JP4452483B2 - カンゾウ属植物の組織培養方法 - Google Patents
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Description
(1)カンゾウ属植物の腋芽組織を暗黒下で液体培養する、ストロン様組織の誘導方法。
(2)上記腋芽組織は、カンゾウ属植物の無菌植物の培養系から採取されたものであることを特徴とする(1)記載の誘導方法。
(3)上記カンゾウ属植物はグリチルリーザ・ウラレンシス(Glycyrrhiza uralensis)であることを特徴とする(1)記載の誘導方法。
(4)上記液体培地に0.001〜0.1マイクロモルのオーキシンを含むことを特徴とする(1)記載の誘導方法。
(5)液体培地に1〜10重量%のシュクロースを含むことを特徴とする(1)記載の誘導方法。
(6)(1)乃至(5)いずれか一記載の誘導方法によって得られたストロン様組織を、暗黒下で液体培養する、ストロン様組織の増殖方法。
(7)上記ストロン様組織は腋芽を含むように切断されたものであることを特徴とする(6)記載のストロン様組織の増殖方法。
(8)上記液体培地に0.001〜0.1マイクロモルのオーキシンを含むことを特徴とする(6)記載のストロン様組織の増殖方法。
(9)液体培地に1〜10重量%のシュクロースを含むことを特徴とする(6)記載のストロン様組織の増殖方法。
(10)(6)乃至(9)いずれか一記載の増殖方法によって得られたストロン様組織を明所で培養する、カンゾウ属植物再生方法。
(11)上記ストロン様組織は腋芽を含むように切断されたものであることを特徴とする(10)記載のカンゾウ属植物再生方法。
(12)上記切断したストロン様組織を、植物組織培養用固形培地或いは培養土にて培養することを特徴とする(10)又は(11)記載のカンゾウ属植物再生方法。
(13)(1)乃至(5)いずれか一記載の誘導方法によって得られたストロン様組織に対して外来遺伝子を導入する、カンゾウ属植物の形質転換方法。
(14)上記外来遺伝子はアグロバクテリウム法により導入することを特徴とする(13)記載のカンゾウ属植物の形質転換方法。
1. 植物材料
本発明の対象となる植物は、カンゾウ属(Glycyrrhiza)に含まれる植物(以下、カンゾウ属植物)であれば特に限定されるものではない。カンゾウ属植物としては、例えば、グリチルリーザ・ウラレンシス(Glycyrrhiza uralensis)、グルチルリーザ・グラブラ(G. glabra)、グリチルリーザ・インフラータ(G. inflata)、グリチルリーザ・レピドータ(G. lepidota)、及びこれらカンゾウ属植物の変種等を使用することができる。
カンゾウ属植物のストロン様組織の誘導には、腋芽組織を材料に用いる。腋芽組織は、野外で栽培しているカンゾウ属植物から採取することができる。腋芽組織を用いる場合には、腋芽組織を通常の無菌処理を施した後、後述する項目3の方法によってストロン様組織を誘導することができる。しかしながら、この方法では、カビ、バクテリア、放線菌などのコンタミネーションが多いため、一度、無菌植物の培養系を作り、無菌状態での腋芽組織を材料に用いることが望ましい。
野外から取得したカンゾウ属植物から採取した後に無菌処理した腋芽組織、又は、上記「2.無菌植物の作出方法」のようにして得られた無菌植物の腋芽組織をストロン様組織の誘導に用いる。具体的には、無菌状態にある腋芽組織を暗黒下で液体培養することにより、ストロン様組織を誘導することができる。腋芽組織を、暗黒下で液体培養することにより、通常20〜40日後にストロン様組織を誘導することができる。
上述したように誘導されたストロン様組織は、無菌的に増殖させることができる。すなわち、上述したように誘導したカンゾウ属植物のストロン様組織を、上述したような液体培地において更に培養することによってストロン様組織を増殖することができる。また、上述したように誘導されたストロン様組織を、腋芽を含むように無菌的に切断し、切断して得られた切片を上述したような液体培地において更に培養することによってストロン様組織を増殖することができる。
上述したように増殖したストロン様組織を明所で培養することによって、カンゾウ属植物体に再生することができる。ここで、明所とは、通常、植物が生育しうる明度環境下を意味する。「明所で培養する」とは、一定時間の明度環境下においてストロン様組織を培養する条件であれば良く、例えば、一定時間の明度下と暗黒下とからなるサイクルで培養することも含む。
カンゾウ属植物は、多年生の草本であり、他の一年生草本に比べて生育が非常に遅いことから、有用な植物であるにも拘わらず従来においては種苗を大量に生産することは困難であった。しかしながら、上述した方法によれば、ストロン様組織を短期間で大量に得ることができるため、優良個体の種苗を大量に且つ容易に生産することができる。また、無菌的に継代培養により増殖させているストロン様組織を出発材料とした場合、形質転換カンゾウ属植物を作出することができる。例えば、アグロバクテリウム法(特公平2-58917号公報及び特開昭60-70080号公報参照)、パーティクルガン法(特開平5-508316号公報及び特開昭63-258525号公報参照)等の植物に対する公知の形質転換方法により、カンゾウ属植物由来のストロン様組織に、外来遺伝子を導入することにより形質転換植物を作出することができる。
(1)組換えベクターの調製
アグロバクテリウム法を用いる場合、以下のようにして、トランスジェニック・カンゾウ属植物を作製することができる。
植物導入用組換えベクターは、導入目的の遺伝子に必要に応じて適切なリンカーを連結後、植物細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得ることができる。クローニング用ベクターとしては、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH、pBIG等のバイナリーベクター系のプラスミドやpLGV23Neo、pNCAT、pMON200などの中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。
本発明においては、上述したように誘導或いは増殖されたストロン様組織に対して、アグロバクテリウムを感染させる。次いで、形質転換体を選択するために、適切な抗生物質を加えたMS寒天培地に播種する。この培地で生育したカンゾウ属植物を鉢に移し、生育させることにより、トランスジェニック・カンゾウ属植物を得ることができる。
〔実施例1〕 無菌植物の調製方法
本例ではカンゾウ属植物としてグリチルリザ・ウラレンシス(Glycyrrhiza uralensis)を使用した。先ず、グリチルリザ・ウラレンシスの種子を70%エタノール中に1分、次いで2%次亜塩素酸ナトリウム中に15分間浸漬して殺菌を行い、滅菌水で洗浄した。次に、固形培地に上記殺菌処理した種子を無菌的に置床し、発芽させて無菌的に生育させた。なお、シュクロース30g/リットルを加えたムラシゲ・スクーグ(MS)培地[PHYSIOLOGIA PLANTRUM,第15巻,第473-479頁(1962年)]を水酸化カリウム溶液でpH5.8に調整し、固化剤ゲルライト2g/リットルを添加後、120℃で15分間オートクレーブ滅菌したものを固形培地とした。
本例では、実施例1で作製したクローン無菌植物体を用いてストロン様組織を誘導した。先ず、実施例1で用いたMS固形培地の組成からゲルライトのみを除いた組成の液体培地をプラスチック培養容器(径80mm、高さ102mm)に100ml分注した。この液体培地に実施例1で得られたクローン無菌植物体の腋芽組織を含む茎切片を切り取り置床した。この培養容器を暗黒下、26℃、100rpmで振盪培養した。
その結果、培養4週間後にストロン様組織の誘導が観察された。
実施例2で誘導されたストロン様組織を5cm程度に切り取り、実施例2と同様の培地に置床し、実施例2と同様にして培養した。その結果、培養一週間で、生重2.7gに増殖した。さらに培養を継続し、培養4週間目に、増殖したストロン様組織を5cm程度に分割し、実施例2と同様の培地に置床し、同様の培養条件で培養することにより、ストロン様組織を増殖させた。
本例では、ストロン様組織の誘導における植物ホルモンの影響を検討した。本例では、植物ホルモンとしてジベレリン(GA3)及びオーキシンの一種であるナフタレン酢酸(NAA)につき検討した。先ず、実施例2で用いた液体培地にGA3或いはNAAをそれぞれ0.01〜10マイクロモルの濃度範囲で加え、実施例2と同様にして、クローン無菌植物体から採取した腋芽組織を4週間培養した。結果を図1に示す。
実施例4ではオーキシン(NAA)を添加した培地を使用することによって、ストロン様組織の誘導率及びストロン様組織の長さを向上できることが明らかとなったが、本例では、オーキシンを添加した培地を使用した場合における、ストロン様組織の増殖率への影響を検討した。
本例では、ストロン様組織の増殖におけるシュクロースの影響について検討した。本例では、液体培地に添加するシュクロースを10〜90g/リットルの濃度範囲で加えた以外は実施例3と同様にして、ストロン様組織を4週間培養した。そして培養後、ストロン様組織の重量変化からストロン様組織の増殖率を算出した。その結果を図3に示す。なお図3に示したグラフにおいて横軸は、培地に含まれるシュクロース濃度を重量%で示している。
本例では、実施例3、実施例5及び実施例6で増殖させたストロン様組織を植物体に再生させた。先ず、増殖したストロン様組織を5cm程度に切り取り、実施例1と同様のMS固形培地表面に置床し、実施例1と同様に培養した。その結果、置床したストロン様組織からは約1週間でシュートが形成され始め、約2週間で発根が観察された。最終的に、約4週間で再生植物体を得ることができた。また、ストロン様組織の切片を滅菌培養土内に直接置いても再生植物体を得ることができた。
本例では、カンゾウ属植物の形質転換方法を確立するため、アグロバクテリウム・リゾゲネスを用いる方法を検討した。先ず、GFPマーカー遺伝子を有するバイナリーベクターpTH35(Niwa et al. Plant J. 第18巻、p455-463(1999))をアグロバクテリウム・リゾゲネスATCC15834株(アメリカタイプカルチャーコレクションから購入)に導入した。次に、このアグロバクテリウム・リゾゲネスATCC15834株を100μg/mlのカナマイシンを含むYEB培地で2夜培養した。
本例では、カンゾウ属植物の形質転換方法を確立するため、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる方法を検討した。先ず、実施例8と同様に、GFPマーカー遺伝子を有するバイナリーベクターpTH35(Niwa et al. Plant J.第18巻、p455-463(1999))をアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株に導入した。次に、このアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404株を100μg/mlのカナマイシンを含むYEB培地で2夜培養した。
Claims (14)
- カンゾウ属植物の腋芽組織を暗黒下で、0.001〜0.1マイクロモルのオーキシンを含む液体培地にて培養する、ストロン様組織の誘導方法。
- 上記腋芽組織は、カンゾウ属植物の無菌植物の培養系から採取されたものであることを特徴とする請求項1記載の誘導方法。
- 上記カンゾウ属植物はグリチルリーザ・ウラレンシス(Glycyrrhiza uralensis)であることを特徴とする請求項1記載の誘導方法。
- 上記液体培地に1〜10重量%のシュクロースを含むことを特徴とする請求項1記載の誘導方法。
- 請求項1乃至4いずれか一項記載の誘導方法によって得られたストロン様組織を、暗黒下で液体培養する、ストロン様組織の増殖方法。
- 上記ストロン様組織は腋芽を含むように切断されたものであることを特徴とする請求項5記載のストロン様組織の増殖方法。
- 上記液体培地に0.001〜0.1マイクロモルのオーキシンを含むことを特徴とする請求項5記載のストロン様組織の増殖方法。
- 上記液体培地に1〜10重量%のシュクロースを含むことを特徴とする請求項5記載のストロン様組織の増殖方法。
- 請求項5乃至8いずれか一項記載の増殖方法によって得られたストロン様組織を明所で培養する、カンゾウ属植物再生方法。
- 上記ストロン様組織は腋芽を含むように切断されたものであることを特徴とする請求項9記載のカンゾウ属植物再生方法。
- 上記切断したストロン様組織を、植物組織培養用固形培地或いは培養土にて培養することを特徴とする請求項9又は10記載のカンゾウ属植物再生方法。
- 請求項1乃至4いずれか一項記載の誘導方法によって得られたストロン様組織に対して外来遺伝子を導入する、カンゾウ属植物の形質転換方法。
- 上記外来遺伝子はアグロバクテリウム法により導入することを特徴とする請求項12記載のカンゾウ属植物の形質転換方法。
- 上記アグロバクテリウム法は、バイナリベクターを有するアグロバクテリウム・リゾゲネス或いはアグロバクテリウム・ツメファシエンスであることを特徴とする請求項12記載のカンゾウ属植物の形質転換方法。
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