CN117265000A - 一种提高植物莨菪毛状发根中莨菪生物碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高植物莨菪毛状发根中莨菪生物碱含量的方法，其包括如下步骤：构建载体、获得莨菪无菌组培苗、诱导毛状根、获得浸染后发根、扩大培养。本发明解决了莨菪毛状根大规模培养过程中氧传输是制约毛状根生长和生物碱合成的瓶颈问题。本发明能够大幅提高莨菪发根中有用生物碱的含量，尤其是药用价值和市场价值更大的东莨菪碱的含量。本发明同时还具有操作方法简单，能够产出生物碱含量高的莨菪毛状发根，节约了大量的自然资源，保护了自然环境，且能够满足巨大的市场需求，提供了一条新的途径，具有很好的应用前景。

Description

一种提高植物莨菪毛状发根中莨菪生物碱含量的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种提高植物莨菪毛状发根中莨菪生物碱含量的方法。

背景技术

透明颤菌血红蛋白(Vitreoscillahemoglobin,VHb)的氧合速率常数kon为78/μM^-1·S^-1，说明它对氧的亲和力与一般血红蛋白相差无几。但其极高的氧离速率常数(koff5000/S^-1)却反映了VHb较之其它血红蛋白能更迅速的释放结合的氧。因此，透明颤菌血红蛋白的一个重要功能是通过加速宿主体内的氧传递来促进宿主在缺氧条件下的生长代谢，提高其蛋白质和代谢物的合成。

植物莨菪，别名：天仙子，是茄科、天仙子属植物，通常高15至70厘米，有特殊臭味，全株被粘性腺毛。根粗壮，肉质，茎直立或斜上伸。密被柔毛。单叶互生，叶片长卵形或卵状长圆形，顶端渐尖，基部包茎，茎下部的叶具柄。花淡黄绿色，基部带紫色；花萼筒状钟形；花冠钟形；花药深紫色；子房略呈椭圆形。蒴果包藏于宿存萼内。种子多数，近圆盘形，淡黄棕色；其叶、根、花、种子入药；具有解痉、止痛、安神、杀虫的作用。常生于山坡、路旁、住宅区及河岸沙地，中国长白山区生长于山路旁、杂草地或撂荒地等。天仙子适应性强，当年苗耐寒、喜光、喜肥、喜排水良好的沙壤土。其中，莨菪生物碱是一类具有重要药用价值的植物次生代谢产物，莨菪碱和东莨菪碱是植物莨菪中2个重要的莨菪烷生物碱，莨菪碱和东莨菪碱是一类作用于副交感神经系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛和改善微循环的重要功能。由于两者对中枢神经系统有不同的作用，目前商用市场上东莨菪碱的需求量是莨菪碱的10倍。

作为研究植物次生代谢的模式途径之一，莨菪烷生物碱生物合成途径已经了解得比较清楚了。该途径的最后一步反应莨菪碱经过羟基化转化为东莨菪碱就是一步需氧步骤。但是同时也发现毛状根培养体系放大以后，液体培养基中的贫氧环境则成为制约毛状根生长和生物碱合成的瓶颈。本发明利用VHb能够促进宿主在贫氧环境下氧的传递和利用这一生物学特性，针对莨菪毛状根大规模液体培养过程中出现缺氧的实际问题，开展莨菪生物碱的代谢工程的研究。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种提高植物莨菪毛状发根中莨菪生物碱含量的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种提高植物莨菪毛状发根中莨菪生物碱含量的方法，包括，

构建载体：从酵母和目视植物拟南芥中获得定位序列；构建带有绿色荧光蛋白GFP基因的植物表达载体，在分别转化烟草原生质体、酶切纯化后扩增连接在载体上，转化大肠杆菌；双酶切处理后将定位基因连入含有目的基因的载体上；

获得莨菪无菌组培苗：将莨菪种子洗涤灭菌，洗净后使用次氯酸钠处理，再次洗净，在MS基础培养基上进行孵育进行发芽，在核实的温度光强下继续培养，制得2个月龄的幼苗；

诱导毛状根：将得到的载体转入发根农杆菌，以农杆菌为介导的叶盘法转化莨菪，诱导产生毛状根；

获得浸染后发根：阳性菌落接种于培养基上，振荡培养后离心取得菌体，悬浮培养后稀释，将叶片处理后放入菌液中浸泡，进行浸染，然后叶片置入固体培养基上，暗室培养，然后准入选择培养基上光照培养，待叶盘边缘发根后切下，继续培养，进行继代，获得提高生物碱含量的毛状发根；

扩大培养：将获得发根接种到培养基上进行培养获得大量根系。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述获得浸染后发根，其中，所述稀释为稀释至OD₆₀₀＝0.5。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述构建载体，其中，所述含有目的基因的载体为酶切与连接1304-GFP/VHb质粒分别先后用Bgl II，Spe I限制性内切酶酶切，利用T4连接酶，将VHb基因连入1304-GFP载体，16℃过夜连接，连接产物转化Trans1-T1大肠杆菌，挑取单克隆，进行测序。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述构建载体，其中，所述双酶切处理后将定位基因连入含有目的基因的载体上为使用NcoI和BglII进行双酶切处理。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述获得浸染后发根，其中，所述选择培养基为B5+Kam 100mg/L+Cef500mg/L。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述获得莨菪无菌组培苗，其中，莨菪无菌组培苗过程中pH值调整至5.8，用于发芽；培养室温度维持在25℃，光照强度为350umol.m^-2s^-1，16小时光周期白荧光管提供，空气相对湿度保持在30％。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述获得莨菪无菌组培苗，其中，所述孵育进行发芽为种子使用几层已灭菌湿滤纸之间孵育，并置于MS基础培养基上，其pH值调整至5.8，用于发芽；培养室温度维持在25℃，光照强度为350umol.m^-2s^-1，16小时光周期白荧光管提供，空气相对湿度保持在30％。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述获得浸染后发根，其中，所述浸染后叶片置于固体培养基上为浸染后叶片置于不含激素的MS固体培养基上，28度暗室培养48h。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述扩大培养为将获得发根接种到培养基上进行振荡避光培养。

作为本发明所述方法的一种优选方案，其中：所述扩大培养为将约100mg新鲜的根部接种到含200mL 1/2MS培养基的锥形瓶中，在25℃的轨道振荡器在105rpm转速下进行避光培养，每9天更换一次培养基。

本发明有益效果：

(1)本发明的方法，解决了莨菪毛状根大规模培养过程中氧传输是制约毛状根生长和生物碱合成的瓶颈问题。

(2)本发明经LC-MS测试验证，大幅提高了莨菪发根中有用生物碱的含量，尤其是药用价值和市场价值更大的东莨菪碱的含量。

(3)本发明操作方法简单，能够产出生物碱含量高的莨菪毛状发根，节约了大量的自然资源，保护了自然环境，且能够满足巨大的市场需求，提供了一条新的途径，具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为实施例中制得的含有VHb目的基因以及CoxIV，RecA/AtHRS定位基因的1304-GFP载体图谱；

图2为培养不同阶段的莨菪发根实物图；

图3为WT和转基因发根系的形态和生长速率；

图4莨菪毛状根托品烷类生物碱TAs含量测定。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

本实施例用以制备植物表达载体：

pCAMBIA1304载体:由海军军医大学药学院药用植物学实验室保存。

pCAMBIA1304-myc载体(如图1)已经获得:p1304是目前比较通用的植物表达载体。通过Spe I和Bst EII的双酶切插入一段myc作为分子tag用于后续Western分析。

从酵母和模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中同源克隆得到线粒体定位序列CoxIV,叶绿体定位序列RecA和可以同时定位于线粒体和叶绿体的序列AtHRS；构建带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体CoxIV-GFP,RecA-GFP和AtHRS-GFP分别转化烟草原生质体，通过共聚焦显微镜观察验证亚细胞定位表达的效果后构建“植物亚细胞定位表达外源VHb载体”。

CoxIV(Seq_1)、RecA(Seq_2)、VHb(Seq_3)、AtHRS(Seq_4)的序列如下：

>CoxIV(80bp)

TTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTGTGTAGCTCTAGATATCTGCTTCAGCAAAAA

>RecA(197bp)

ATTCACAGCTAGTCTTGTCTCTGAAGCTGAATCCAAGCTTCACTCCTCTTTCTCCTCTCTTCCCTTTCACTCCATGTTCTTCTTTTTCGCCGTCGCTCCGGTTTTCTTCTTGCTACTCCCGCCGCCTCTATTCTCCGGTTACCGTCTACGCCGCGAAGAAACTCTCCCACAAAATCAGTTCTGAATTCGATGACAGA

>VHb(441bp)

ATGTTAGACCAGCAAACCATTAACATCATCAAAGCCACTGTTCCTGTATTGAAGGAGCATGGCGTTACCATTACCACGACTTTTTATAAAAACTTGTTTGCCAAACACCCTGAAGTACGTCCTTTGTTTGATATGGGTCGCCAAGAATCTTTGGAGCAGCCTAAGGCTTTGGCGATGACGGTATTGGCGGCAGCGCAAAACATTGAAAATTTGCCAGCTATTTTGCCTGCGGTCAAAAAAATTGCAGTCAAACATTGTCAAGCAGGCGTGGCAGCAGCGCATTATCCGATTGTCGGTCAAGAATTGTTGGGTGCGATTAAAGAAGTATTGGGCGATGCCGCAACCGATGACATTTTGGACGCGTGGGGCAAGGCTTATGGCGTGATTGCAGATGTGTTTATTCAAGTGGAAGCAGATTTGTACGCTCAAGCGGTTGAATAA

>AtHRS(221bp)

TCGACCCACGCGTCCCTGACACTTAACATCCTGAAAAAAATCACACAAACAATACAGAATCAGATTCATTTCATCGCATCAAATGTAATACAAATCAGATTTCATAAAAGAAAACAGAAAACAGTACCATGAAGAAGGAGTTGGGAGATTGCACGAGACGCTTGAGCTTATGCTTTCTCTTCTCAAGCTCAGGTGGCGGATGAAGAAGATCGATGTCAATC

构建方法如下：

设计带有双酶切位点引物：

fAtHRS:5'-CACTCCATGG TCGACCCACGCGTCC-3'(NcoI)

rAtHRS:5'-AAAGATCT GATTGACATCGATCTTCTT-3'(BglII)

fCoxIV:5′-AGCACCATGG TTTCACTACGTCAATCTA-3(NcoI)

rCoxIV:5′-AAAGATCT TTTTTGCTGAAGCAG-3'(BglII)

fRecA:5'-AGAACCATGGATTCACAGCTAGTCTT-3'(NcoI)

rRecA:5'-AAAGATCT TCTGTCATCGAATTCAG-3'(BglII)

f-VHb-1304-GFP 5'-AAAGATCTATGTTAGACCAGCAAACCAT-3'(BglII)

r-VHb-1304-GFP 5'-AAACTAGTTTCAACCGCTTGAGCGTACA-3'(SpeI)

其中，带有下划线文字为插入的基因。

常规PCR以获得带有相应酶切位点的VHb目的基因和CoxIV、RecA、AtHRS定位基因序列，扩增的DNA片段连Blunt Zero vector载，转化大肠杆菌Trans1-T1。

PCR方法如下：94℃3min；(94℃45s,58℃1min,72℃30s)25cycles；72℃10min。

VHb基因连入1304-GFP载体:酶切与连接1304-GFP/VHb质粒分别先后用Bgl II，Spe I限制性内切酶酶切，利用T4连接酶，将VHb基因连入1304-GFP载体。16℃过夜连接(大约8～9小时)。连接产物转化Trans1-T1大肠杆菌，挑取单克隆，送基因公司进行测序。

利用NcoI和Bgl II分别双酶切两种质粒，将CoxIV/RecA/AtHRS基因连入含有目的基因vhb的1304-GFP-vhb载体，送基因公司进行测序。

实施例2

(1)原料：

野生型莨菪(Hyoscyamus.Niger L.)种子

1/2MS植物培养基(培养基数量减半)

MS培养基g/L

MS粉4.41g

植物凝胶2.60g

蔗糖30g

pH 5.80

培养基中含有100mg/L潮霉素

B5培养基

(2)莨菪无菌组培苗的获得：野生型莨菪(Hyoscyamus.Niger L.)种子由沈阳药科大学植物园提供。为获得灭菌的幼苗，将莨菪种子在75％乙醇中表面灭菌3分钟，用蒸馏水洗涤五次，然后用含33％活性氯的次氯酸钠溶液处理4分钟。用无菌蒸馏水彻底冲洗五次后，将灭菌后的种子在几层已灭菌湿滤纸之间孵育，并置于MS基础培养基(Sigma，USA)上，其pH值调整至5.8，用于发芽。培养室温度维持在25℃，光照强度为350umol.m-2s-1，16小时光周期白荧光管提供，空气相对湿度保持在30％。如上所述制备莨菪的无菌植物，并且使用2个月龄的幼苗进行农杆菌介导的转化实验。

(3)叶盘法转化莨菪，诱导产生毛状根：将表达载体转入发根农杆菌C58C1，以农杆菌为介导的叶盘法转化莨菪，诱导产生毛状根。

(4)用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落接种于2mlYEB液体(Rif⁺,Str⁺,Kam⁺)于28度，200rpm振荡培养48小时。室温下4,000g离心10min。弃上清，菌体用1/2MS液体培养基(培养基数量减半)悬浮，稀释到原体积的5～20倍，使菌液的OD₆₀₀＝0.5左右。

取生长两周左右的莨菪无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约0.8cm²的小叶盘。将叶盘放入制备好的菌液中，浸泡15min，在无菌吸水纸上吸干菌液。经浸染的叶片放于不含激素的MS固体培养基(可覆盖一层无菌滤纸)上，28度暗室培养48小时。叶片转到选择除菌培养基(B5+Kam100mg/L+Cef500mg/L)上25～28度光照下培养8-18天可以看到叶盘边缘伤口处有发根长出，至发根生长到3cm左右时从叶盘边缘切下，给不同部位长出的发根做好对应的标记，在相同培养基上继续培养，每25～30天继代一次。

(5)毛状发根的液体振荡扩大培养：将约100mg新鲜的根部接种到含200mL 1/2MS培养基的250mL锥形瓶中，在25℃的轨道振荡器(105rpm)避光培养，并每9天更换一次培养基。接种9、18、27、36和45天后，分别记录培养瓶中的根组织的重量。

叶盘法转化莨菪不同阶段得到的图片如图2所示。

将得到的具有WT和不具备相应基因的发根系的形态和生长速率记录如图3所示。

实施例3

(1)原料及仪器：

标准品：莨菪碱、东莨菪碱。

Hyo-莨菪碱，Sco-东莨菪碱。

试剂：甲醇(Merk)、甲酸、醋酸铵、乙腈(Merk)。

仪器及耗材：安捷伦1200液相色谱-G6410A三重四级杆串联质谱联用仪(Agilent，美国)，包含G1311A输液泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，MassHunter软件控制系统及数据处理工作站(Agilent，美国)；labnet定时可调速旋涡混合器(labnet，美国)；超声仪(SK7200H型，上海科导超声仪器有限公司)；Eppendorf移液器(100μL，200μL，1000μL，德国)；容量瓶。

色谱条件：

仪器：安捷伦1200液相色谱串联G6410A三重四级杆质谱联用仪；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(2.1×100mm，3.5μm)，PN861753-902SNUSRY002733；

流动相：乙腈-(0.05％甲酸+5mmol/L醋酸铵)水溶液＝32:68；

柱温：25℃；

流速：0.3mL/min；

进样量：2μL；

单针时间：1.8min；

质谱条件：

Gas Temp 350℃ Gas Flow 10L/min Nebulizer40 psi

Capillary 4000V Sheath Gas Temp 350℃ Sheath Gas Flow 10L/min

(2)样品处理：

称取约50mg莨菪毛状根，用蒸馏水冲洗干净并且用吸水纸吸去多余的水分，50℃烘至恒重的毛状根样品，研磨成干粉，加入2ml甲醇和2ml浓氨水(25％)，超声45分钟；再加入6ml三氯甲烷，充分振荡，25℃室温静置过夜。冻干后，将残余物溶解在2mL甲醇中(如果存在不溶性物质，则再超声处理3分钟)，然后以12000rpm离心5min，吸取上清液20μL用甲醇稀释10倍，在分析前通过0.2-um过滤膜过滤。

(3)样品溶液的配制：

称取约50mg样品用蒸馏水冲洗干净，并用吸水纸吸去多余水分，50℃烘至恒重的毛状根样品，研磨成干粉，加入2ml甲醇和2ml浓氨水，超声45分钟；再加入6ml三氯甲烷，充分振荡，25℃室温放置过夜；冷冻干燥(20℃，2000rmp)残留物溶于2ml甲醇中(有黄色不容物，超声3min)12000rpm离心5min，吸取上清液20μL用甲醇稀释10倍，进LC-MS，验证其确定为目标产物。

(4)标准品溶液的配制：

标准品母液的配制：分别精密称取莨菪碱0.9mg、东莨菪碱0.64mg，放入2ml容量瓶中，用甲醇稀释定容至2ml，作为标准品母液，备用。

混合标准溶液的配制：标准品莨菪碱、东莨菪碱母液用混合溶液(乙腈：水＝32：68)稀释成浓度分别1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL的混合标准溶液。

(5)标准曲线的建立：

取浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL的莨菪碱、浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的东莨菪碱的混合标准溶液依次进样2μL，按照上述测定条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程莨菪碱在1ng/mL～2000ng/mL的范围内，回归方程Y＝813.8904X+2165.3000(r2＝0.9922)；东莨菪碱在1ng/mL～1000ng/mL的范围内，回归方程Y＝714.1221X+517.4311(r2＝0.9892)。

对于峰面积进行测定，得到的峰面积按照标准曲线进行计算，得到的Tas含量如图4所示。

由图4可得，检测结果说明异源表达VHb，为莨菪碱生物合成最后一步反应提供了必要的氧，实现了目标化合物含量的有效积累与显著提高。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种提高植物莨菪毛状发根中莨菪生物碱含量的方法，其特征在于：包括，

构建载体：从酵母和目视植物拟南芥中获得定位序列；构建带有绿色荧光蛋白GFP基因的植物表达载体，在分别转化烟草原生质体、酶切纯化后扩增连接在载体上，转化大肠杆菌；双酶切处理后将定位基因连入含有目的基因的载体上；

获得莨菪无菌组培苗：将莨菪种子洗涤灭菌，洗净后使用次氯酸钠处理，再次洗净，在MS基础培养基上进行孵育进行发芽，在核实的温度光强下继续培养，制得2个月龄的幼苗；

诱导毛状根：将得到的载体转入发根农杆菌，以农杆菌为介导的叶盘法转化莨菪，诱导产生毛状根；

获得浸染后发根：阳性菌落接种于培养基上，振荡培养后离心取得菌体，悬浮培养后稀释，将叶片处理后放入菌液中浸泡，进行浸染，然后叶片置入固体培养基上，暗室培养，然后准入选择培养基上光照培养，待叶盘边缘发根后切下，继续培养，进行继代，获得提高生物碱含量的毛状发根；

扩大培养：将获得发根接种到培养基上进行培养获得大量根系。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得浸染后发根，其中，所述稀释为稀释至OD₆₀₀＝0.5。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述构建载体，其中，所述含有目的基因的载体为酶切与连接1304-GFP/VHb质粒分别先后用Bgl II，Spe I限制性内切酶酶切，利用T4连接酶，将VHb基因连入1304-GFP载体，16℃过夜连接，连接产物转化Trans1-T1大肠杆菌，挑取单克隆，进行测序。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述构建载体，其中，所述双酶切处理后将定位基因连入含有目的基因的载体上为使用NcoI和BglII进行双酶切处理。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得浸染后发根，其中，所述选择培养基为B5+Kam 100mg/L+Cef500mg/L。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得莨菪无菌组培苗，其中，莨菪无菌组培苗过程中pH值调整至5.8，用于发芽；培养室温度维持在25℃，光照强度为350umol.m^-2s^-1，16小时光周期白荧光管提供，空气相对湿度保持在30％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得莨菪无菌组培苗，其中，所述孵育进行发芽为种子使用几层已灭菌湿滤纸之间孵育，并置于MS基础培养基上，其pH值调整至5.8，用于发芽；培养室温度维持在25℃，光照强度为350umol.m^-2s^-1，16小时光周期白荧光管提供，空气相对湿度保持在30％。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得浸染后发根，其中，所述浸染后叶片置于固体培养基上为浸染后叶片置于不含激素的MS固体培养基上，28度暗室培养48h。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述扩大培养为将获得发根接种到培养基上进行振荡避光培养。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述扩大培养为将约100mg新鲜的根部接种到含200mL 1/2MS培养基的锥形瓶中，在25℃的轨道振荡器在105rpm转速下进行避光培养，每9天更换一次培养基。