：样品前处理：采集罗汉果果实，挑取果肉，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。

步骤二：先采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA；

步骤三：将RNA反转录为cDNA的反应体系为RNA 10.0μL，PrimeScript RT EnzymeMix I 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 24.0μL，RNase Free dH2O4.0μL；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；

步骤四：采用Primer Premier 5.0软件设计引物，其中，CYP23引物序列为：

FP：GGAGCACGAGGCATTTCTA，

RP：CAACCATAAGCGTCCACCC；

内参基因用UBQ5，

序列为FP：ATAAAAGACCCAGCACCACATTC，

RP：CCCTTGCCGACTACAACATCC；

步骤五、qRT-PCR反应体系(20μL)为SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0μL，PCR Forward Primer(10μM)0.8μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μL，ROXReference Dye of Dye II(50×)0.4μL，Template 2.0μL，dH2O 6.0μL；反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。

2、罗汉果甜苷V含量：采用高效液相色谱法，具体方法参考《广西中医学院学报》第2007年04期上发表的“HPLC测定罗汉果中罗汉果甜苷V的含量”一文。

采集罗汉果果实，烘干备用。将样品经70％甲醇溶液提取溶解，采用C18反相色谱柱分离，用乙腈-0.1％磷酸溶液(22∶78)为流动相进行洗脱，检测波长为203nm，流速为lmL/min，以色谱峰保留时间和紫外可见光谱进行定性，外标法进行定量。

表1不同实施例和对比例方法对罗汉果CYP23基因表达量和甜苷V含量的影响

注：诱导培养基中不同茉莉酸浓度处理的罗汉果果实CYP23基因表达量以未经茉莉酸浓度处理方法得到的罗汉果果实CYP23基因表达量是1为参照；上述实验数据均为上述每一个实施方案得到的20棵罗汉果果树上任选其中5棵中得到的罗汉果果实进行平行试验得到的。

从上表1能够看出，实例中由于在诱导培养基、诱导液中添加了茉莉酸，其CYP23基因表达量和甜苷V含量显著高于未添加的情况。并且实例中茉莉酸成分的比例控制在一定范围之间之间，如果超过，其促进作用不明显。

比较例1与实例2相比，诱导培养基1中未添加茉莉酸，其CYP23基因表达量和甜苷V含量明显下降，但是对比空白依旧有明显的增加。

比较例2与实例2相比，诱导培养基2中未添加茉莉酸，其CYP23基因表达量和甜苷V含量明显下降，但是对比空白依旧有增加，且增加的幅度略大于比较例1。

可见，本发明的在愈伤组织培养阶段进行刺激的效果更加明显；

比较例3与实例2相比，诱导液1中未添加茉莉酸，其CYP23基因表达量和甜苷V含量下降，但是对比空白有明显的增加。

比较例4与实例2相比，诱导液2中未添加茉莉酸，其CYP23基因表达量和甜苷V含量下降，但是对比空白有明显的增加，且增加的幅度略小于比较例1。

可见，本发明的在坐果后对果实的培养阶段进行刺激的效果相较于育苗阶段更加明显；

实施例4与实例3相比，诱导液1中含有甘草次酸，其CYP23基因表达量和甜苷V含量增加。

实施例5与实例3相比，诱导液2中含有芦丁素，其CYP23基因表达量和甜苷V含量增加，且增加的幅度略大于实施例4。

可见，在诱导液中增加甘草次酸和芦丁素可以协同茉莉酸甲酯促进CYP23基因表达量和甜苷V含量增加。

实施例6与实例3相比，进行人工授粉，并且在喷雾液中增加甘草次酸，其CYP23基因表达量和甜苷V含量增加。

可见，在授粉时额外增加甘草次酸可以协同茉莉酸甲酯促进CYP23基因表达量和甜苷V含量增加。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (10)

1.一种促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于包括：

将优质罗汉果植株的幼叶进行组织培养，获得罗汉果组培苗，所述组织培养包括愈伤组织诱导增殖培养和不定芽分化、增殖与萌发培养，其中愈伤组织诱导增殖培养在诱导培养基1中完成，不定芽分化、增殖与萌发培养在诱导培养基2中完成，其中所述诱导培养基1中茉莉酸浓度为50～400μmol/L，所述诱导培养基2中茉莉酸浓度为100～500μmol/L；

在所述罗汉果组培苗移栽10～15日后的在根部滴灌诱导液1，每隔5天一次，共进行6次，其中所述诱导液1中茉莉酸为10～20mg/L；

植株开花授粉后10天，连续喷洒7天的诱导液2，其中所述诱导液2中茉莉酸为50～100mg/L。

2.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述诱导培养基1中还包括基础培养基1，其配方为MS+1mg/L BA+0.1mg/L 2,4–D+2％蔗糖+0.7％琼脂；

所述诱导培养基2中还包括基础培养基2，其配方为MS+0.5mg/L BA+0.1mg/L IBA+2％蔗糖+0.7％琼脂。

3.如权利要求1或2所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述诱导培养基1或诱导培养基2的制备方法如下：将茉莉酸配制成10000μmol/L的茉莉酸母液，通过无菌的孔径0.20-0.45μm的硝酸纤维素膜进行过滤杀菌，将杀菌后的母液添加到所述基础培养基1或基础培养基2中，使得茉莉酸达到所需的浓度。

4.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述组织培养包括：

将所述幼叶切成直径约1cm的叶圆片，在洗衣粉的水溶液中浸泡3～5分钟，后用蒸馏水冲洗干净，再在超净工作台上，用70％酒精浸30～40秒取出，随后用HgCl₂水溶液消毒8分钟，用无菌水冲洗3～5次；

将所述叶圆片接种在诱导培养基1上诱导愈伤组织，愈伤组织继代增殖数次后，取生长旺盛、生活力强的愈伤组织，切成直径lcm的小块；

将所述小块接种在诱导培养基2上进行分化不定芽，继续进行继代增殖。

5.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述组织培养的条件为：25℃恒温，相对湿度70％～80％，采用人工光照，每天12小时光照，12小时黑暗培养，光照强度1000～1500lux。

6.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述组培苗移栽包括：

将组培苗用0.1％的高锰酸钾或10～50mg/L的新洁尔灭溶液浸泡灭菌；

将灭菌的组培苗移栽到灭菌的介质中，其中所述介质由20～30重量份蛭石、15～20重量份珍珠岩、10～15重量份粘沙、15～20重量份谷壳、10～15重量份锯木屑、以及10～15重量份磨菇渣组成；

移栽后在叶面喷洒10毫克/千克的ABT生根粉溶液一次，然后进行遮光5日。

7.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述诱导液1还包括100mg/L甘草次酸，诱导液1滴灌量为每株20g/d。

8.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述诱导液2还包括300mg/L的芦丁素，诱导液2喷洒量为每株500g/d。

9.如权利要求1所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，还包括人工喷雾授粉，其方法为：在授粉日当天，采摘刚刚开放的雄花，将蕊柱连同花粉剪下倒入喷雾液内，充分摇晃，让花粉脱离柱头溶入喷雾液内，最终使得喷雾液呈明显的黄色，过滤，倒入农用喷雾器内，对着雌花柱头进行喷洒，喷洒量为每株开花的雌花植株2～5L喷雾液。

10.如权利要求9所述的促进罗汉果CYP23基因表达的方法，其特征在于，所述喷雾液的配方为：0.1～0.3g/L硼酸+0.2％氨基酸水肥+0.02～0.06 2,4–D+0.01～0.03g/L甘草次酸+水。