CN104561088A - 一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传方法。本发明包括邳半夏愈伤组织的诱导培养，带有GUS基因的植物高效表达载体转入根癌农杆菌，农杆菌遗传转化愈伤，转化受体材料的继代增殖培养及抗性胚性愈伤组织的筛选，抗性愈伤组织的继代增殖培养，PCR检测和GUS基因的检测等。本方法在邳半夏愈伤组织中表达GUS基因，成功地得到邳半夏愈伤组织遗传转化方法。本发明方法获得的邳半夏转基因愈伤组织可在邳半夏基因工程，细胞工程，代谢工程及邳半夏遗传转化体系的建立中具有广泛应用。

Description

一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得邳半夏转基因愈伤组织的方法。

背景技术

邳半夏（Pinellia Ternata (Thunb.) Breit.）别名三叶半夏,三步跳,老鸹眼等.为天南星科，多年生草本植物，野生于山坡、溪边阴湿的草丛中或林下，叶子有长柄，初夏开黄绿色花。地下有白色小块茎，可入药。主治痰饮呕吐、湿痰咳嗽、消痞散结、眩晕、气逆等症。邳半夏中成分复杂，含有挥发性物质，三萜类化合物、及生物碱等多种活性物质，其中三萜类化合物抗肿瘤等活性已引起人们广泛关注。已有文献报道邳半夏中含有多种三萜类组分，并且这些组分都具有抗肿瘤活性。近代科学研究发现，药用植物中萜类，生物碱等次生代谢产物大部分是天然活性物质，是解决目前世界面临的西药毒副作用大，癌症、艾滋病等疑难疾病无法医治等难题的一条新途径。

然而作为次生代谢产物，其绝对含量又是很低的，这也成为次生代谢产物研究开发的最大障碍。近年来植物基因工程技术的飞速发展和广泛应用，为利用现代生物技术提高次生代谢产物或其前体的含量开辟了一条崭新的途径。利用现代生物技术将次生代谢产物生物合成途径中的关键酶基因（或转录因子）导入相应的宿主中，获得转基因的细胞系、组织或再生植株，并进行大规模的培养，是实现从根本上提高次生代谢产物含量的最佳途径。国内外不少实验室正在进行这方面的研究。诱导培养邳半夏愈伤组织，以根癌农杆菌为介导，获得邳半夏转基因愈伤的方法，将是开展邳半夏代谢工程研究提高邳半夏活性成分含量并实现邳半夏活性成分工厂化生产的有效方法。目前尚未发现获得邳半夏转基因愈伤组织的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种简单、快速、高效地获得邳半夏转基因愈伤组织的方法。

本发明提供的获得邳半夏转基因愈伤组织的方法，包括邳半夏外植体的培养、胚性愈伤组织的诱导和增殖培养、以根癌农杆菌为介导的转化，具有抗性的愈伤组织的筛选和增殖培养及愈伤组织GUS基因的检测等，为邳半夏愈伤组织大规模工厂化生产奠定了坚实的基础。

本发明利用邳半夏叶柄作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有GUS基因的pCAMBIA1301质粒导入邳半夏愈伤组织，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，用组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得邳半夏转基因愈伤组织。

具体步骤为 ：

（1）邳半夏愈伤组织的诱导：选择幼嫩的叶柄为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行培养，在叶柄的切口处逐渐产生白色的愈伤组织，并且叶柄不断膨大。上述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素6-BA和NAA而组成。

（2）邳半夏胚性愈伤组织的诱导培养：将茎诱导出的白色愈伤组织转接如胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织。该胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素2，4-D、6-BA和KT而组成。

（3）遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1301转化根癌农杆菌，以邳半夏胚性愈伤组织为受体进行遗传转化。

（4）抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后，在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基上进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量。

（5）PCR检测和GUS组织化学染色方法检测转基因愈伤：PCR检测pCAMBIA1301质粒上带有的潮霉素磷酸转移酶基因。GUS组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的GUS染色液中，37℃染色过夜，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因基因整合到受体细胞的染色体中并表达。

本发明所述的根癌农杆菌，市场上有公开出售的生物材料，可以从多家公司购得。

与现有技术相比，本发明采用基因工程方法，利用农杆菌介导将pCAMBIA1301质粒导入邳半夏愈伤组织中，获得了转基因邳半夏愈伤组织。这对后期开展邳半夏活性成分合成途径的代谢工程，最终解决邳半夏资源短缺，满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。

该方法在邳半夏生物技术相关领域包括功能蛋白的定位、启动子活性的检测、邳半夏基因工程、细胞工程、代谢工程以及邳半夏遗传转化体系的建立等方面具有广泛的应用价值。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例1

邳半夏胚性愈伤组织的诱导

取邳半夏的幼嫩叶柄，进行消毒，程序如下：先用自来水冲洗2h，无菌水冲洗2次，75%乙醇消毒45s，无菌水冲洗3次，0.1%升汞消毒6min，之后切小，接种于诱导培养基（MS培养基+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.02mg/L+琼脂1.0g/L）中，先黑暗培养7d，再进行光照培养，接种的叶柄7d后伤口边缘开始膨大，14d后诱导出愈伤组织。将愈伤组织继代接种于胚性愈伤诱导培养基上，该胚性愈伤诱导培养基组成为：MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L+琼脂1.0g/L。筛选到长势好而快，没有褐化且呈现黄绿色的胚性愈伤组织。

实施例2

含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1301根癌农杆菌工程菌的获得

将植物表达载体pCAMBIA1301转入根癌农杆菌（如EHA105,为市场有公开出售的生物材料），并进行PCR验证。具体地，首先制备感受态根癌农杆菌（Agl-1）：培养根癌农杆菌至菌液OD₆₀₀=0.5，将菌液冰浴30min后，转移菌液至1.5mL 离心管中，4℃,5000rpm离心5min，去上清；用抽滤灭菌的预冷的0.1M CaCl₂悬浮菌体后于冰上放置30min,然后5000rpm离心5min，去上清，用100μL预冷的0.1M CaCl₂悬浮菌体后于4℃保存备用，此为制备好的农杆菌感受态。取制备好的一管感受态，加入1??L 质粒pCAMBIA1301，轻轻混匀后置冰上5min，然后液氮中放8min，37℃水浴热击5min，然后加入800??L YEB液体培养基，轻轻混匀；28℃,200rpm振荡培养4h后，室温4000rpm，4℃离心10min，去上清，余下200??L 菌液重悬菌体混匀，涂布在含100mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YEB固体培养基上，于28℃倒置培养2d，挑选抗性单菌落在含相应抗生素的YEB液体培养基中培养。菌液达到一定浓度后座潮霉素磷酸转移酶基因的PCR检测。结果表明，植物表达载体pCAMBIA1301已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

实施例3

1.根癌农杆菌介导的转化

1.1 根癌农杆菌的培养

挑取含所述植物表达载体的根癌农杆菌工程菌单菌落于含有100mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床培养过夜，当菌液浓度达到OD₆₀₀=0.5时，5000rpm离心10min，去上清，重悬沉淀在底部的农杆菌，加入100??M乙酰丁香酮，28℃，180摇床培养活化2h后用于转化邳半夏胚性愈伤。

1.2 根癌农杆菌与外植体的共培养

用根癌农杆菌菌液侵染邳半夏胚性愈伤团块，把带有少量农杆菌菌液的愈伤置于共培养基（MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L+琼脂1.0g/L）上，于25℃暗培养2天，使农杆菌充分浸染邳半夏愈伤组织。

1.3 抗性愈伤组织的筛选与继代培养

共培养后，把愈伤组织转接到恢复培养基（MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L+羧苄霉素250mg/L +琼脂1.0g/L）上，进行脱菌培养，于25℃暗培养2个星期后转接到筛选培养基（MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L+羧苄霉素250mg/L +潮霉素50mg/L+琼脂1.0g/L）上进行抗性愈伤组织的筛选培养，将起源于不同细胞的每个愈伤组织作为一个无性系，接种于继代培养基（MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L +潮霉素50mg/L+琼脂1.0g/L）上继代筛选，每2个星期继代培养一次。

2.转基因邳半夏愈伤组织的PCR检测

首先用CTAB方法提取转基因邳半夏潮霉素抗性愈伤组织的总DNA，然后，用PCR方法对转基因邳半夏抗性愈伤组织中的潮霉素磷酸转移酶基因进行检测。PCR反应条件为：95℃变性3min;然后是30个循环的95℃，30sec，59℃，40sec,72℃，1min；最后再72℃延生5min。结果表明，利用所设计的PCR特异引物扩增转基因邳半夏愈伤组织总DNA，能扩增出与预期结果一致的特异目的片段，而以非转化邳半夏基因组总DNA为模板时，没有扩增出任何片段。说明潮霉素磷酸转移酶基因已经整合到邳半夏基因组中。

3.转基因邳半夏愈伤组织的组织化学检测

GUS报告基因的组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的染色液（100mM磷酸缓冲液，5mM高铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，10mM Na₂EDTA，50mg/mL X-Gluc）中，37℃，染色16h，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达。

本实施例利用所构建的含植物表达载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌菌株转化邳半夏愈伤组织，，获得经PCR和组织化学检测的转基因愈伤组织。为后期开展邳半夏代谢工程和大规模工厂化生产邳半夏活性成分并最终解决药物资源匮乏提供了一种有效的解决方法。

Claims (7)

1.一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于利用邳半夏叶柄作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有GUS基因的pCAMBIA1301质粒导入邳半夏愈伤组织，PCR检测外缘潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，用组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得邳半夏的转基因愈伤组织；具体步骤为：

  （1）邳半夏愈伤组织的诱导培养：选择幼嫩的叶柄为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行培养，在叶柄被切开的部位逐渐产生白色的愈伤组织，叶柄不断膨大；上述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素6-BA和NAA而组成；

  （2）邳半夏愈伤组织的诱导培养：将叶柄诱导的白色愈伤转接入胚性愈伤诱导培养基上，获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；该胚性愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础，再添加激素2，4-D、6-BA和KT而组成；

  （3）遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1301转化根癌农杆菌，以邳半夏胚性愈伤组织为受体进行遗传转化；

  （4）抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量；

  （5）PCR检测和GUS组织化学染色方法检测转基因愈伤：PCR法扩增转基因愈伤总DNA获得pCAMBIA1301质粒上带有的潮霉素磷酸转移酶基因；GUS组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的GUS染色液中，37^oC染色过夜，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达。

2.  根据权利要求1所述的一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，步骤（1）所述的红豆衫愈伤组织诱导培养基为：MS培养基+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.02mg/L+琼脂1.0g/L。

3.  根据权利要求1所述的一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，步骤（2）所述的胚性愈伤诱导培养基为：MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L+琼脂1.0g/L。

4.  根据权利要求1所述的一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，步骤（4）所述的恢复培养基的组分为：MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L+羧苄霉素250mg/L +琼脂1.0g/L 。

5.根据权利要求1所述的一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，步骤（4）所述的愈伤组织筛选培养基为：MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L+羧苄霉素250mg/L +潮霉素50mg/L+琼脂1.0g/L 。

6.根据权利要求1所述的一种获得邳半夏转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，步骤（4）所述的继代培养基的组分为MS培养基+6-BA 0.2mg/L + 2,4-D 1.5mg/L+ KT 0.5mg/L +潮霉素50mg/L+琼脂1.0g/L。

7.由权利要求1所述方法获得的邳半夏转基因愈伤组织在邳半夏基因工程，细胞工程、代谢工程以及邳半夏遗传转化体系的建立中的应用。