CN102191268A - 一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法 - Google Patents

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一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，是将携带表达载体的根癌农杆菌在含卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时后备用；将平邑甜茶组培苗在继代培养基上培养35天，取伸展叶片剪成叶盘，置备用培养物中5分钟，后接种在再生培养基上暗培养1天；将叶盘转接在含头孢霉素的分化培养基上，(25±1)℃下暗培养14天，后置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养30天，将获得的不定芽切下，接种在生根培养基上，置光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度30μmol·m-2·s-1下培养40天生根；42℃下热处理15分钟，进一步鉴定后获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株。

Description

一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法
技术领域
本发明涉及一种产生转基因平邑甜茶植株的方法，特别地，是一种产生无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法。
背景技术
平邑甜茶[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.var.pingyiensis Jiang]是苹果属湖北海棠种的一个变种，是典型的具有兼性无融合生殖性状的植物，也是我国特有苹果砧木资源；其树性乔化，耐荫、抗涝能力强，嫁接苹果的亲和力强，是目前苹果生产中已被广泛应用的砧木之一。由于无融合生殖的特点，使得平邑甜茶的传统育种较为困难，通过转基因技术可以平邑甜茶进行性状改良。而在转基因过程中常常用到选择标记基因，它常与目的基因共转化，在选择压的作用下，非转化细胞被杀死，而转化细胞由于获得标记基因的抗性而成活下来，并进一步增殖分化，形成转基因植株，这对转基因植株的获得至关重要。但转基因植株一旦再生成功，标记基因便不再有用，甚至是有害的。因此培育无标记转基因平邑甜茶，目前已成为平邑甜茶分子育种的重要目标，而国内外还没有平邑甜茶这方面的报道。
发明内容
本发明提供一种产生转基因平邑甜茶植株的方法，特别地，是一种产生无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，其步骤如下：
A.构建植物表达载体p121-Cre-Gus，转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，在28℃下在含100mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时；
B.将平邑甜茶组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0.1cm2的叶盘，放在步骤A得到的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1天；
C.将经过步骤B培养的平邑甜茶叶盘转接在含300mg·L-1头孢霉素的分化培养基上，在温度(25±1)℃下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下再培养30天，获得转化芽；
D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下培养40天，即可完成生根；
E.取步骤D中得到的转化植株的幼叶进行PCR和GUS鉴定获得转基因植株；
F.将步骤D中得到的转基因植株置于42℃下热处理15分钟，再取其幼叶进行进一步PCR鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株。
所述平邑甜茶的组织培养苗可以按照以下步骤得到：初春采平邑甜茶一年生枝条，水培养10天左右，取枝条上饱满的芽，流水冲洗3小时，用0.1％的升汞(HgCl2)处理6分钟，无菌水冲洗6次，用无菌吸水纸吸干残留水分，将芽接种到初代培养基上；在接种后的第二天开始有部分材料开始褐化，一旦发现有褐化的材料，马上更换为新的初代培养基，直到褐化消除；接种10天时，饱满的芽都开始萌发，40天时长成约4cm左右的组培苗。
所述将植物表达载体p121-Cre-Gus转化根癌农杆菌LBA4404可以按照以下步骤操作：
a.分别取5-10μL的载体p121-Cre-Gus和100μL根癌农杆菌感受态LBA4404加在1.5uL的离心管中，混匀，冰上放置30分钟；
b.液氮中速冻2-3分钟，37℃水浴3分钟；
c.再加入800LB液体培养基(不含抗生素)，在28℃条件下，180转培养2-4小时；
d.然后5000转/分离心5分钟，离心管底部留100uL，混匀涂布在含100mg·L-1卡那霉素的LB固体培养基上；
e.挑出长出的单菌落，经PCR鉴定为阳性的根癌农杆菌LBA4404即可转化植物材料。
所述LB液体培养基为10mg·L-1蛋白胨、5mg·L-1酵母提取物、10mg·L-1NaCl，pH7.0的培养基。
所述LB固体培养基为10mg·L-1蛋白胨、5mg·L-1酵母提取物、10mg·L-1NaCl、6.5mg·L-1琼脂粉，pH7.0的培养基。
所述初代培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、1.0mg·L-16-苄基腺嘌呤(6-benzyladenine)和0.2mg·L-1吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)，pH5.6的培养基。
所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、0.3mg·L-16-苄基腺嘌呤和0.1mg·L-1萘乙酸(naphthalene-acetic acid)，pH5.6的培养基；
所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、2.0mg·L-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲和0.2mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；
所述分化培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、300mg·L-1头孢霉素、5mg·L-1卡那霉素、2.0mg·L-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲和0.2mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；
所述生根培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉和0.4mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基。
所述MS基本培养基的配方如下，其中各组分单位为mg·L-1：
Figure BDA0000051429740000031
如上所述的方法中的植物表达载体p121-Cre-Gus，其序列如序列表SEQ ID：No.1所示。
本发明的有益效果在于：
使用本发明的培养方法，可以获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株，转化效率超过1.0％，在当前国内外对此没有相关报道的情况下，对促进平邑甜茶的转基因研究是一个极大的进步。在本发明的实验过程中，同一批次实验采用6个三角瓶，每个皿放置20-25个叶盘，实验重复5次，共计样品总量为668个，获得转基因株系7个，转化效率超过1％。
附图说明
图1为p121-Cre-Gus植物表达载体的图谱。
图2为构建p121-Cre-Gus植物表达载体的第一步的流程图。
图3为构建p121-Cre-Gus植物表达载体的第二步的流程图。
图4为构建p121-Cre-Gus植物表达载体的第三步的流程图。
图5为准备转化的平邑甜茶叶盘的照片。
图6为采用本发明方法获得的平邑甜茶转化芽的照片。
图7为平邑甜茶转基因植株进行GUS鉴定的照片。
图8a及图8b为平邑甜茶转基因植株PCR鉴定的电泳照片，其中图8a示检测gus基因的电泳图，图8b示检测nptII基因的电泳图。
图9为采用本发明方法获得的无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一、无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的获得
按以下步骤操作得到平邑甜茶的组织培养苗(组培苗)：初春采平邑甜茶一年生枝条，水培养10天左右，取枝条上饱满的芽，流水冲洗3小时，用0.1％的升汞(HgCl2)处理6分钟，无菌水冲洗6次，用无菌吸水纸吸干残留水分，将芽接种到初代培养基上。该初代培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、1.0mg·L-16-苄基腺嘌呤和0.2mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基。在接种后的第二天开始有部分材料开始褐化，一旦发现有褐化的材料，马上更换为新的初代培养基，直到褐化消除。接种10天时，饱满的芽都开始萌发，40天时长成约4cm左右的组培苗，以后每月继代一次。
平邑甜茶组培苗的继代培养基为：在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、0.3mg·L-16-苄基腺嘌呤和0.1mg·L-1萘乙酸，pH5.6的培养基。将平邑甜茶的组培苗在该继代培养基上培养生长35天，即可切取叶盘进行转基因的步骤。
构建植物表达载体p121-Cre-Gus，所述载体的图谱如图1所示，其序列如序列表SEQ ID：NO.1所示，其构建步骤为：
第一步，质粒pBI121上的改造：用限制性内切酶HindIII和XbaI分别切去质粒pBI121的35S序列，并切下质粒pMD-35sloxp的35sloxp序列，将二者连接，得到质粒pBI121-35sloxp。用限制性内切酶XbaI和SacI分别切去质粒pBI121-35sloxp的gus序列，并切下质粒T-nos-nptII-nos的nos-nptII-nos序列，将二者连接，得到质粒pBI121-35sloxp-nptII。用限制性内切酶HindIII和BamHI分别切下质粒pBI121-35sloxp-nptII的35Sloxp-nptII，并切去质粒的pBI121的35S序列，将二者连接，得到质粒pBI121-35sloxp-nptII-GUS。
第二步，质粒pMM23上的改造：用限制性内切酶HindIII和XbaI切去质粒pMM23的35S序列，并切下质粒p-hsp的hsp序列，将二者连接，得到质粒pMM23-hsp-cre。用限制性内切酶SacI和SphI切去质粒pMM23-hsp-cre的Tnos序列，并切下质粒pMD-loxpgus的loxpgus序列，将二者连接，得到质粒pMM23-hsp-cre-loxpgus。
第三步，多克隆位点的改造：用限制性内切酶SacI和ApaI双酶切质粒pGEM-T，回收大片段，与人工合成的多克隆位点(MCS)连接，得到改造后的质粒pGEM-T。其中人工合成的MCS的序列如序列表SEQ ID：No.2所示，委托生物公司合成。用限制性内切酶HindIII和SacI分别双酶切改造后的质粒pGEM-T和第二步中得到的质粒pMM23-hsp-cre-loxpgus，各自回收大片段后连接，得到质粒pGEMT-hsp-cre-loxpgus。分别用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切质粒pGEMT-hsp-cre-loxpgus  和第一步中得到的质粒pBI121-35sloxp-nptII-GUS，各自回收大片段后连接，即得到本发明使用的植物表达载体p121-Cre-Gus。
上述三个步骤的具体操作可分别参见图2至图4所示的流程图。
将得到的载体p121-Cre-Gus按以下步骤转化根癌农杆菌LBA4404：
a.分别取5-10μL的载体p121-Cre-Gus和100μL根癌农杆菌感受态LBA4404加在1.5uL的离心管中，混匀，冰上放置30分钟；
b.液氮中速冻2-3分钟，37℃水浴3分钟；
c.再加入800LB液体培养基(不含抗生素)，在28℃条件下，180转培养2-4小时；
d.然后5000转/分离心5分钟，离心管底部留100uL，混匀涂布在含100mg·L-1卡那霉素的LB固体培养基上；
e.挑出长出的单菌落，经PCR鉴定为阳性的根癌农杆菌LBA4404即可转化植物材料。
将转化的根癌农杆菌LBA4404在28℃下在含100mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时，备用。在超净工作台上取组培苗伸展叶片，用剪刀剪成约0.1cm2的叶盘，叶盘照片如图5所示。将叶盘放在上述含有携带载体p121-Cre-Gus的根癌农杆菌的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，在黑暗条件下培养1天；然后转接在含300mg·L-1头孢霉素和5mg·L-1卡那霉素的分化培养基上，在温度(25±1)℃下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下再培养30天，可获得转化芽；转化芽的生长状况照片如图6所示。
二、无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的分子鉴定
(一)GUS染色鉴定
从转化芽和阴性对照的幼叶上剪取1～2cm的叶块，放入装有GUS染色液的离心管中，37℃培养箱中进行GUS组织染色，16h后取出叶片，先以20vt％乙醇清洗样品20min，再用50vt％乙醇清洗30min，最后用70vt％的乙醇脱色，将叶片脱至白色为止。如图7所示的染色鉴定结果，其中1号管为非转基因材料，2-8号管为转基因材料。
所述GUS染色液按如下方法配置：
a.将10mg的X-Gluc溶于1mL的甲醇中，得到10mg/mL的溶液；
b.铁氰化钾1.646g，水定容于100mL，得到50mmol/L的溶液；
c.亚铁氰化钾2.11g，水定容于100mL，得到50mmol/L的溶液；
d.磷酸二氢钠3.12g，水定容于100mL，得到A液；
e.磷酸氢二钠7.17g，水定容于100mL，得到B液；
f.A液38mL+B液62mL配制成磷酸缓冲液。
g.分别取步骤a、b、c、f得到的溶液1mL、0.1mL、0.1mL、7.7mL，及1mL甲醇和0.1mL曲拉通X-100[Triton X-100，成分为聚氧乙烯(8)辛基苯基醚]，混合，即得GUS染色液。
(二)将转基因植株在42℃下热处理15分钟后，对目标基因gus和选择标记基因nptII的PCR鉴定
1、转基因平邑甜茶DNA提取与纯化：
首先取转基因材料100mg(材料获取方法与前述GUS染色鉴定相同)，加液氮研磨后迅速装管，加入65℃预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)裂解液800μL，8μL的β-巯基乙醇，65℃水浴1h，颠倒数次；加入800μL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合溶液，混匀，4℃，10000rpm，离心10min；取上清液，加入800μL体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合溶液，轻轻颠倒混匀，抽提2～3次；取上清液，加入等体积的异戊醇或2倍于上清液体积的无水乙醇(优选地，所用无水乙醇经过-20℃低温处理)，和1/10于上清液体积的3M的NaAC，轻轻混匀，沉淀1h；取出，10000rpm离心10min，倒掉液体，用70vt％的乙醇洗涤2～3次，风干或烘箱中烘干；加入100μL TE缓冲液或ddH2O融解DNA，-20℃储存。所述CTAB裂解液的组成为：100mM的pH8.0的TrisHCl、1.4M的NaCl、20mM的EDTA、20mM的Na2S2O5及2％的CTAB，所述各组分的浓度分别为其在CTAB裂解液中的终浓度。所述TE缓冲液为：含10mM的Tris-HCl及1mM的EDTA、pH8.0的溶液。
2、针对目标基因gus及标记基因nptII分别进行PCR扩增：
模板：GUS鉴定阳性植株DNA、阳性对照(p121-Cre-Gus质粒DNA)及阴性对照(非转基因平邑甜茶材料，材料获取方法与转基因材料相同)。
引物：扩增目标基因gus的上下游引物分别如序列表SEQ ID：No.3及SEQID：No.4所示。扩增选择标记基因nptII的上下游引物分别如序列表SEQ ID：No.5及SEQ ID：No.6所示。
PCR反应体系为：2.0μLPCR缓冲液，2.5μL浓度25mM的MgCl2，1μLdNTPs，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶2单位，模板100ng，水补至20μL。所述PCR缓冲液的组成为：500mM的KCl、100mM、pH9.0的Tris-HCl及1％Triton X-100，所述各组分的浓度分别为其在PCR缓冲液中的终浓度。所述TaqDNA聚合酶的单位定义是1个酶活力单位是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
PCR反应程序：94℃预变性5min，35个扩增循环(每个循环为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s)，72℃延伸10min，15℃保持。扩增产物进行凝胶电泳，并且在紫外灯下成像。PCR电泳图分别如图8a及图8b所示，其中图8a为目标基因gus的PCR鉴定结果，图8b为选择标记基因nptII的鉴定结果。1道为标准分子量(Marker)，2道为阳性对照(质粒DNA)，3道为非转基因材料，4-10为转基因材料(GUS鉴定阳性植株DNA)，其中5道、7道和9道为无选择标记基因的转基因材料。
实验结果：同一批次实验采用6个三角瓶，每个皿放置20-25个叶盘，实验重复5次，共计样品总量为668个，经过分子鉴定，确定获得转基因平邑甜茶7个株系，转化效率大于1％；在转基因株系中共有43％是没有选择标记基因nptII的植株。如图9所示，为获得的无标记基因转基因平邑甜茶植株的照片。
实验的详细统计结果如表1所示：
表1平邑甜茶的转化结果
Figure BDA0000051429740000081
Figure BDA0000051429740000091
Figure IDA0000051429850000011
Figure IDA0000051429850000031
Figure IDA0000051429850000041
Figure IDA0000051429850000051
Figure IDA0000051429850000061
Figure IDA0000051429850000071
Figure IDA0000051429850000081
Figure IDA0000051429850000091
Figure IDA0000051429850000101

Claims (2)

1.一种获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法，其特征在于，步骤如下：
A.构建植物表达载体p121-Cre-Gus，转化根癌农杆菌LBA4404，在28℃下在含100mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时；
B.将平邑甜茶的组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养伸展叶片，剪成面积约0.1cm2的叶盘，放在步骤A得到的培养物中5分钟，然后接种在再生培养基上，黑暗条件培养下1天；
C.将经过步骤B培养的平邑甜茶叶盘转接在含300mg·L-1头孢霉素的分化培养基上，在温度(25±1)℃下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下再培养30天，获得转化芽；
D.将步骤C中获得的转化芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下培养40天，即可完成生根；
E.取步骤D中得到的转基因植株的幼叶进行PCR和GUS鉴定；
F.将步骤D中得到的转基因植株置于42℃下热处理15分钟，再取其幼叶进行进一步PCR鉴定，获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株；
所述植物表达载体p121-Cre-Gus的序列如序列表SEQ ID：No.1所示；
所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、0.3mg·L-16-苄基腺嘌呤和0.1mg·L-1萘乙酸，pH5.6的培养基；
所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、2.0mg·L-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲和0.2mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；
所述分化培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉、300mg·L-1头孢霉素、5mg·L-1卡那霉素、2.0mg·L-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲和0.2mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；
所述生根培养基为在MS基本培养基中附加30mg·L-1蔗糖、6.5mg·L-1琼脂粉和0.4mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基。
2.一种用于获得无选择标记基因转基因平邑甜茶植株的方法中的植物表达载体p121-Cre-Gus，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID：No.1所示。
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